超顺磁性氧化铁标记脂肪干细胞移植入大鼠心脏后的活体磁共振示踪成像

目的 探讨超顺磁性氧化铁(SPIO)标记脂肪干细胞(ADSCs)移植入大鼠心脏后的活体磁共振成像(MRI)示踪的可行性.方法 使用左旋多聚赖氨酸-SPIO共培养方式标记ADSCs.采用普鲁士蓝染色及透射电镜观察细胞内铁颗粒,台盼兰染色检测细胞活力,并对标记的干细胞进行体外MRI成像.将经过SPIO标记的干细胞移植入正常大鼠心脏,使用MRI进行活体成像观察并与病理结果进行对照分析.结果 普鲁士蓝染色于ADSCs胞浆内可见蓝色颗粒,电镜检查见铁颗粒位于内涵体/溶酶体内;台盼兰染色检测细胞活力实验组与对照组差异无显著性(P>0.05);标记了SPIO的干细胞体外MRI成像时,实验组信号显著低于阴性对照组和空白对照组;标记后的干细胞移植到心脏后,MRI显示细胞移植区域信号缺失,对应区域病理切片普鲁士蓝染色可见胞浆内染色阳性的细胞.结论 MRI可以对移植入心脏的经SPIO标记的干细胞进行无创、动态的活体示踪成像,有助于了解移植细胞在体内的存活及迁徙情况.     

应用超顺磁性氧化铁纳米粒子标记神经干细胞及活体磁共振示踪的实验研究

目的 探索超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)标记神经干细胞体的方法及其检测手段,研究标记细胞移植后在活体上磁共振信号的改变。方法 分离培养新生鼠皮层神经干细胞,使用SPIO和多聚赖氨酸联合标记神经干细胞;将标记后的神经干细胞移植入Wistar大鼠脑内,应用不同的扫描序列对脑内移植的神经干细胞进行示踪。结果 体外标记的神经干细胞普鲁士蓝染色见细胞浆内有许多蓝染的铁颗粒,电镜检查表明SPIO颗粒存在于标记细胞的吞饮小泡及细胞基质内,标记后的细胞可正常分化。脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变,以GREE序列信号改变最为明显。结论 超顺磁性氧化铁粒子可以用来标记神经干细胞,且对细胞增殖、分化无影响,SPIO颗粒存在于标记细胞的吞饮小泡及细胞基质内。标记后体内移植的神经干细胞可以在MR上产生明显的低信号改变。     

肝/干细胞移植后磁共振示踪研究进展

磁共振显像具有安全性能高、特异性较高、时间和空间分辨率高等优点,且可进行活体无创检查,已经在多个领域的细胞移植示踪中取得了初步成功。磁共振是肝/干细胞移植的最佳示踪工具。MR对比剂能增加磁共振示踪的效果,MR对比剂主要有两类：即超顺磁性对比剂和顺磁性对比剂。SPIO和Gd-BOPTA是这两类的典型代表。SPIO和Gd-BOPTA在肝/干细胞移植中均有应用,从它们的理化特性、标记方法、安全性、磁化特性和成像序列等方面进行比较,各具优点及缺点。     

超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓间充质干细胞的磁共振成像研究

目的:探讨超顺磁性氧化铁纳米粒子(Superparamagnetic iron oxide,SPIO)体外标记大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的适当浓度和不同标记浓度对细胞的生物学活性影响,以及经MR成像的特征等.方法:选取第5代细胞进行不同浓度SPIO标记,运用光学显微镜观察铁颗粒在细胞内的位置、分布及标记率;选取适当浓度标记量,使用1.5T磁共振进行T1wI、T2WI、T2*WI扫描,测量不同扫描序列标记细胞管的信号强度改变,并进行统计学分析.结果:标记后的铁颗粒均位于细胞质内;含量在25～50μg Fe/ml的培养液是SPIO标记干细胞的安全浓度,在此浓度阈值标记后孵育24 h即可有效标记细胞97%～100%;SPIO标记的MSCs在T1WI,T2WI及T2*WI序列信号均降低.结论:SPIO可以简便标记MSCs.并且在适当浓度下对MSCs的生物学活性没有影响,MR T2WI和T2*WI序列可有效显像磁性标记的干细胞,为下一步活体试验奠定基础.     

氧化铁颗粒标志干细胞磁共振成像示踪的研究进展

氧化铁颗粒标志干细胞是决定磁共振(MRI)能否成功观察干细胞活动的关键,主要的标志方法包括利用各种安全手段使干细胞更多摄取外源性氧化铁颗粒和利用转基因方法使干细胞内产生内源性氧化铁颗粒。然而,即使成功标志干细胞,实际工作中干细胞的MRI示踪成像仍面临干细胞分裂导致标志浓度下降、标志物向宿主细胞转移、干细胞如何定量分析、MRI各种参数如何平衡、如何从复杂的本底信号探明少量干细胞等诸多挑战,需进一步研究探索。     

大鼠骨髓源神经干细胞的Sinerem体外标记及磁共振成像研究

目的 应用超小超顺磁性氧化铁(USPIO)Sinerem和转染试剂多聚赖氨酸(PLL)复合物标记大鼠骨髓源神经干细胞,初步评价磁共振成像活体示踪Sinerem标记干细胞的可行性.方法 分离SD大鼠骨髓基质干细胞,体外培养诱导成骨髓源神经干细胞.将制备的Sinerem-PLL复合物以浓度Sinerem 200μg/ml和干细胞共孵育培养过夜.采用普鲁士蓝染色和透射电镜确定细胞内铁的摄取、定位情况;并对细胞增殖、凋亡检测评价.体内外以SE序列T2WI与T2*WI行4.7T磁共振干细胞成像.结果 该方法标记干细胞效率为95%以上,普鲁士蓝染色显示铁颗粒存在胞质中,电镜显示铁颗粒集中于内涵体和溶酶体中;该浓度时Sinerem对细胞的活性影响与未标记细胞相比差异无统计学意义(P＞0.05).标记后细胞体内外的T2WI与T2*WI信号强度明显降低.结论 利用Sinerem对比剂经PLL介导标记骨髓源神经干细胞高效易行,磁共振可用于活体示踪神经干细胞.     

SPIO、Gadolinium chelates标记干细胞移植活体磁共振示踪在CNS中的研究进展

随着干细胞移植技术的迅速发展,人们迫切需要一种能在体外无创性检测移植干细胞在体内的生物学行为、评估干细胞的移植效果、提供移植疗法的最优化信息的活体示踪方法。磁共振因为具有较高的时间、空间分辨率、良好的组织结构对比、无放射线损伤等优势,无疑成为干细胞活体示踪较为理想的工具,为干细胞移植治疗的临床研究提供有力的影像学帮助。干细胞磁共振活体示踪目前主要处于动物试验阶段,研究领域较为广泛,本文主要针对超顺磁性氧化铁颗粒、钆螯合物标记干细胞移植活体磁共振示踪在CNS中的研究进行综述。     

PEI2k-SPIO纳米颗粒标记大鼠骨髓间充质干细胞的体外磁共振成像

目的明确经修饰的多聚乙烯-超顺磁性氧化铁(PEI2k-SPIO)纳米颗粒体外标记大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的最佳浓度,以及标记后BMSCs的磁共振成像(MRI)特征、可成像的最低标记细胞量和最佳成像细胞量。方法取第二代大鼠BMSCs接种于投放有盖玻片的6孔板内,分别加入浓度为5μg/mL、7μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL铁浓度的PEI2k-SPIO液,而后行普鲁士兰染色,观察不同标记浓度对细胞生物学活性的影响;采用四唑盐(MTT)比色法,分析不同浓度的PEI2k-SPIO液对大鼠BMSCs生长活性的影响,并确定PEI2k-SPIO纳米复合颗粒标记干细胞的最佳阈值;取最佳阈值的PEI2k-SPIO标记BMCSs,经磁共振成像,确定成像所需最低细胞量及最佳成像细胞量。结果 PEI2k-SPIO标记BMSCs的最佳浓度是7μg/mL,该标记浓度下细胞生物活性不受影响;在7μg/mL PEI2k-SPIO培养液标记浓度下,MRI的最低细胞量为1×104,最佳成像细胞量为1×106。结论适当浓度的PEI2k-SPIO标记BMSCs对其生物学活性没有影响,MRI可敏感显像PEI2k-SPIO标记的BMSCs。     

SPIO标记骨髓间充质干细胞移植入心肌梗死大鼠的示踪研究

目的探讨超顺磁性氧化铁微粒(SPIO)体外标记骨髓间充质干细胞(BMSCs)及体内示踪移植入大鼠心肌梗死心脏的BMSCs的能力。方法使用左旋多聚赖氨酸-SPIO共培养方式标记BMSCs。采用普鲁士蓝染色观察细胞内铁颗粒,流式细胞术检测细胞活力,将经过SPIO标记的干细胞移植入心肌梗死大鼠心脏,应用1.5TMRI系统行磁标记干细胞成像。超声心动图检测各组心脏的左室射血分数(EF),左室舒张末期内径(LVIDd),左室收缩末期内径(LVIDs)及短轴缩短率(FS)。结果普鲁士蓝染色显示,SPIO标记的BMSCs细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒,标记效率为(99.81±1.57)%;与正常未标记细胞相比较,细胞的活力差异无统计学意义(P0.05)。标记了SPIO的BMSCs体内MRI成像时显示,细胞移植区域信号缺失,对应区域病理切片普鲁士蓝染色可见胞浆内染色阳性的细胞。超声心动图显示,PBS组FS移植前后没有明显变化,BMSC组FS从移植前的(23.1±1.88)%上升到第1周的(31.28±4.15)%。BMSC组EF在移植前是(51.13±5.07)%,第1周时上升到(60.12±8.40)%。结论 SPIO能成功地标记BMSCs,且对BMSCs的活力无明显影响。BMSCs移植后能改善心梗大鼠的心功能。SPIO标记的BMSCs移植后在大鼠体内的分布、迁移过程可用MRI进行检测评价。     

应用超顺磁性氧化铁粒子标记组织工程关节软骨种子细胞及在体磁共振示踪的研究

目的探讨应用1．5T MRI活体示踪注入兔膝股骨髁软骨缺损关节腔内的超顺磁性氧化铁粒子（SPIO）标记的骨髓间充质干细胞（MSCs）的可行性。方法从兔骨髓中分离培养MSCs,经体外采用SPIO和BrdU双重标记后,与壳聚糖支架复合,然后注射到兔膝股骨髁自体软骨缺损关节腔中,术后1d及4、8、12周应用MR对膝关节腔内注入的磁标记MSCs进行扫描示踪,并与组织切片普鲁士染色及免疫组化BrdU对照。结果体外标记的MSCs普鲁士染色和电镜检查显示细胞胞质内含致密铁颗粒,标记细胞可正常成软骨分化。复合物注射后MRI GRET2^＊ WI序列检查显示关节腔内磁标记MSCs产生颗粒状低信号改变至少12周,不同时相信号改变在空间上呈不一致性。MRI信号改变区域与组织学检查结果基本一致。结论兔MSCs经SPIO标记后仍然具有成软骨细胞分化能力,利用1．5TMRI活体示踪注入自体软骨缺损膝关节腔内的兔磁标记MSCs分布和迁移是可行的。     

体外纳米磁标记骨髓间充质干细胞生物学特性及其MR成像

目的 研究超顺磁性氧化铁粒子(superparamagnetic iron oxide particles,SPIO)体外标记兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)及MR细胞成像示踪可行性.方法 从兔骨髓中分离培养MSCs,体外不同浓度SPIO联合硫酸鱼精蛋白标记,未标记细胞设为对照组.普鲁士蓝染色和电镜检查鉴定细胞内铁颗粒,台盼蓝染色检测细胞存活,MTF法测定细胞生长曲线的变化,磁标记MSCs转入成骨、成脂肪培养基中进行诱导培养后进行鉴定,应用1.5T MR梯度回波T2加权(GRE T2 *WI)扫描序列和自旋回波T2加权(SE T2WI)扫描序列对磁标记细胞成像示踪.结果 普鲁士蓝染色和电镜检查显示细胞质内含致密铁颗粒,磁标记对MSCs活性和增殖无统计学差异(P<0.05),标记细胞可正常成骨、成脂肪分化.GRE T2*WI序列和SE T2WI序列提示与未标记细胞信号强度(sI)相比,1×106(标记细胞)、5×105(标记细胞)SI均显著性下降(P<0.05),其中GRE T2*WI的信号强度衰减率(△SI)显著高于T2WI序列(P<0.05).在2个序列中1×106(标记细胞)△SI均高于5×105(标记细胞)△SI,但不具有显著性差异(P>0.05).结论 SPIO联合硫酸鱼精蛋白转染剂能成功标记MSCs,磁标记对细胞存活、增殖及潜在多向分化能力无影响.磁标记细胞在MR上产生特征性的低信号改变.应用1.5T MR成像示踪标记细胞可行,以GRE T2*WI序列成像最为敏感.     

SPIO标记大鼠骨髓基质干细胞及体外磁共振成像研究

目的 探讨以多聚赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)为转染介质介导超顺磁性氧化铁微粒(superparamgnetic ironoxides,SPIO)标记大鼠骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的合适条件,通过标记细胞的体外磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)获取最佳的磁共振扫描序列.方法 分离、纯化、培养大鼠BMSCs,SPIO和PLL以1:0.001 2混合配制氧化铁一多聚赖氨酸(F-PLL)混合液,用铁浓度分别为0、4.2、8.4、21、42、84μg/ml的FE-PLL复合物标记BMSCs.计算细胞标记阳性率,测量并绘制末标记细胞和不nd浓度铁标记细胞的MTT生长曲线;对不同浓度铁标记的细胞进行磁共振成像.分别用浓度为0、0.05、0.25、0.5、1.0、5.0 μg/ml的PLL同BMSCs共同培养,了解各种浓度PLL对细胞的生存是否有影响.结果 细胞的标记率分别为O%、(44.40±11.33)%、(71.97 4±8.01)%、(88.86±9.10)%、(98.24±2.94)%、100%,随着SPIO浓度的增加而增加.MTT显示在铁浓度＜42 μg/ml时FE-PLL上复合物对细胞的生长活性无明显影响,而铁浓度为84μg/ml时,细胞的生长活性受到抑制.PLL在浓度≤1.0μg/ml时对细胞的活力无明显影响;当PLL浓度为5.0μg/ml时,细胞生长明显受抑.MRI信号随FE-PLL复合物浓度的增加而增加(P＜0.05),标记细胞的信号在T1WI的改变不及在T2WI及T2*WI明显,而以T2*WI信号改变最明显(P＜0.05).结论 以PLL为转染介质,SPIO能够高效的标记BMSCs,并且在合适的浓度范围内不会影响干细胞的生长活性.     

超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞治疗大鼠脑卒中的磁共振活体追踪

目的探索利用磁共振技术活体追踪干细胞的可行性以及干细胞对卒中大鼠脑梗死体积的影响。方法采集大鼠后肢股骨和胫骨骨髓,采用密度梯度离心法分离并培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)。利用超顺磁性氧化铁和多聚左旋赖氨酸的混合物标记BMSCs,普鲁士蓝染色检测标记率。线栓法建立18只大鼠脑缺血2h再灌注动物模型,分为缺血对侧BMSCs移植组(细胞数1.5×105/15μl)、缺血同侧纹状体移植组(细胞数1.5×105/15μl)和对照组(15μlD-Hanks液)3组,每组6只。分别在脑缺血后第1天、细胞移植后第1天及第14天进行磁共振扫描,对各时间点梗死体积的变化进行统计学分析。结果超顺磁性氧化铁对BMSCs的标记率为96%。磁共振追踪显示移植后第14天缺血同侧移植组BMSCs向缺血灶边缘迁移,缺血对侧移植组BMSCs沿胼胝体弥散,但是3组之间的脑梗死体积变化差异无显著性(P>0.05)。结论超顺磁性氧化铁对干细胞标记率高,磁共振活体追踪有利于了解干细胞移植后的存活和迁移。BMSCs脑内移植对于卒中大鼠脑梗死体积的影响无统计学意义。     

Efficiently tracking of stem cells in vivo using different kinds of superparamagnetic iron oxide in swine with myocardial infarction

Background  Superparamagnetic iron oxide (SPIO) particles have shown much promise as a means to visualize labeled cells using molecular magnetic resonance imaging (MRI). Micrometer-sized superparamagnetic iron oxide (MPIO) particles and nanometer-sized ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO) are two kinds of SPIO widely used for monitoring stem cells migration. Here we compare the efficiency of two kinds of SPIO during the use of stem cells to treat acute myocardial infarction (AMI).

Methods  An AMI model in swine was created by 60 minutes of balloon occlusion of the left anterior descending coronary artery. Two kinds of SPIO particles were used to track after intracoronary delivered 10⁷ magnetically labeled mesenchymal stem cells (MR-MSCs). The distribution and migration of the MR-MSCs were assessed with the use of 3.0T MR scanner and then the results were confirmed by histological examination.

Results  MR-MSCs appeared as a local hypointense signal on T₂^*-weighted MRI and there was a gradual loss of the signal intensity after intracoronary transplantation. All of the hypointense signals in the USPIO-labeled group were found on T₂^*-weighted MRI, contrast to noise ratio (CNR) decreased in the MPIO-labeled group (16.07±5.85 vs. 10.96±1.34) and USPIO-labeled group (11.72±1.27 vs. 10.03±0.96) from 4 to 8 weeks after transplantation. However, the hypointense signals were not detected in MPIO-labeled group in two animals. MRI and the results were verified by histological examination.

Conclusions  We demonstrated that two kinds of SPIO particles in vitro have similar labeling efficiency and viability. USPIO is more suitable for labeling stem cells when they are transplanted via a coronary route.

     

菲立磁标记的大鼠骨髓基质干细胞在同种异体移植鼠肝脏中的追踪观察

目的:研究菲立磁标记的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)在同种异体移植鼠肝脏中的追踪方法. 方法:采用菲立磁(Feridex)对分离培养的BMSCs进行标记,Prussian blue染色和电镜观察对标记后的BMSCs进行鉴定;取鉴定后的BMSCs 2 mL(1×109/L)分别注射到SD异体大鼠的门静脉、肝局部实质、尾静脉内;采用磁共振成像(MRI)技术(SE-T2WI,FSE-T2WI,GRE-T2WI序列)分别对移植前6 h,移植后6 h,1,3和5 wk时的大鼠肝脏进行扫描. 结果:Prussian blue染色证实Feridex标记BMSCs阳性率＞90%,透射电镜见铁颗粒位于BMSCs胞质中;MRI扫描 SE-T2WI序列成像显示:各移植组在移植前肝脏均未见异常低信号区;门静脉组大鼠移植后6 h在肝门部可见异常的低信号改变,1,3 wk低信号改变范围逐渐扩大,第5周时低信号改变消失;肝内注射组大鼠移植后6 h在肝脏局部注入区域可见异常的低信号改变,1,3,5 wk低信号改变区域逐渐扩大. 尾静脉组在移植后各时间点均未见到异常低信号改变. 结论:Feridex标记的大鼠BMSCs在同种异体移植鼠肝脏中可用MRI进行有效的追踪.     

Magnetic Resonance Imaging of Transplanted Neural Stem Cells in Parkinson Disease Rats

Parkinson's disease (PD) is a degeneration disease with a main pathological change of characteristic deletion of nigra dopaminergic neurons. Now it is well known that neural stem cells (NSCs) reside in specific mammal brain region[1]. NSCs are optimal for cell-replacement therapy, thus making it a complementary therapeutic strategy to the traditional pharmacological therapies and fetal mesencephalic tissues transplantation[2]. It is important to distinguish grafted NSCs from host brain cel…     

Transplantation of magnetically labeled mesenchymal stem cells improves cardiac function in a swine myocardial infarction model

Background Mesenchymal stem cells （MSCs） transplantation provides a new approach for myocardial repair. However, many important fundamental questions about MSCs transplantation remain unanswered. There is an urgent need to identify MSCs from the beating heart and analyze the efficacy of this new approach. This study aimed to localize the magnetically labeled MSCs （MR-MSCs） and monitor the restorative effects of MR-MSCs with magnetic resonance （MR） imaging. Methods Acute myocardial infarction （AMI） was created in swine by a balloon occlusion of the left anterior descending coronary artery. Cells were delivered via intracoronary infusion after myocardial infarction. Infarct size change and cardiac function were assessed with 3.0T MR scanner. The results were then confirmed by histological and western blot analysis. All statistical procedures were performed with Systat （SPSS version 12.01）. Results A total of 26 swine were divided into four groups （sham-operated group, n=6; AMI group with PBS transplantation, n=6; labeled MSCs group, n=7; unlabeled MSCs group, n=7）. MSCs, MR-MSCs （10~cells） or PBS were delivered by intracoronary injection after MI and serial cardiac MR imaging studies were performed at 0, 4 and 8 weeks after transplantation. MR imaging demonstrated MI size decreased after MSCs transplantation in labeled and unlabeled groups, however, increases were seen in the AMI group at 8 weeks after MI. The left ventricular ejection fraction （LVEF） was slightly increased in the AMI group （（41.87~2.45）% vs （39.04~2.80）%, P 〉0.05）, but significantly improved in the MR-MSCs group （（56.85~1.29）% vs （40.67~2.00）%, P 〈0.05） and unlabeled group （（55.38~1.07）% vs （41.78~2.08）%, P 〈0.05） at 8 weeks after treatment. MR-MSCs were further confirmed by Prussian blue and immunofluorescent staining. Western blot analysis demonstrated that there was an increased expression of cardiomyocyte markers such as myosin heavy chain and troponin T in the MSCs trea     

小鼠胚胎干细胞磁标记共振成像的研究

目的 应用超顺磁氧化铁（SPIO）标记小鼠胚胎干细胞（ESC）,并行磁共振成像,为心肌细胞移植体内示踪作初步准备。方法 小鼠ESC及其分化的心肌细胞与SPIO孵育后行电镜分析、细胞内铁含量测定、[Ca^2＋]共聚焦测定和MR成像。结果 铁颗粒分布在胞质吞饮小泡内;使用转染技术的铁摄取高于未使用组;T2WI和T2^＊ WI扫描序列均见标记细胞呈信号下降,程度随标记浓度的增加而增强;T2^＊ WI图像信号强度变化更大。标记心肌细胞在T2^＊ WI序列也呈显著的低信号改变。结论 SPIO可有效标记ESC及其分化的心肌细胞,对细胞活性和分化能力无明显影响。常规1．5TMR仪可进行标记细胞成像。     

<Emphasis Type="Italic">In vitro</Emphasis> targeted magnetic delivery and tracking of superparamagnetic iron oxide particles labeled stem cells for articular cartilage defect repair

To assess a novel cell manipulation technique of tissue engineering with respect to its ability to augment superparamagnetic iron oxide particles (SPIO) labeled mesenchymal stem cells (MSCs) density at a localized cartilage defect site in an in vitro phantom by applying magnetic force. Meanwhile, non-invasive imaging techniques were use to track SPIO-labeled MSCs by magnetic resonance imaging (MRI). Human bone marrow MSCs were cultured and labeled with SPIO. Fresh degenerated human osteochondral fragments were obtained during total knee arthroplasty and a cartilage defect was created at the center. Then, the osteochondral fragments were attached to the sidewalls of culture flasks filled with phosphate-buffered saline (PBS) to mimic the human joint cavity. The SPIO-labeled MSCs were injected into the culture flasks in the presence of a 0.57 Tesla (T) magnetic force. Before and 90 min after cell targeting, the specimens underwent T2-weighted turbo spin-echo (SET2WI) sequence of 3.0 T MRI. MRI results were compared with histological findings. Macroscopic observation showed that SPIO-labeled MSCs were steered to the target region of cartilage defect. MRI revealed significant changes in signal intensity (P<0.01). HE staining exibited that a great number of MSCs formed a three-dimensional (3D) cell "sheet" structure at the chondral defect site. It was concluded that 0.57 T magnetic force permits spatial delivery of magnetically labeled MSCs to the target region in vitro. High-field MRI can serve as an very sensitive non-invasive technique for the visualization of SPIO-labeled MSCs.