脑膜炎奈瑟菌基因组中可变数目串联重复序列与血清分群之间关系的研究

目的研究脑膜炎奈瑟菌（Neisseria Meningitides,Nm）基因组中串联重复序列（Variable Number of Tandem Repeats Sequences,VNTRs）与血清分群（A和C群）之间的关系。方法采用Nm血清抗体玻片凝集法对Nm菌株进行血清学鉴定;选择4对引物,应用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）扩增Nm基因组中4个位点的VNTR01～04,使用非加权配对算术平均法,应用统计学软件分析VNTRs拷贝（Copy）数与血清群之间的关系;以编码半乳糖转移酶基因中的VNTR01位点之后一段核苷酸序列为特异引物,对Nm进行PCR扩增。结果118株Nm菌株中,38株为A群,80株为C群,聚类分析可将118株菌分为5个组（I、II、III、IV、V）。95.8%（113/118）的菌株位于Ⅰ、Ⅱ组内,Ⅰ组中97.3%（36/37）的菌株为A群,Ⅱ组中98.7%（75/76）的菌株为C群。用两对特异引物对118株菌株进行PCR扩增,以PCR产物有或无做为判断结果,结果与血清分群有96.6%（114/118）的一致性。结论VNTRs拷贝数与血清群之间有较好的相关性,编码半乳糖转移酶基因中变异的核苷酸序列可以做为鉴别A、C群菌株的一种核酸标识。     

结核分枝杆菌可变数目串联重复基因分型

目的运用可变数目串联重复（VNTR）分型方法研究农村结核病研究现场的结核分杆菌分离株的分子特征,分析与VNTR优势基因型相关的因素.方法经PCR扩增各分离株的5种确切串联重复位点（ETR-A～ETR-E）.根据扩增产物大小,确定各串联重复单元的拷贝数,得出每个菌株的VNTR基因型.结果研究现场的101株菌株共分为37个不同的VNTR类型,22名病人分离株为单一基因型,79名病人的菌株分属于15个簇,VNTR42435类型占研究菌株总数的38.6%,但该基因型与卡介苗（BCG）接种耐4种一线药的相关性差异均无统计意学义.结论VNTR分型方法简单快速、分型结果数字化,可以把研究菌株分为不同的群.尚不能认为VNTR 42435的优势来自某些抗痨药和BCG接种.     

福建省结核分枝杆菌多位点可变数目串联重复序列基因分型研究

目的 了解福建省结核分枝杆菌的多位点可变数目串联重复序列基因分型(MLVA)的特征.方法 选择15个可变数目串联重复位点(VNTR),检测福建省30个耐药监测点临床分离的结核菌株,结果使用BioNumerics (Version 4.5)软件进行聚类分析.结果 313株结核菌被分为9个基因群(Ⅰ～Ⅸ),分别包含220、9、48、2、1、3、10、10、10株菌,以Ⅰ群为主(70.3％,220/313);Ⅰ群菌株异烟肼、链霉素、乙胺丁醇和耐多药的耐药率与其他基因群的差异无统计学意义(P＞0.05),但利福平(RFP)耐药率为33.2％(73/220),明显高于其他群菌株RFP的耐药率20.4％(19/93),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 福建省结核分枝杆菌菌株存在明显的基因多态性,以Ⅰ群菌株为主,并与RFP耐药性具有相关性,应加强此类菌株流行的监测.     

45个可变数目串联重复序列位点用于中国结核分枝杆菌基因型鉴定的分辨力评价

目的 评价结核分枝杆菌基因组中串联重复序列(VNTR)位点在中国结核分枝杆菌临床分离株的分型鉴定的分辨力.方法 参考http://minisatellites.u_psud.fr/网站记载的位点选取其中VNTR位点,参照H37Rv结核分枝杆菌标准株全基因序列,利用DNAStar软件设计引物,采用PCR分别对中国结核分枝杆菌临床分离株和H37Rv标准株的VNTR位点进行检测,根据PCR凝胶电泳图片中各菌株相应位点扩增产物的大小,确定重复单元的重复次数.计算Hunter-Gaston指数来分析各位点的分辨能力,及各位点合并分辨力.结果 共检测135株中国结核分枝杆菌临床分离株和H37Rv标准株的45个VNTR位点.结果显示45个VNTR位点对136株菌的分辨力各不相同,Hunter-Gaston指数最大者为0.814(0.797～0.830),最小者为0.015(0.001～0.028),＞0.5的有13个位点.位点的合并分辨力分析显示,随着位点数量增加,分辨力增强,如Qub11-b和Qub18两个位点合并分析,Hunter-Gaston指数为0.936,分组数为44组;Qub11-b、Qub18、Mtub21、Rv2372、MIRU26、Qub26、Qub4156c、Qub11-a和Qub15等9个位点合并分析,Hunter-Gaston指数已经达到1,组数为136组,表示已达到最大分辨力,即株水平分型.结论 不同VNTR位点具有不同的分辨力.其分型分辨力,多位点联合明显好于单位点.Qub11-b等9个位点的合并分型能力较好,这些位点有利于结核分枝杆菌的分型研究.     

多位点可变数目串联重复序列分析对致病性钩端螺旋体分型的研究

钩端螺旋体(钩体)病是一种自然疫源性疾病.近年来以可变数目串联重复序列(variable number of tandemrepeats,VNTR)为基础的分型方法,逐渐被应用于分子流行病学研究中.本研究选取我国致病性钩端螺旋体15群15型参考菌株,初步探讨多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)在钩体病分子流行病学研究中的应用价值.     

62株克罗诺杆菌多位点可变数目串联重复序列分析分子分型研究

目的利用克罗诺杆菌多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)分型方法对国内62株克罗诺杆菌进行MLVA分型研究。方法利用文献报道的4个克罗诺杆菌可变串联重复序列(VNTR)位点,应用PCR、毛细管电泳、基因测序方法,使用BioNumerics软件聚类分析菌株MLVA分型多态性。结果 62株菌分为8个群28个MLVA型别,其中II群的菌株数目占总菌株数目的比例最大(43.5%);菌株流行特征呈同一地区具有多个MLVA型别特点,其中MLVA-5型在多个省份有分布。结论国内克罗诺杆菌存在丰富的基因多态性;需要建立和筛选更适合中国菌株的VNTR位点来进一步优化现行的MLVA策略。     

青海省结核分枝杆菌临床分离株可变数目串联重复序列基因多态性研究

目的 初步了解青海省结核分枝杆菌临床分离株基因多态性和基因分型特征。方法 2009-2012年收集青海省疾病预防控制中心分离的结核分枝杆菌临床分离株,提取DNA,对15个可变数目串联重复序列(VNTR)位点进行PCR扩增和产物电泳分析,使用BioNumerics软件对菌株进行聚类分析。结果 共检测251株结核分枝杆菌临床分离株的15个VNTR位点,显示这些菌株有明显的基因多态性,15个VNTR位点中Hunter-Gaston指数>0.6的VNTR位点有6个,位点分辨能力最高的是MIRU26,经聚类分析,可分为4个基因群,238个基因型。4个基因群分别占4.9%、91.9%、1.6%和1.6%。结论 青海省流行的结核分枝杆菌菌株存在明显的VNTR基因多态性。     

中国C群脑膜炎奈瑟菌脉冲场凝胶电泳分析

目的对中国C群脑膜炎奈瑟菌分离株进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析，了解安徽省C群流行性脑脊髓膜炎（流脑）暴发菌株及国内C群脑膜炎奈瑟菌菌株的分子流行病学特征。方法212株C群脑膜炎奈瑟菌菌株分离自流脑患者、密切接触者和健康人群鼻咽部，包括安徽省C群流脑菌株48株，其中38株与C群流脑暴发相关。脉冲场凝胶电泳选用NheI限制性内切酶，聚类分析选用BioNumerics软件。结果212株C群脑膜炎奈瑟菌菌株共分为43个PFGE带型，命名为AH1～AH43，AH1是中国C群脑膜炎奈瑟菌主要的带型，占69．3％（”=147），分布于11个省市。安徽省48株C群菌株共分为3个PFGE型别（AH1、AH2、AH3），45株（93．8％）为AH1型。安徽省38株与C群流脑暴发相关的菌株中，37株（97．4％）为AH1型。全国53株流脑患者分离菌株中，AH1型菌株占67．9％（36／53）；121株流脑病例密切接触者分离菌株中，AH1型占71．9％（87／121），38株健康人群鼻咽部分离菌株中，AH1型占63．2％（24／38）。结论AH1型C群脑膜炎奈瑟菌是中国目前C群流脑流行的主要克隆群，安徽省C群流脑暴发是由AH1型C群脑膜炎奈瑟菌引起的，已在全国呈扩散流行的趋势。     

多位点可变串联重复序列技术用于西藏地区结核分枝杆菌基因分型的初步研究

目的初步探讨多位点数目可变串联重复序列(MLVA)技术在西藏地区结核分枝杆菌基因分型中的应用和初步了解西藏地区结核分枝杆菌数目可变串联重复序列(VNTR)基因型种类及其分布。方法在拉萨、山南、林芝、日喀则、那曲、昌都6个地区结核病防治中心收集结核分枝杆菌临床分离菌株,设计引物,采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术对结核分枝杆菌20个VNTR位点进行检测,并通过BioNumerics 4.5软件进行DNA指纹图谱多态性分析。结果共收集到217株结核分枝杆菌,分为19个不同的VNTR基因型,其中以Ⅺ型为主要基因型占87.6%(属于北京家族),其次Ⅵ型、ⅩⅤ型、ⅩⅥ型各占1.38%,Ⅰ型、Ⅶ型、ⅩⅢ型各占0.92%,12株结核分枝杆菌为单一的基因型。不同地区之间,以Ⅺ型为主要基因型,分别占各地区的86.8%、91.3%、78.95%、88.2%、95.05、89.3%。结论西藏地区的结核分枝杆菌存在明显的基因多态性,主要流行型为VNTRⅪ型(即北京家族基因型),初步研究结果显示北京家族基因型与卡介苗接种和耐药性无相关性。MLVA分型方法简单、快速,可以有效地用于结核分枝杆菌的基因分型和病原监测。     

利用串联重复序列研究炭疽芽胞杆菌的基因分型

目的 应用基因组中多位点串联重复序列遗传标记对不同地区88株炭疽芽胞杆菌进行基因分型。方法炭疽芽胞杆菌染色体DNA基因组中存在着串联重复序列。在串联重复序列两侧设计引物，PCR扩增，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶影像分析软件对PCR扩增产物碱基含量进行测算，并与测序结果进行比较，计算出串联重复拷贝数，对拷贝数进行聚类分析。结果 （1）聚类分析发现，88株菌株可分为三大群，45个基因型，基因型与生态环境存在一定的关系。就某一地区炭疽暴发而言，其可变数目串联重复序列遗传标记具有相似性。（2）研究发现，A16R疫苗株作为中国的疫苗株具有代表性。结论 炭疽芽胞杆菌基因组中的串联重复序列具有遗传稳定性和特异性，可作为炭疽芽胞杆菌基因分型的指标，在炭疽暴发和生物恐怖事件中的病原体溯源上具有重要的意义。     

15个VNTR位点用于87株丽水市结核分枝杆菌分离株的基因分型研究

目的:选取2008年-2010年间丽水市结核分枝杆菌临床分离株,通过多位点可变数目串联重复序列分型,了解丽水市结核分枝杆菌流行菌株基因分型情况。方法:对临床分离株进行常规培养,收集菌体,提取基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)分别对15个VNTR位点进行检测分析,基因聚类分析采用BioN-umerics软件。结果:经聚类分析,87株结核分枝杆菌分为4个基因群(I群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群)69个基因型。其中Ⅳ群占74.7%,含49个基因型,I群占9.2%,含8个基因型,Ⅱ群占8%,含7个基因型,Ⅲ群占5.75%。含5个基因型。结论:丽水市的结核分枝杆菌存在基因多态性,其主要流行型为Ⅳ型。     

13个VNTR位点用于113株结核分支杆菌的基因分型研究

目的 应用数目可变串联重复序列（VNTR）分子分型技术，对北京地区113株肺结核临床分离菌株进行分型研究，探讨北京地区菌株DNA多态性和基因型特征。方法 采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术对结核分支杆菌13个VNTR位点进行检测，并应用Gel-Pro analyzer 3．1软件和BioNumerics3．0软件进行结果分析。结果 113株结核分支杆菌可分为4个基因型（分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ型），其中Ⅰ型占92．0％（104/113），其他3型所占比例很小，分别为Ⅱ型占4．4％（5／113），Ⅳ和Ⅴ型均为1．8％（2／113），而标准菌株H37Rv在分型中为独立的一个基因型，即Ⅲ型。结论 北京地区的结核分支杆菌存在基因多态性，其主要流行型为Ⅰ型。     

中国7株W135群脑膜炎奈瑟菌基因特征分析

我国流行性脑脊髓膜炎（流脑）的暴发与流行主要由A群和C群引起，W135群脑膜炎奈瑟菌在本世纪初曾引起暴发与流行。目前我国仅从健康人群中分离到W135菌株。我们对健康人群分离的W135群菌株进行多位点序列基因型（MLST）、PorA基因亚型和多位点串联重复序列分析（MLVA）基因特征分析，并与致病性W135群菌株的基因特征进行比较，初步探讨我国W135群菌株是否具有致病性。     

江西省2005-2008年C群脑膜炎奈瑟菌分子分型分析

对2005-2008年江西省流脑暴发、常规监测中分离的79株C群脑膜炎奈瑟菌进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点测序(MLST)分析,描述江西省C群脑膜炎奈瑟菌的菌型分布和变迁,从分子水平了解其流行特征.     

血清杀菌试验和酶联免疫吸附试验测定C群脑膜炎奈瑟菌血清抗体滴度比较

目的 比较血清杀菌试验(SBA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)测定两种C群脑膜炎奈瑟菌(Nm)疫苗免疫后血清抗体滴度的差异.方法 采用SBA测定75名未免疫健康成年人(40～70岁)血清、143名3～8月龄婴儿及194名3～5岁儿童NmA和C群结合疫苗或A+C群多糖疫苗免疫前后血清中Nm杀菌抗体水平,然后用ELISA测定相应血清的Nm特异性IgG含量,并利用线性相关与回归分析两种测定结果的相关性.结果 未免疫健康成年人血清中Nm杀菌抗体水平和特异性IgG含量之间的相关性较高(r=0.814 33,P＜0.001);3～8月龄婴儿和3～5岁儿童接种结合/多糖疫苗前,Nm杀菌抗体水平和特异性IgG含量之间相关性较差(3～8月龄:r=0.140 64,P＞0.l00/r=0.2899,P＜0.05;3 ～5岁:r=0.540 40,P＜0.05/r=0194 36,P＜0.05),接种1剂结合疫苗后,杀菌抗体水平和特异性IgG含量之间的相关性较好(r=0.809 38,P＜0.001和r=0.837 23,P＜0.001);接种多糖疫苗后,杀菌抗体水平和特异性IgG含量之间的相关性较差(r＜0.500 00).结论 健康成年人血清和结合疫苗免疫后的婴幼儿血清中特异性C群Nm IgG含量可以间接反映血清杀菌抗体水平,ELISA方法可以替代SBA.但ELISA检测方法不适用于3～8月龄婴儿多糖疫苗免疫后的效果评价.     

C群脑膜炎奈瑟菌血清杀菌力试验的优化及其应用

目的 优化血清杀菌力试验方法,检测和分析A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗接种前后人群血清对C群脑膜炎奈瑟菌(Nm)的杀菌抗体水平.方法 以C群Nm疫苗株(C11)和中国目前C群Nm流行株(053442)作为靶菌,国家Nm标准品测试血清为参考血清,选用Pel-Freez幼兔补体,确定靶菌最适工作浓度.122人接种A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗前后分别采集血清标本,共244份,进行C群Nm杀菌抗体水平的检测.结果 菌株C11和053442均可作为靶菌用于血清杀菌力试验;靶菌的工作浓度为A 0.35(600 nm)的菌液稀释4×104倍;A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗接种前,122份血清对C11和053442的杀菌抗体几何平均滴度(GMT)分别为1:1.75和1:2.63,人群抗体保护率分别为9.8%和17.2%,A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗接种后,122份血清的杀菌抗体GMT和人群保护率均显著升高(P<0.01),对疫苗株和流行株的杀菌抗体GMT分别为1:483.73和1:412.57,保护率分别为100%和95.9%.结论 接种A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗,能够显著提高人群对不同亚型的C群Nm的抵抗力,但仍需要针对不同的靶菌进行疫苗免疫效果的监测.