小鼠精子Sp17与IL-5融合蛋白的构建、表达及其免疫原性鉴定

目的 构建和表达小鼠精子蛋白Sp17与白介素5(IL-5)融合蛋白,并对其进行纯化和免疫原性鉴定.方法 采用PCR技术从质粒pGEM-1-IL-5中扩增IL-5基因片段,将其克隆至pET/Sp17原核表达载体中与Sp17基因融合,构建重组质粒pET/Sp17-IL-5,经酶切鉴定后转化大肠杆菌B121(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni2+-NTA Agarose 纯化,SDS-PAGE检测、N端测序及Western blot;重组蛋白Sp17.IL-5免疫小鼠后ELISA检测小鼠血清特异性抗体.结果 成功构建小鼠精子蛋白Sp17与IL-5融合蛋白的高效表达质粒pET/Sp17-IL-5,重组工程菌pET-28a(+)-sp17-IL-5/BL21经IPTG诱导目的蛋白表达率约28%,PAGE初步测定目的蛋白相对分子量(Mr)约39 000,纯化后蛋白纯度达91%,免疫后小鼠血清中检测到特异性抗体.结论 Sp17-IL-5蛋白经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫活性,为新型Sp17避孕疫苗的研制奠定基础.     

人IL-17F融合蛋白在E.coli中表达及其生物学活性研究

目的：构建重组原核表达载体pCEX-5X-3／hIL-17F，使其在大肠杆菌中表达，获得GST-hIL-17F融合蛋白，并研究其生物学活性。方法：利用PCR法从自行构建的含hIL-17F基因的pUCm-T／hIL-17F载体中扩增其成熟肽基因序列，亚克隆于pGEX-SX-3中，构建原核表达载体pGEX-5X-3／hIL-17F，并在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达包涵体融合蛋白，经纯化后进行Western blot鉴定。MTT法分析GST-hIL-17F纯品蛋白对人脐静脉内皮细胞ECV304的生长抑制作用，EUSA法检测对ECV304内皮细胞表达IL-6、IFN-γ和TNF-α的生物学作用，并采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）法分析其对血管形成的影响。结果：GST-hIL-17F融合蛋白在大肠杆菌BL21中获得了高效表达，约占菌体总蛋白的55％，能产生约41kD的融合蛋白，且Western blot证实确为GST-hIL-17F目的蛋白。CST-ML-17F具有明显抑制ECV304内皮细胞增殖和上调表达IL-6的生物学效应，并具有显著的抗血管形成活性。结论：ML-17F重组原核表达和血管形成抑制效应的初步研究已获成功，为进一步研究rhIL-17F的抗血管形成机制和临床应用奠定了基础。     

重组人IL-10融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的 在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10融合蛋白,获得有生物学活性的IL-10。方法 限制性内切酶Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切目的基因IL-10,插入到同样双酶切的表达载体pET32a,构建重组载体IL-10／pET32a,测序正确后转化E.coli BL21（DE3）,不同温度、低浓度IPTG诱导工程菌表达目的蛋白,SDS-PAGE和Westem blot检测目的蛋白的表达,ELISA和MC／9细胞增殖法分别测定 IL-10的含量及生物学活性。结果 构建的表达重组载体IL-10／pET32a经酶切鉴定和序列测定表明完全正确,诱导工程菌可以表达可溶性的融合蛋白IL-10-Trx,同时也存在包含体融合蛋白,经Westem blot鉴定存在有目的蛋白IL-10,MC／9细胞增殖法测定可溶性的融合蛋白具有生物学活性。结论 成功表达了具有生物学活性的融合蛋白IL-10-Trx,有助于下游纯化和制备hIL-10基因工程药物。     

IL-23、 IL-17在桥本氏甲状腺炎患者甲状腺组织中的表达

目的:检测桥本甲状腺炎(HT)甲状腺组织中白细胞介素(IL)-23、IL-17的表达,并探讨IL-23/IL-17在HT免疫病理中的作用。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法,检测20例HT患者和15例正常甲状腺组织中IL-23p19、IL-17mRNA和蛋白的表达水平。结果:RT-PCR显示IL-23p19、IL-17mRNA在HT甲状腺组织中的平均表达水平分别为1.0154±0.5749、0.5952±0.2513,正常对照组的表达水平分别为0.0929±0.0242、0.1537±0.0855;两组比较,HT患者甲状腺组织IL-23p19、IL-17mRNA的表达水平显著高于正常对照(P<0.05);且在HT中,IL-23p19和IL-17mRNA的表达存在正相关(P<0.01,r=0.861)。West-ernblot检测显示IL-23p19、IL-17蛋白在HT甲状腺组织中的平均表达水平明显高于正常对照(P<0.05)。结论:IL-23、IL-17在HT患者甲状腺组织中的协同过表达,提示IL-23/IL-17可能参与了HT的免疫病理过程。     

小鼠白细胞介素18的基因克隆及其融合蛋白的表达

白细胞介素１８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １８，ＩＬ－１８）是一种能诱导ＩＦＮ－γ产生的新型细胞因子，在调节Ｔｈ１型细胞免疫应答中起重要作用。采用逆转录ＰＣＲ从活化的小鼠腹腔巨噬细胞中获得了小鼠ＩＬ－１８（ｍＩＬ－１８）ｃＤＮＡ，测序鉴定正确的片段经ＥｃｏＲＩ酶切后克隆入ＧＳＴ融合表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ，再转化至大肠杆菌ＤＨ５ａ高效表达，经纯化获得了有活性的ｍＩＬ－１８融合蛋白。     

人白介素17F真核蛋白表达及促炎症作用的研究

利用真核表达载体pCEP4,在人肾上皮293T细胞中表达hIL-17F/mFc融合蛋白并初步研究IL-17F生物学特性。实验应用RT-PCR法克隆hIL-17F CDS段基因序列。将测序正确的hIL-17F序列插入pCEP4质粒构建pCEP4/hIL-17F真核表达载体。转染人肾上皮293T细胞后,筛选阳性表达细胞株。RT-PCR、ELISA和Western blot等法鉴定hIL-17F分子的mRNA和蛋白表达。体外实验验证其促炎症作用。结果表明,构建的pCEP4/hIL-17F重组表达载体,能在293T细胞中稳定表达。获得的hIL-17F重组蛋白能稳定结合Raji细胞上的IL-17RC受体。体外刺激ECV304细胞,能显著促进IL-2等炎症因子的分泌。稳定表达hIL-17F重组蛋白的293T细胞系的建立,为进一步研究hIL-17F的生物学功能奠定了良好的基础。     

小鼠白细胞介素5融合蛋白在大肠杆菌的表达

将质粒ｐＢＶ－ｍＩＬ－５的小鼠白细胞介素５（ｍＩＬ－５）的ｃＤＮＡ插入表达载体ｐＥＸ３１ｂ，转化大肠杆菌ＲＲＩ，经热诱导获得高效表达，表达的重组蛋白占菌体总蛋白的４０％。该融合蛋白由大肠杆菌ＭＳ２聚合酶的９９个氨基酸和ｍＩＬ－５的１１３个氨基酸组成，在菌体中以包涵体的形式存在，用ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、尿素洗涤包涵体，初步纯化的重组蛋白纯度达９０％，已用于制备抗ｍＩＬ－５的单克隆抗体。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ证实ｍＩＬ－５重组蛋白能与抗ｍＩＬ－５多克隆ＩｇＧ特异结合。     

过敏性紫癜患者血清中IL-27、IL-17的表达及意义

目的 探讨过敏性紫癜(Henoch-Schoenlein purpura,HSP)患者急性期血清中IL-27、IL-17的表达水平。方法 以本院2017年12月至2018年11月收治的56例急性期过敏性紫癜患者为研究对象,同期行健康体检的28例志愿者为对照组,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测入选者外周血IL-27、IL-17的表达情况;采用相关分析法分析IL-27与IL-17表达的相关性以及与患者临床资料指标白细胞(WBC)、血小板(PLT)、C反应蛋白(CRP)、血沉(ESR)、(D-二聚体)D-Dimer、补体(C3、C4)、类风湿因子(RF)、胱抑素C(Cys-C)、免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM、IgE)、抗链球菌溶血素O(ASO)的关系。结果 HSP患者急性期血清IL-27的水平较正常对照组降低,IL-17的水平较正常对照组增高,差异均具有统计学意义(P0.05);IL-27与IL-17、抗溶血性链球菌O(ASO)呈负相关(P=0.016;P=0.034),IL-17与免疫球蛋白IgA呈正相关(P=0.002)。结论 过敏性紫癜患者血清中IL-27降低,IL-17升高,且IL-27水平与IL-17呈负相关,说明IL-27可能对IL-17具有免疫调节的作用,可能参与过敏性紫癜的致病过程并在疾病发展过程中发挥保护性作用。     

人白介素-17B真核蛋白表达及生物学功能的初步研究

目的:在真核细胞中表达hIL-17B/mFc融合蛋白并初步研究IL-17B生物学特性。方法:应用RT-PCR法克隆hIL-17B的CDS段基因序列。将测序正确的hIL-17B序列插入pCEP4质粒构建pCEP4/hIL-17B真核表达载体。转染人肾上皮293T细胞后,筛选阳性表达细胞株。RT-PCR、ELISA和Western blot等法鉴定hIL-17B分子的mRNA和蛋白水平表达。体外和体内实验验证其生物学功能。结果:成功构建了pCEP4/hIL-17B重组表达载体,并在293T细胞中稳定表达。获得的hIL-17B重组蛋白能稳定结合人单核THP-1细胞系上IL-17B受体。体外刺激THP-1,能显著促进IL-1β和TNF-α等炎症因子的分泌。体内实验发现其具有促进中性粒细胞迁移的作用。结论:稳定表达hIL-17B重组蛋白的293T细胞系的建立,为进一步研究hIL-17B的生物学功能奠定了良好的基础。     

小鼠白细胞介素17A的克隆、表达及活性鉴定

目的:克隆小鼠白细胞介素17A(mIL-17A)基因,构建mIL-17A原核表达质粒在E.coil Rosetta(DE3)PlysS表达,得到有活性的mIL-17A蛋白。方法:提取人IL-1β免疫的小鼠胸腺总RNA,反转录成cDNA,以此为模板,根据GenBank报道的mIL-17A序列设计引物,进行巢式PCR,得到成熟mIL-17A的编码序列并构建到pMD18-T载体中,再亚克隆至原核表达载体pHisSUMO Express中,经DNA测序鉴定后转化Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达,Western blot鉴定。纯化后的蛋白处理3T3-L1前体脂肪细胞,real time PCR鉴定白细胞介素6(IL-6)的表达变化。结果:DNA测序证明所克隆基因序列与GenBank报道的完全一致。成功构建了pHisSUMO Express-mIL-17A原核表达质粒以包涵体形式表达了重组mIL-17A蛋白,且Western blot证实为目的蛋白。所得蛋白上调3T3-L1细胞表达IL-6。结论:获得具有生物活性的mIL-17A蛋白,为进一步研究其蛋白特性及其生物活性奠定基础。     

支气管哮喘患儿血清中IL-17、IL-21和IL-22水平变化及其临床意义

目的:探讨Th17细胞分泌的细胞因子IL-17、IL-21和IL-22在血清中的表达与儿童支气管哮喘的相关性以及与儿童哮喘发作程度的关系。方法:采用ELISA法,对68例哮喘患儿和30例健康对照患儿血清中IL-17、IL-21和IL-22的水平进行检测。患儿血清中IL-17、IL-21和IL-22与患儿性别、年龄的关系进行Pearson相关分析。结果:三种细胞因子的水平在不同性别间无显著性差异,与年龄亦无相关性。哮喘患儿血清中IL-17(37.35±10.52)pg/mL和IL-22(407.42±137.41)pg/mL的表达水平明显高于健康对照组,而IL-21表达水平在两组之间无差异;IL-21和IL-22的表达与哮喘发作程度无关,而IL-17表达水平与哮喘发作程度呈正相关。结论:Th17细胞分泌的细胞因子IL-17和IL-22在哮喘的炎症中发挥重要作用,是监测病情和诊断哮喘的重要指标之一。     

矽肺患者血清IL-17检测的临床意义

目的：检测矽肺患者血清中IL-17水平,探讨其在矽肺发生发展中的意义。方法：采用酶联免疫吸附法,对45例Ⅰ期、22例Ⅱ期、9例Ⅲ期矽肺患者和52例非矽肺接尘工人的血清IL-17水平进行检测。结果：Ⅰ期矽肺组患者血清IL-17水平显著高于Ⅱ、Ⅲ期矽肺组及非矽肺接尘组,差异具有统计学意义（P〈0.01）。Ⅱ、Ⅲ期矽肺组与非矽肺接尘组相比,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：IL-17在矽肺形成早期呈高表达,且可能参与了矽肺发生发展的过程。     

IL-17在子痫前期患者胎盘组织的表达

目的探讨白细胞介素-17(IL-17)与子痫前期发病的关系。方法选取2010年10月至2011年12月在广州医学院第二附属医院和广州医学院第三附属医院产科住院的子痫前期患者30例,其中足月妊娠9例,未足月妊娠21例;选取同期住院分娩的正常足月妊娠孕妇30例为对照组。30例正常晚期妊娠孕妇为对照组。采用免疫组化方法检测两组胎盘组织IL-17表达水平。结果子痫前期组胎盘IL-17表达量较对照组升高(P<0.05)。结论IL-17可能介导了子痫前期的发生。     

TPA致小鼠耳肿胀模型的中性粒细胞聚集及IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17A的表达水平研究

目的从蛋白水平和mRNA水平探讨佛波酯(TPA)诱导的小鼠炎症耳组织中IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-17A的表达情况。方法通过HE染色观察TPA致小鼠耳组织的炎症水肿和淋巴细胞浸润,测定髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性判断中性粒细胞的聚集情况,ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17A的蛋白含量以及实时荧光定量PCR法检测它们的mRNA水平。结果与正常组相比,模型组小鼠耳组织有明显的炎症水肿和淋巴细胞浸润,中性粒细胞聚集严重,并且该组小鼠耳组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量和mRNA水平显著地增高,而IL-17A没有明显地变化;阳性药物组与模型组相比,能有效地抑制小鼠耳组织的炎症水肿,淋巴细胞浸润,中性粒细胞聚集以及下调各炎症细胞因子的蛋白含量和mRNA水平。结论 TPA诱导的小鼠耳肿胀严重程度除了与淋巴细胞浸润和中性粒细胞聚集有关外,还与靶组织中显著上调的IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白含量和mRNA水平有关。     

IL-23与IL-17在强直性脊柱炎患者中表达的初步研究

目的:通过研究IL-23与IL-17在强直性脊柱炎(AS)患者中的表达情况,为进一步阐明As发病机制和寻找新的治疗靶点提供理论依据.方法:AS患者与健康对照血清及培养的外周血单个核细胞(PBMCs)上清中IL-23与IL-17水平应用ELISA方法检测;应用RT-PCR方法检测PBMCs中IL-23p19 mRNA的表达.结果:39例活动期AS患者血清IL-23与IL-17水平分别为(1 159.71±139.45)pg/ml和(172.21±73.81)pg/ml,均较健康对照明显升高(P<0.001);AS患者培养的PBMCs上清IL-23与IL-17水平分别为(108.63±34.53)pg/ml和(134.59±38.32)pg/ml,明显高于健康对照(P<0.001),IL-23p19 mRNA表达明显高于健康对照,平均光密度分析差异有极显著统计学意义(P<0.001);IL-23可促进健康对照和AS患者的PBMCs IL-17的分泌,此作用在AS患者更显著.结论:IL-23与IL-17可能在AS的发病中发挥作用,IL-23可能通过诱导IL-17的产生而使后者在AS的发病中发挥作用.     

内源性IL-17诱导MIP-2与IL-6表达在衣原体肺炎中促进中性粒细胞循环

目的 探讨衣原体肺炎中白细胞介素-17(interleukin -17,IL-17)对中性粒细胞(polymorphonuclear leucocyte,PMN)循环的调节作用及机制.方法 用40 μl含1×103包涵体形成单位(inclusion-forming units,IFU)的衣原体鼠肺炎株(Chlamydia muridarum,Cm)呼吸道感染BALB/c小鼠,诱导鼠衣原体肺炎.用抗鼠IL-17单克隆抗体吸入中和内源性IL-17,以相应独特型抗体(IgG2α)作为对照.用RT-PCR检测小鼠肺组织及肺上皮细胞系巨噬细胞炎性蛋白-2 (macrophage inflammatory protein-2,MIP-2)和IL-6 mRNA的表达.取小鼠支气管肺泡灌洗液细胞染色计数PMN,感染肺组织进行病理染色.结果 衣原体肺炎中,内源性IL-17中和小鼠肺组织PMN浸润显著降低,支气管肺泡灌洗液PMN数量显著低于对照组.IL-17与TNF-α协同可上调肺上皮细胞MIP-2和IL-6 mRNA表达,且内源性IL-17中和小鼠肺组织MIP-2和IL-6表达显著降低.结论 衣原体肺炎中IL-17通过促进肺组织细胞分泌趋化性细胞因子MIP-2和前症性细胞因子IL-6,诱导PMN循环,参与宿主抗衣原体炎性应答.     

小鼠白细胞介素-12融合蛋白编码基因的构建与表达研究

目的 构建小鼠白细胞介素－１２的融合基因,并进行初号表达,方法 通过重叠序列引物的设计与多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术,将小鼠ＩＬ－１２的４０ｋＰａ多肽链基因与３５ｋＤａ多肽链基因,以甘氨酸接头（Ｇｌｙ４Ｓｃｒ）３序列连接成为晤蛋白编码基因,构建融合蛋白表达载体现,转染小鼠成纤维细胞ＳＶＴ２,表达具有生物学活性的融合蛋白型ＩＬ－１２。结果 构建的小鼠ＩＬ－１２表达载体经测序无突变发生。以Ｇ４１８筛选转     

小鼠白细胞介素5融合蛋白大肠杆菌的表达

将质粒ｐＢＶ－ｍＩＬ－５的小鼠白细胞介素５（ｍＩＬ－５）的ｃＤＮＡ插入表达载体ｐＥＸ３１ｂ，转化大肠杆菌ＲＲＩ，经热诱导获得高效表达，表达的重组慢白占菌体总蛋白的４０％，该融合蛋白由大肠杆菌ＭＳ２聚合酶的９９个氨基酸和ｍＩＬ－５的１１３个氨基酸组成，在菌体中以包涵体的形式存在，用ＴｒｉｔｏｎＸ－１００尿素洗涤包涵体，初步纯化的重组蛋白纯度达９０％，已用于制备抗ｍＩＬ－５的单克隆抗体，Ｗｅｓｔｅｒｎ     

小鼠IL-12单链融合基因真核表达质粒构建及其肿瘤基因治疗初探

目的　构建小鼠IL 12单链融合基因 (msIL 12 ) ,进行基因治疗初探。方法　用RT PCR法从小鼠腹腔巨噬细胞总RNA分别获取p4 0cDNA和p35cDNA ,2次PCR引入linker后 ,依次克隆入pcDNA3质粒 ,构建成msIL 12真核表达质粒 (pmsIL 12 ) ;用DEAE dextran法将PEG纯化的pmsIL 12转染COS 7细胞 ,用ELISA法检测其培养上清 (转染上清 )IL 12蛋白含量。皮内注射PEG纯化的pmsIL 12 ,用MTT法检测其对正常小鼠脾细胞NK活性的影响 ,观察其对荷H2 2腹水型肝癌细胞瘤小鼠生存期的影响。结果　所得p35cDNA序列与GenBank登录号M86 6 72完全一致 ;所得IL 12p4 0cDNA序列与GenBank登录号AH0 0 4 85 9报道完全相同 ,除第 10 0 0位碱基是G而不是A(但所编码氨基酸相同 ,都是丝氨酸 )外也与GenBank登录号M86 6 71报道相同。成功构建了小鼠IL 12单链融合基因真核表达质粒pmsIL 12 ,其转染COS 7细胞后的转染上清IL 12蛋白含量达 (2 .5 5± 0 .6 0 )ng ml。皮内注射pmsIL 12后 ,使正常小鼠脾细胞NK活性显著增强 (P <0 .0 1) ,使荷H2 2肝癌细胞瘤小鼠的生存期明显延长(P <0 .0 5 )。结论　构建了小鼠IL 12单链融合基因的真核表达质粒 ,可用于基因治疗研究。