高通量测序技术在确认病原微生物中存在的问题与挑战

通过宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing,m NGS)技术确认病原微生物已成为新发、突发、罕见及常规检测阴性的感染性疾病诊断的重要手段,这项技术提高了临床对感染性疾病的认识,成为精准诊疗的重要驱动力。该文就m NGS在临床应用中的问题展开讨论。     

宏基因组二代测序在涂阴性肺结核中的应用进展

结核病是全球关注的公共卫生问题,全球结核病、耐药结核病以及结核病死亡患者数量都在逐步增长,我国结核病形势也不容乐观。早期准确的病原学诊断是有效治疗的关键,但我国大多数的结核患者病原学检测阴性或缺乏病原学检测结果。对于病原学阴性肺结核,目前常用病原学检测方法尚不能满足临床的诊断需求。宏基因组二代测序（m NGS）的出现颠覆了传统的结核杆菌检测技术以及病原学诊断方法,为涂阴性肺结核的早期诊断、早期治疗提供了可靠参考。本文就现有结核分枝杆菌（MTB）检测方法及国内外开展的m NGS技术的应用作一个综述,重点分析m NGS在涂阴性肺结核诊断中的优势与局限性,为临床有效诊断涂阴性肺结核及合理应用m NGS提供参考。     

二代测序与重症感染的病原学诊断：路漫漫且修远

早期适当的抗生素治疗是降低重症感染患者病死率的关键,而正确鉴别病原微生物则是恰当的抗生素治疗的前提条件。然而,对于病原微生物的检测而言,绝大多数传统微生物学方法具有一定的目标性或指向性。当临床医生怀疑多种病原微生物并存时,可能需要同时进行多种微生物学的检查。近年来,二代测序（NGS）技术被应用于某些特殊病原微生物感染的诊治中。然而,作为一种新的实验室诊断技术,现有证据尚不足以支持NGS在临床上的常规应用。     

肺泡灌洗液二代测序在儿童社区获得性肺炎诊疗中的应用价值

目的 探讨肺泡灌洗液二代测序(NGS)在儿童社区获得性肺炎(CAP)诊疗中的应用价值。方法 选取2021年6月至2022年7月九江市妇幼保健院儿童呼吸科收治的116例CAP并行纤维支气管镜肺泡灌洗的患儿为研究对象,采集患儿肺泡灌洗液行NGS检测,同时完善相关的传统病原微生物检测。比较2种方法检测病原体的阳性率、病原学分布情况及检测结果的一致性。结果 116例患儿经传统病原微生物检测,共检出阳性94例(81.03%),其中细菌感染4例(3.45%)、病毒感染2例(1.72%)、肺炎支原体感染83例(71.55%)、肺炎衣原体感染5例(4.31%),包含混合感染9例(7.76%);对肺泡灌洗液进行NGS检测,共检出阳性111例(95.69%),其中细菌感染62例(53.45%)、病毒感染58例(50.00%)、肺炎支原体感染99例(85.34%)、真菌感染5例(4.31%),包含混合感染63例(54.31%)。肺泡灌洗液NGS对细菌、病毒与肺炎支原体检出率高于传统病原微生物检测,差异有统计学意义(P<0.05);NGS检测与传统病原学检测检出率一致性不佳(Kappa=-0.079,P...     

宏基因组学第二代测序技术与传统实验室微生物培养在支气管扩张病原学诊断中的比较

目的 研究宏基因组学第二代测序技术（mNGS）与传统实验室微生物培养在支气管扩张病原学诊断中的价值,为临床提供参考。方法 选取百色市人民医院2021年9月至2022年10月收治的170例支气管扩张症患者为研究对象进行回顾性分析,根据检测方法不同分为mNGS组（65例）和实验室培养组（105例）。根据患者自我选择用药情况将需调整抗生素使用的43例患者分为mNGS1组（22例）、传统培养组（12例）及经验组（9例）。收集其经纤维支气管镜防污染-肺泡灌洗液的常规微生物检查结果,分离培养检查结果及临床宏基因学组检测结果等临床资料,比较实验室培养与mNGS检测阳性率及不同用药状态下患者转归情况。结果 mNGS检测阳性率高于实验室培养（P<0.05）。mNGS1组患者平均住院时间短于传统培养组、经验组,mNGS1组患者白细胞计数、中性粒细胞计数、C反应蛋白及白细胞介素-6水平低于传统培养组、经验组（P<0.05）。结论 m NGS在支气管扩张病原学诊断中具有一定优势,诊断阳性率更高,对患者经验用药具有一定帮助,能够缩短住院时间,降低炎症因子水平,值得临床应用。     

下一代测序技术在胚胎植入前遗传学检测中的应用

以下一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)为代表的基因组学技术的迅猛发展给全面深度的染色体筛查和基因诊断提供了机会.NGS也迅速应用于胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)和胚胎植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening,PGS)临床检测中,成为常规检测技术,经济与可靠使其具有更广阔的应用前景.单细胞全基因组扩增(whole genome amplification,WGA)技术的进步使得NGS在PGD和PGS的临床应用中能够更加全面了解植入前胚胎的遗传学信息,可以检测到更加细微的差异;基于NGS技术的PGS和PGD将给移植成功率和试管婴儿(in-vitro fertilization,IVF)出生率带来明显提升.本文主要介绍PGD/PGS的定义、传统的PGD/PGS检测技术,单细胞全基因组扩增技术以及NGS在PGD/PGS中的应用.     

二代测序技术在微生物和感染性疾病中的应用

随着感染性疾病防治在卫生保健方面的重要性日益凸显,感染性疾病引起的社会关注逐渐增多,新技术在人类预防和控制病原体传播方面发挥着巨大作用。微生物实验室作为病原体检测的一线科室,通过镜检、培养、鉴定、药敏等方法,在感染控制中发挥着重要作用。传统分子诊断和基因分型方法提供的信息有限,通常不能满足疫情暴发和传播调查需求。二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)在单次序列测定中可确定菌株基因组完整的DNA序列,并从这些数据中得到抗菌药物耐药性、毒力及分型等可用于疫情调查的信息,进一步用于开展疫情特异性筛查。本文概述NGS技术及其在医院感染性疾病暴发调查、未知病原体鉴定、毒力分析、耐药基因组研究等临床微生物领域中的应用。     

下一代测序技术的临床应用规范化问题——参考美国医学遗传学与基因组学会行业标准

下一代测序(next generation sequencing,NGS)技术已经在临床实验室中得到应用.该技术的发展以及检测规模和应用范围的扩大,使基因检测成本大大降低.NGS技术在临床上的应用在不断地扩大,如疾病靶向基因组套检测、个体外显子组或全基因组分析等.同时,NGS技术也进一步改善了治疗决策和对某疾病高危人群的预测.然而,NGS技术的发展也充满了挑战性,包括测序平台和技术更新带来的选择困惑、测序结果的临床验证的不一致性问题等.为了帮助临床实验室更好地了解NGS技术、解决临床验证和正确选择NGS测序平台和方法,以及持续监控NGS并保证高质量的测序结果及其临床解释,本文结合美国医学遗传学和基因组学会(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)关于NGS技术在临床上的应用的专业标准和指南进行归纳和讨论,供我国分子诊断工作者制定国内行业标准时参考.     

高通量测序技术筛检地中海贫血的临床意义

目的:评价高通量测序(NGS)技术在地中海贫血基因筛查中的诊断价值。方法:收集2014年10月-2016年10月在东莞市第三人民医院产科进行孕前或孕期检查的2 858例广东户籍夫妇的外周血,进行血常规检测、血红蛋白电泳分析,传统地中海贫血基因筛查及高通量测序。结果:运用NGS筛选α地中海贫血和β地中海贫血的漏诊率分别为0.87%、1.59%,传统筛查模式筛选α地中海贫血和β地中海贫血的漏诊率分别为26.77%、2.38%;运用NGS筛选α地中海贫血和β地中海贫血ROC曲线下面积分别为0.994和0.991,而传统筛查模式筛选的地中海贫血ROC曲线下面积分别为0.866和0.988;运用NGS进行α和β地中海贫血筛查的灵敏度、漏诊率、约登指数、阴性预测值优于运用传统筛查模式。结论:与传统筛查模式相比,NGS筛查地中海贫血基因的结果精确度高,可避免了常规方法的漏诊,因而诊断价值高,可广泛应用于临床,为地中海贫血的早期诊断提供保障。     

肺癌患者EGFR及KRAS基因突变检测方法的建立和临床应用

目的 本研究拟在评估二代测序(next generation sequencing,NGS)技术在肺癌临床分子诊断中应用的可行性. 方法 本研究选取108例肺癌石蜡包埋样本(formalin fixed paraffin embedded,FFPE),同时进行一代测序(sanger sequencing)和NGS检测样本中EGFR和KRAS基因的突变情况. 结果 在108例肺癌样本中,一代测序检出突变在二代测序中均检出,另外NGS还检测出目标区域外其他突变. 结论 NGS的检测准确性可达到100％.NGS可以应用于肺癌临床分子诊断,同时NGS能给临床提供更详细的基因突变信息,为分子靶向治疗提供依据,更具有市场潜力及应用前景.     

高通量测序在临床分子诊断中的应用与展望

高通量测序又称下一代测序(NGS),是一种新型的遗传学筛查和诊断技术,它的不断革新加速了人们对遗传学标志物及疾病分子机制的认识,特别是针对复杂遗传性疾病。NGS技术的出现促使临床基因诊断逐渐从单基因时代跨越到多基因时代。随着靶向基因组测序、全外显子组测序以及全基因组测序项目在临床中的广泛应用,医务工作者将逐渐改变对复杂遗传性疾病的管理策略,最终将依据遗传学检测结果对每一位患者进行2次分类并给予精准治疗。另外,生物信息学分析方法的不断更新和便捷的数据分析软件包也使NGS在临床诊断中的应用更加广泛。文章中主要论述了现有NGS的主流平台、现阶段NGS在临床分子诊断中的主要应用策略以及应用NGS检测序列变异的数据分析方法。     

高通量测序临床应用中数据质量控制和分析若干问题的探讨

随着国内精准医学计划的开展,高通量测序,即下一代测序(NGS)在临床检测上的应用得到了大力推动。然而,作为临床检测领域的新生事物,目前尚缺乏系统性的法规或指南来规范NGS检测项目的开展。作为肿瘤诊断和治疗试点单位之一,长海医院转化医学中心正在开展遗传性肿瘤筛查和肿瘤个体化用药指导的NGS检测项目。文章将以该中心在NGS检测实践中碰到的问题和积累的经验进行阐述,希望能为相关临床工作的开展提供参考。     

NGS检测乙型肝炎病毒耐药基因突变情况及其临床意义

目的 检测乙型肝炎患者的HBV YMDD突变情况,探究下一代测序技术(next generation sequencing,NGS)检测HBV耐药基因突变的可行性及患者性别与其YMDD突变的相关性,并为临床用药提供参考. 方法 运用NGS测序技术对收集的100例临床样本进行HBV YMDD突变的检测,并与临床检测金标准Sanger测序法的测序结果进行比对. 结果 运用NGS检测100例HBV样本,其中YMDD野生型88例,HBV YMDD耐药基因突变12例,与Sanger测序法的测序结果完全相符.结论 本研究结果显示,NGS技术可用于HBV耐药基因突变检测,患者性别与HBV耐药突变无明显相关性.     

新一代测序技术在肿瘤临床中的应用

随着测序技术的不断发展,成本低、速度快、通量高的新一代测序(NGS)技术在肿瘤临床领域显现出很高的应用价值。本文对NGS在肿瘤临床中的应用和研究进行了综述,主要包括检测胚系突变和单核苷酸多态性用于肿瘤预测预防,检测血浆中循环肿瘤DNA(ctDNA)用于肿瘤的早期诊断,基于NGS的单细胞测序技术检测体细胞突变用于指导个体化、靶向治疗及疗效预测。同时也简要介绍了NGS技术在临床应用中面临的挑战,为其更好地服务于临床提供思路。     

第二代测序技术检测1例假肥大型肌营养不良家系Dystrophin基因突变

目的探讨第二代测序(NGS)技术检测假肥大型肌营养不良患者的可行性。方法用NGS技术检测1例假肥大型肌营养不良(DMD)患者,并用Sanger测序技术对患者基因型进行验证,同时检测家系其他成员基因型。结果 NGS技术结果表明,该患者DMD基因编码区第55号外显子存在1个移码突变c.8087delT(p.Leu2696ArgfsX30),为致病性突变;同时该患者还存在3个错义突变p.Arg2937Gln、p.Arg1745His和p.Asp882Gly,均为已知多态性变异;Sanger测序技术进一步证实了该点突变的存在,同时发现患者母亲为该突变的携带者,患者父亲和妹妹未见该突变。结论 NGS技术可用于DMD基因突变检测,为DMD临床遗传咨询和治疗提供了依据。     

基于分子条形码标记的超深度二代测序技术在儿童急性白血病微小残留病检测中的应用

目的建立分子条形码(UMI)标记的超深度二代测序(NGS)技术检测儿童急性白血病微小残留病(MRD)的方法,并分析该方法的灵敏度和特异度。方法采集35例急性白血病患儿初诊及诱导治疗后骨髓标本,初诊时采用NGS技术行全外显子组检测并寻找肿瘤基因突变作为MRD检测标记,诱导治疗后采用UMI标记的超深度NGS技术检测肿瘤基因突变率作为NGS-MRD指标。流式细胞术(FCM)及RT-PCR技术分别寻找MRD检测标记,诱导治疗后采用FCM及PCR技术检测患儿MRD水平并进行对比验证。结果 NGS技术筛选检测标记的阳性率高于FCM及RT-PCR技术(P0.05),NGS技术检测MRD的灵敏度也高于FCM及RT-PCR技术(P0.05)。FCM及NGS技术检测MRD的平均值无显著差异(P0.05)。结论UMI标记的超深度NGS技术可能成为儿童急性白血病MRD检测的新方法。     

血液宏基因组二代测序检测确诊Q热1例

<正>急性Q热是贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)感染引起的一种人畜共患病,通常是一种自限性发热性疾病^[1],临床表现无特异性,可有发热、头痛、肌肉痛、转氨酶升高、间质性肺炎等症状,发病相对少见。本文报道1例发热待诊患者,血液宏基因组二代测序(m NGS)检测到贝纳柯克斯体,诊断为急性Q热及其治疗过程。1临床资料患者男,59岁,既往体健,因“发热18 d”于2021年3月18日入院。     

基于高通量测序诊断马尔尼菲蓝状菌病1例报道

<正>马尔尼菲蓝状菌（Talaromyces marneffei）又名马尔尼菲青霉菌,是一种双相性深部致病性真菌,最早在竹鼠的病变肝脏中被分离出来,多分布于东南亚、印度东北部和中国南部[1]。马尔尼菲蓝状菌感染好发于免疫功能低下或缺陷人群,主要累及单核巨噬细胞,可侵犯人体多个系统,临床表现复杂多样,病死率高,早期诊断和治疗是降低病死率的关键[2]。目前,马尔尼菲蓝状菌的主要检测方法为血液或组织真菌培养、涂片染色、病理学检查等,由于检出率不一、耗费时间较长等缺点,在一定程度上延误了该病的诊断和治疗[3]。高通量测序[又称下一代测序（next generation sequencing,NGS）]技术可不依赖于培养,直接检测临床样本（血液、脑脊液、肺泡灌洗液、尿液等）中微生物的DNA或RNA,通过分析其特异性基因片段的含量与丰度,通过生物信息学分析全面鉴定细菌、病毒、真菌、寄生虫。相较于传统检测技术,NGS具有通量高、鉴定谱广、检测时间短、敏感性好等优点[4-5]。目前,马尔尼菲蓝状菌引起人类感染的报道较少,此前有个案报道采用NGS诊断马尔尼菲蓝状菌致中枢神经系统感染[6]。现...     

高通量测序技术在慢性肾病患者刚地弓形虫感染诊断中的价值

目的 探讨高通量测序[又称下一代测序(NGS)]技术在临床疑难性病原体诊断中的应用价值.方法 收集1例慢性肾脏病5期合并腹痛患者的2份腹水和4份腹膜透析液样本,取沉渣进行镜检,并进行常规细菌及真菌培养.采用化学发光法检测血清弓形虫抗体;采用NGS技术检测腹水和腹膜透析液样本中病原体的基因.结果 腹水和腹膜透析液样本镜检...