利用反向遗传学技术构建H5N9重组流感病毒株

目的 利用反向遗传学技术构建来源人感染禽流感病毒H5N1和H7N9 HA和NA基因的H5N9亚型禽流感病毒.方法 全基因合成A/Beijing/01/2003(H5N1)禽流感病毒HA基因片段和A/Zhejiang/DTID-ZJU10/2013(H7N9)禽流感病毒NA基因片段,插入到pHW2000载体,与携带有A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的6个内部基因的pHW2000重组质粒一起转染293T和MDCK混合细胞,拯救H5N9重组病毒.结果 核酸测序、HA和NA基因转录和表达检测、细胞病变分析确定利用该反向遗传学系统可以成功拯救H5N9病毒.重组H5N9病毒在MDCK细胞上复制增殖能力低于相同方法拯救H1N1病毒.结论 利用反向遗传学技术成功构建一株H5N9重组病毒.     

北京市首例人感染H9N2禽流感病例的流行病学调查

目的 分析2016年12月北京市朝阳区确诊的l例人感染H9N2禽流感病例流行病学特征.方法 访谈病例发病前后的相关知情人,调查病例发病经过和可能感染来源.采集病例、密切接触者及环境标本,应用实时荧光定量PCR(real-timePCR)方法,检测甲型流感病毒及H9N2禽流感病毒特异的核酸片段.对病例咽拭子标本和l件阳性环境标本中的H9N2禽流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)基因进行序列测定和分析.结果 病例表现为轻症流感样病例症状,发病前15天曾有活禽市场暴露史.该市场环境标本中H9N2禽流感病毒阳性率为18.2％ (2/11).病例咽拭子标本与市场环境标本中病毒的HA基因高度同源,氨基酸相似度为100％,在进化关系上同属于欧亚系的Y280分支.4名密切接触者在医学观察期内未出现过发热、咳嗽等呼吸道症状.结论 病例感染来源与活禽市场环境暴露有关.加强流感监测以及活禽市场的管理对于防控人感染禽流感疫情具有重要意义.     

应用巢式RT-PCR扩增HA和NA基因片段并测序鉴定甲型H1N1流感病毒

目的 建立一种利用巢式RT-PCR特异扩增HA和NA基因片段并测序鉴定甲型H1N1流感病毒的技术.方法 设计两套共7条特异引物,通过巢式RT-PCR分别扩增甲型H1N1流感病毒HA和NA基因片段并测序,所得序列与人感染甲型流感病毒主要HA和NA亚型序列进行进化树分析以对结果作进一步鉴定,蛋白序列比对后分析其特征.结果 4例甲型H1N1流感患者流感病毒HA和NA基因RT-PCR扩增均分别得到442 bp和543 bp片段产物.核苷酸序列进化分析表明,该4例患者HA和NA序列分别与2009年爆发的甲型H1N1流感病毒HA及NA序列聚集在一起,与季节性H1、H2、H3、人禽流感H5亚型及季节性N1、N2、人禽流感N1亚型特异分开.蛋白序列分析表明,4例患者流感病毒HA蛋白裂解位点附近氨基酸序列均为PSIQSR↓GLF,不具有高致病性流感病毒的特性,NA蛋白第275位氨基酸为His,未出现H275Y的耐药变异.结论 本方法能特异扩增甲型H1N1流感病毒HA和NA基因片段,测序后可用于甲型H1N1流感病毒的进一步鉴定;同时,得到的序列也可用于流感病毒致病力及耐药性的分析.     

H9N2禽流感病毒一步法双重荧光RT-PCR检测方法的建立

目的 建立一种可同时检测禽流感病毒H9N2的HA和NA基因一步法双重荧光RT-PCR方法.方法 针对H9N2禽流感病毒的HA和NA基因保守区,设计相应的特异性引物以及探针,优化检测体系及反应条件,建立一步法双重荧光定量RT-PCR方法.对该方法的灵敏度、特异性、稳定性进行验证与评估,并对家禽粪便标本进行应用检测,以单重实时荧光RT-PCR方法作为参照,检测结果不一致的样本采用测序进行验证.结果 该方法特异性强,与H1、H3、H5、H7亚型禽流感病毒、鸡新城疫及鸡传染性支炎病毒均无交叉反应,对HA和NA基因的最低检出限分别可达50拷贝/μL和25拷贝/μL,组间与组内的变异系数在0.20 ～0.79％之间.对82份粪便标本进行检测,H9N2禽流感病毒的阳性率为8.14％ (7/82),与单重实时荧光RT-PCR法检测结果一致.结论 该方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可应用于临床禽流感样本的检测.     

人感染高致病性禽流感病毒H5N1核酸检测方法的建立及应用

目的 建立人感染高致病性禽流感病毒H5N1的核酸检测方法,用于人感染高致病性禽流感病毒疑似病例临床标本的检测.方法 针对甲型流感病毒保守基因M设计RT-PCR和real-time PCR引物检测是否为甲型流感病毒,同时针对H5N1禽流感病毒设计针对H5和N1基因的特异性RT-PCR和real-time PCR引物作亚型检测,建立禽流感H5N1病毒RT-PCR和real-time PCR检测方法.结果 本研究建立的RT-PCR和real-time PCR方法可以特异性地检测H5N1病毒,并且与人流感病毒H1、H3没有交叉反应.RT-PCR检测方法灵敏度可到1TCID50,real-time PCR灵敏度可达0.01TCID50.利用上述方法检测人感染高致病性禽流感病毒H5N1疑似病例临床标本,从42例不明原因肺炎病例中检测出阳性标本13例.结论 本研究建立的RT-PCR和real-time PCR方法可以用于人感染高致病性禽流感病毒H5N1临床标本的实验室检测.     

北京市1例人感染H9N2禽流感病例的流行病学调查与分析

目的 分析北京市人感染H7N9禽流感疫情强化监测中发现的1例人感染H9N2禽流感病例流行病学调查情况,为今后科学防控人感染H9N2禽流感疫情提供参考.方法 采用现场流行病学和实验室检测相结合的方法,收集病例流行病学资料,采集并检测病例、暴露环境和密切接触者等标本,分析流行病学特征和可能的感染来源.结果 病例发病第3日和第7日咽拭子标本检测均为H9N2禽流感病毒核酸阳性.病例发病前10天内无禽类接触史,但病例平时活动有暴露于H9N2禽流感病毒污染环境的可能.密切接触者在医学观察期内均未出现流感样症状.结论 该病例为北京市首例成人感染H9N2禽流感确诊病例,同时也是北京市第二例H9N2禽流感确诊病例.医疗机构加强流感样病例监测是及时发现人感染H9N2禽流感病例的重要手段.     

流感及H5N1亚型禽流感病毒液相检测芯片的制备

目的 建立利用液相芯片技术检测甲、乙型流感和H5N1亚型高致病性禽流感病毒的方法,并对该方法进行评价。方法 对GenBank中甲型流感病毒的NP、乙型流感病毒的HA以及高致病性禽流感病毒（H5N1）的H5、N1基因片段序列进行同源性比对,根据保守序列,设计针对各基因的简并引物和寡核苷酸探针,制备探针偶联微球,将样本核酸多重PCR扩增产物与微球进行杂交,以Bio-Plex液相芯片检测系统进行芯片检测。结果 该方法可以对甲型流感病毒的NP基因、乙型流感病毒的HA基因以及高致病性禽流感病毒（H5N1）的H5、N1基因同时进行检测,病毒核酸的最低检出量为1pg,检测特异性高。结论 成功构建了甲、乙型流感病毒和H5N1亚型高致病性禽流感病毒液相芯片检测系统,为流感、禽流感的快速检测、诊断奠定了基础。     

北京市2022—2023年甲型H3N2流感病毒流行特征与血凝素基因变异分析

目的掌握2022—2023年北京市流感流行特征及甲型H3N2流感病毒血凝素(hemagglutinin, HA)基因、抗原性变异情况, 为北京市流感防控提供科学依据。方法对北京市2022年第14周至2023年第20周流感病原学监测结果进行统计分析, 并选取不同时间、不同人群来源79株甲型H3N2流感病毒, 通过HA基因扩增测序及抗原性分析实验, 分析其基因变异和进化特征。结果 2022年第14周至2023年第20周, 北京市流感病原学监测流感样病例咽拭子24 244份, 检出流感病毒核酸阳性4 987份, 其中甲型H3N2流感病毒2 749份, 检出阳性率为11.34%。79株毒株中50株(63.29%)为疫苗株的低反应株, 2022年8～11月毒株中94.44%为低反应株, 2023年2～3月毒株中54.10%为低反应株, 两者差异有统计学意义(χ2=8.079, P=0.004)。79株甲型H3N2流感病毒HA基因序列与疫苗株A/Darwin/9/2021相比, 核苷酸相似度为97.47%～98.47%, 氨基酸相似度为97.05%～98.17%。基因进化分析显示2022年8～11...     

中国大陆首例人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)病例的实验室诊断

目的 对2005年10月湖南省湘潭市湘潭县发生的一名不明原因肺炎病例进行实验室检测,以确定导致该病例的主要病因.方法 采集病例呼吸道标本以及血清标本,对呼吸道标本利用分子鉴别诊断技术以及RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测病毒核酸;通过血凝抑制试验以及微量中和试验检测血清中的特异性抗体.结果 该病例所有的呼吸道标本H5N1病毒特异性核酸及病毒分离均为阴性.红细胞凝集抑制及微量中和实验显示,恢复期血清较急性期血清H5N1特异性抗体阳转并且有4倍以上增高.结论 通过实验室检测结果分析,该病例为中国大陆第一例人感染高致病性禽流感病毒（H5N1）实验室确诊病例.     

一起由3C.2a1分支甲型H3N2亚型流感病毒引起的医院暴发疫情分析

目的 通过对某医院一起甲型H3N2亚型流感暴发疫情进行调查和分析,为有效防控医院内发生的流感暴发疫情提供科学依据和经验借鉴.方法 采用现场流行病学调查方法,对某医院流感暴发疫情中病例进行个案调查,采集发热病例咽拭子标本,采用实时荧光PCR方法检测流感病毒核酸,应用MDCK细胞分离流感病毒,并采用全基因组测序方法对分离到的流感病毒进行序列分析.结果 2017年8月1日至7日,某医院呼吸科病区共报告发热病例30例,罹患率为28.58%.现场采集15例发热病例的咽拭子标本,经检测14例(94.3%)病例的标本为甲型H3N2亚型流感病毒核酸阳性;其中3例成功分离到甲型H3N2亚型流感病毒;对分离到的3株毒株进行基因测序分析,HA序列均属于3C.2a1分支,存在N171K、N121K突变.结论 此次疫情为北京市首起由3C.2a1分支甲型H3N2亚型流感病毒引起的医院内流感暴发疫情,提示医院也是流感疫情发生的重点场所.     

2009年泉州市H1N1流感监测及基因特性分析

目的 了解2009年泉州地区H1N1流感监测情况,分析泉州市H1N1流感病毒的HA和NA基因特征,探讨该病毒的遗传变异及分子特性.方法 对泉州市H1N1流感监测期间的病人咽拭子采用real-time RT-PCR方法检测病毒核酸,MDCK细胞培养进行病毒分离、鉴定,并提取其中2株代表性毒株病毒RNA;采用RT-PCR扩增病毒HA和NA基因,纯化产物进行核苷酸序列测定;用DNAStar Megalign软件进行序列分析.结果 1020份咽拭子中有200份为H1N1流感病毒核酸阳性,70份季节性流感病毒核酸阳性,其中53份为H3N2亚型,14份为H1N1亚型,3份为B型,并分离到29株甲型H1N1流感病毒株.HA基因经核苷酸序列测定显示,该毒株与北美流行株高度同源,由HA基因核苷酸序列推导的氨基酸系列与疫苗株A/Brisbane/59/2007相比,有22个位于抗原决定簇的氨基酸位点发生变异,但受体结合特异性仍为人样受体.NA基因耐药性位点分析,显示对达菲药物依然敏感.结论 2009年泉州市H1N1流感流行毒株与北美流行株高度同源,相对于疫苗代表株出现了HA蛋白抗原性的改变.     

病毒载量对SARS-CoV-2测序准确性的影响

目的评估病毒载量对严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)全基因组测序准确性的影响, 为新冠病毒基因监测提供技术支撑。方法提取3例新冠病毒阳性病例的核酸进行4个梯度稀释处理, 同时提取83例新冠病毒阳性病例的核酸进行验证, 通过测序深度、基因组覆盖率和测序深度均一性等指标对测序结果进行评价。结果病毒载量的改变不能影响原始测序数据的质量, 病毒载量对测序数据的准确性具有一定的影响:当Ct值≤32时, 病毒载量变化对测序深度和基因组覆盖率的影响并不显著, 能够达到全基因组测序目的;当Ct达到38时, 覆盖率急剧下降至50%以下, 无法测到病毒的基因组全长。结论通过评估病毒载量对SARS-CoV-2的测序准确性的影响, 我们建议选取Ct值≤32的样本, 产生的测序数据的全基因组覆盖率能够满足后续分析要求。     

湖北省首例人感染H5N6禽流感病例流行病学调查

目的 对湖北省首例人感染H5N6禽流感病例的流行病学资料进行分析,探讨病例发现过程、调查处理措施、实验室检测方法,为防控人感染H5N6禽流感疫情提供依据.方法 采用描述性流行病学方法,分析湖北省首例人感染H5N6禽流感病例诊治过程、密切接触者信息,开展现场流行病学调查,并采集病例、密切接触者、活禽市场外环境标本进行实验室检测分析.结果 患者2016年4月9日发病,体温40℃,有活禽市场暴露史.发病早期采集的下呼吸道标本(痰液、气管分泌液)为H5N6禽流感病毒核酸阳性,而上呼吸道标本H5N6禽流感病毒核酸检测均为阴性.患者无外出史和H5N6禽流感病例接触史.患者经两个月的治疗痊愈出院.密切接触者58人均未出现发热和呼吸道感染症状.采集病例经常路过的两家活禽市场和一家土鸡专卖店外环境标本共36份,其中检出H5N6禽流感病毒核酸1 1份,阳性率为30.56％.结论 该病例为湖北省首例人感染H5N6禽流感病例,属本地感染的散发病例,未出现人传人.传播途径可能为:活禽市场通过禽-环境-人的途径传播.在病例诊断中,下呼吸道标本(尤其是痰液、气管分泌液)具有重要意义.另外,尽早应用奥司他韦对病例的成功救治起到了重要的作用.     

表达H9N2禽流感病毒HA1蛋白的转基因和缓艾美耳球虫的构建

H9N2亚型禽流感病毒已经被证实可以传播到人类,对它存在的潜在危害已受到越来越多的关注。因此,研究安全而有效的H9N2禽流感病毒疫苗已迫在眉睫。为研究和缓艾美耳球虫作为活载体表达及运输禽流感病毒抗原的潜能,本研究构建了可稳定表达H9N2禽流感病毒HA1蛋白的转基因和缓艾美耳球虫。利用黄色荧光蛋白（YFP）及融合的乙胺嘧啶抗性基因（DHFR-TSm2m3）作为报告基因及筛选基因,我们将表达H9N2禽流感病毒HA1抗原的质粒载体核转球虫子孢子,接种鸡后在乙胺嘧啶药物的选择压力下进行筛选并连续传代获得转基因和缓艾美耳球虫系。利用染色体步移和免疫印迹证实了HA1基因的成功插入和表达;利用间接免疫荧光证实HA1蛋白定位于球虫子孢子细胞膜表面和头部。研究进一步发现,转基因球虫的繁殖力与野生球虫相当,感染后亦于第6d达到排卵囊高峰。该转基因和缓艾美耳球虫株具有作为疫苗活载体的潜能。     

禽流感病毒(H5N1)血凝素蛋白真核表达载体的构建与表达

目的:构建禽流感病毒(H5N1)血凝素蛋白HA真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏H5N1流感病毒毒株(A/Jiangsu/07-4(H5N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增HA全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-HA质粒,双酶切pMD18-T-HA与PXJ40-MYC后,构建真核表达载体PXJ40-MYC-HA,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过West-ern blot鉴定HA蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实HA基因的真核表达载体构建成功。Western blot法可见HA基因编码蛋白的成功表达。结论:成功构建了H5N1血凝素真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达HA蛋白的细胞模型和HA蛋白功能研究奠定了基础。     

用MDCK细胞分离出禽H9N2亚型流感病毒

对患儿咽拭子用MDCK细胞病毒分离、患儿及其母亲血清H1测定以确定广州市是否有禽流感(H9N2)感染.咽拭子分离出禽流感H9N2及出现自身H9N2抗体,H1滴度160,母亲H9N2抗体1:20.可确定广州市有H9N2感染,并提示H9N2可通过人传播人而感染.     

猪在禽H9N2亚型流感病毒感染人中的作用

目的　了解猪在禽H9N2亚型流感病毒感染人中的作用。方法　用RT PCR扩增目的基因,用PGEM T Vector(美国Promega公司) 4℃过夜连接,重组质粒转入dH5α细菌,筛选阳性菌落,酶切鉴定,送六合通公司自动测序,然后进行进化树分析。结果　两株山东猪H9N2毒株基因组与人及禽分离出的H9N2病毒均有差异,中国内地从人分离出的H9N2毒株的基因组接近鸡的毒株,而香港特区从人分离出的接近鹌鹑的毒株;禽H9N2毒株不仅宿主范围广,同时其基因组具有多样性。结论　禽H9N2亚型毒株是直接感染人,而不是通过所谓的中间宿主猪,然后再感染人。     

基于鞭毛蛋白的H5亚型禽流感疫苗候选株的构建及鉴定

目的构建基于鞭毛蛋白的H5亚型禽流感疫苗候选株。方法以H5N1禽流感病毒血凝素(HA)基因和鼠伤寒沙门菌SL7202基因组为模板,通过重叠PCR扩增出HA1-2-fljB基因片段,将其插入原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET32a-HA1-2-fljB,再将其转化表达菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达。SDS-PAGE和Western blot法鉴定分析融合蛋白HA1-2-fljB。通过刺激HEK293-TLR5细胞,检测融合蛋白的TLR5生物学活性。结果正确构建出重组质粒pET32aHA1-2-fljB,SDS-PAGE显示,融合蛋白HA1-2-fljB相对分子质量(Mr)约为100 000,Western blot法表明融合蛋白具有良好的免疫反应性。TLR5生物活性实验结果显示,与HA1-2蛋白刺激组相比,HA1-2-fljB诱导HEK293-TLR5细胞分泌了高水平的IL-8(P0.01)。结论成功表达出具有TLR5活性的融合蛋白HA1-2-fljB,为研究H5亚型禽流感新型疫苗奠定了基础。     

用MDCK细胞分离出禽H9N2亚型流感病毒

对患儿咽试子用MDCK细胞病毒分离、患儿及其母亲血清H1测定以确定广州市是否有禽流感（H9N2）感染。咽试子分离出禽流感H9N2及出现自身H9N2抗体，H1滴度160，母亲H9N2抗体1：20。可确定广州市有H9N2感染，并提示H9N2可通过人传播人而感染。