实时定量PCR技术检测结核分枝杆菌蛋白编码基因表达水平研究

目的运用实时定量PCR(qRT-PCR)检测66株结核分枝杆菌蛋白编码基因(fbpB,psts1,mpt64)的表达水平,探讨结核分枝杆菌耐药菌株与敏感菌株,北京基因型菌株与非北京基因型菌株的蛋白抗原在转录水平的差异。方法根据GenBank提供的序列,设计特异性引物,扩增目的基因片段,克隆入载体,重组质粒经纯化及梯度稀释,应用qRT-PCR检测基因的表达水平。结果北京基因型菌株psts1基因表达水平与非北京基因型菌株比较差异有统计学意义(t=3.721,P<0.01);耐药菌株mpt64基因表达水平与敏感菌株比较差异有统计学意义(t=3.951,P<0.01)。结核分枝杆菌活菌的扩增曲线呈典型的S型,结核分枝杆菌死菌和非结核分枝杆菌呈水平直线,未检测到荧光信号。结论北京基因型结核分枝杆菌psts1基因的表达量低于非北京基因型,结核分枝杆菌耐药菌株mpt64基因的表达量低于敏感株。     

实时荧光定量PCR法分析结核分枝杆菌对异烟肼耐药的分析

目的利用实时荧光定量PCR技术快速检测异烟肼耐药结核分枝杆菌。方法收集到医院就诊的结核病疑似患者痰液样本,提取痰液样本的总DNA,利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术对结核分枝杆菌感染进行快速筛查,并与传统药敏试验进行比较,对两者的灵敏度、特异性、一致性进行比较分析。结果检测346例结核病人临床分离培养样本,药敏试验检出257例异烟肼敏感标本,101例异烟肼耐药标本;实时荧光定量PCR法共检测出异烟肼敏感和耐药标本225例98例,灵敏度为86.64%,特异性为93.92%,一致率为93.12%。结论跟传统药物敏感性实验相比,实时荧光定量PCR法检测速度快速、特异性强、灵敏度较高,可用于结核分枝杆菌耐异烟肼突变的快速检测,适于耐多药结核病的快速筛查。     

TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测结核分枝杆菌katG基因突变

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测结核分枝杆菌katG基因突变的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。方法 根据结核分枝杆菌katG基因主要发生315位点突变的特点,设计一对特异性TaqMan-MGB探针和引物,通过反应条件优化,建立荧光定量PCR方法;用克隆到PMD18-T载体上katG基因阳性标准品及不同菌株来评价该方法的特异性、敏感性和重复性。结果 灵敏度高,检测目的基因的最低检测下限10copies/μl,比常规PCR灵敏高100倍;特异性高,检测16株非结核分枝杆菌标准株和7种常见呼吸道感染细菌的标准株均为阴性;与测序法相比,野生型和突变型探针的敏感性和特异性均为100%。重复性好,批内批间CT值变异系数均小于1%。结论：TaqMan-MGB荧光定量PCR的方法能特异、灵敏、快速检测结核杆菌菌株katG 315位点突变。     

结核分枝杆菌对吡嗪酰胺耐药的相关基因及耐药机制研究进展

吡嗪酰胺是结核病最重要的一线治疗药物之一,但结核分枝杆菌对其耐药性在逐年增长,目前对于结核分枝杆菌吡嗪酰胺的耐药基因的分子机制尚无定论。作者对结核分枝杆菌吡嗪酰胺的相关耐药基因pncA、rpsA、panD、fadD2及FAS-I的研究进展进行综述。     

华东地区耐药结核分枝杆菌katG基因的变异

目的了解我国华东地区结核分枝杆菌中与异烟肼耐药相关的katG基因的变异情况，提供我国异烟肼耐药相关的基因谱。方法对429株结核杆菌行核酸抽提后先以限制性酶切片段多态性方法检测有无最常见的耐药相关S315T突变，对未发现S315T突变的异烟肼耐药株取部分行katG全基因测序以了解其他位点的变异情况。结果耐药结核分枝杆菌中76．9％（166／216）存在katG基因$315T突变。发现有2株异烟肼高度耐药株中存在katG基因片段的缺失。48株异烟肼耐药株测序结果发现katG基因突变特点如下：突变率较高的有315、463、234位点，其余突变位点较多而分散。315位密码子的突变中除S315T外，S315N突变形式也较常见，占8．7％。结论结核分枝杆菌耐药机制复杂，了解耐药相关基因的变异情况是建立可靠的耐药性分子检测方法的基础。     

结核分枝杆菌部分耐药相关基因的突变特点

目的分析结核分枝杆菌耐药相关基因的突变特点，评价DNA序列分析用于结核分枝杆菌快速耐药性检测的应用价值。方法利用DNA序列分析检测结核分枝杆菌的KatG、rpoB和gyrA基因片段。结果8681％（79／91）异烟肼耐药株存在katG基因的点突变和／或单碱基插入，最常见的突变形式为R463L，占76．92％（70／91）。90．38％（94／104）的利福平耐药株rrpoB基因耐药决定区（RRDR）发生突变，突变类型有26种，涉及11种氨基酸，突变集中在密码子507～533位。70．49％（86／122）氧氟沙星耐药株在gyrA基因耐药决定区（QRDR）发生突变，突变主要形式为A90V、D94Y、D94N、D94H及S91P。结论耐药相关基因突变的检测可作为临床快速检测结核分枝杆菌耐药性的方法之一。     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌TaqMan荧光PCR检测的建立

目的对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌分别建立荧光PCR快速检测方法。结核分枝杆菌荧光PCR对H37Rv标准菌株、结核分枝杆菌临床分离株的检测结果呈典型阳性反应，牛分枝杆菌荧光PCR对牛分枝杆菌标准菌株、BCG菌株的检测结果呈典型阳性反应，对其它分枝杆菌菌株以及常见微生物样品为阴性反应。两种荧光PCR对对应阳性重组质粒模板的检测灵敏度可达单个基因拷贝，对结核分枝杆菌或BCG标准菌株的检测灵敏度可达单个菌细胞。对临床样品的检测结果显示，荧光PCR对模拟感染奶样、血样的检测灵敏度可达单个菌细胞。所建立的方法，全过程包括血样、奶样、痰液等临床样品的前处理、核酸提取和荧光PCR检测，可在5～6h内完成。采用上述荧光PCR方法从临床采集的疑似病人痰液中检出多份结核分枝杆菌阳性样品。     

984株结核分枝杆菌耐药情况分析

目的了解浙江省当前结核病对一线抗结核药物的耐药水平及耐多药情况，为今后结核病防治工作提供参考依据。方法采用WHO推荐的药敏比例法对984株临床分离结核分枝杆菌进行药物敏感性试验。结果总耐药率为30．6％，初始耐药率为26．6％，获得性耐药率为52．3％，耐多药（MDR）率为7．6％。结论浙江省耐药水平有上升趋势，应引起相关卫生部门的关注。     

结核分枝杆菌相关毒力基因的研究进展

在结核病的发生过程中,毒力起着重要的作用,因为只有毒力菌株才可致病.结核菌的毒力可以理解为其引起结核病的能力,而致病性与毒力因子总是联系在一起的.结核菌是典型的胞内寄生菌,但只有有毒株才能在细胞内存活和繁殖.毒力因子在毒力株的巨噬细胞复制中起关键作用,目前对毒力相关基因及毒力因子作用机制知之甚少.本文将对几个研究较多的毒力相关基因作一综述.     

利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术检测痰标本中结核分枝杆菌及其耐药性的研究

目的 评估利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（Xpert Mtb/RIF）对结核病及利福平耐药性的检测效能。 方法 选取588例初诊患者痰标本,分别进行涂片镜检、固体培养、传统比例法药敏试验和Xpert Mtb/RIF检测,分析Xpert Mtb/RIF方法检测痰标本中Mtb及其耐药性的敏感度和特异度。 结果 以固体培养试验结果作为金标准,Xpert Mtb/RIF方法检测痰标本Mtb的敏感度和特异度为95.0%（345/363）和89.6%（147/164）,以传统比例法药敏试验结果为金标准,Xpert Mtb/RIF方法检测利福平耐药的敏感度和特异度分别为89.1%（41/46）和96.3%（289/300）。 结论 Xpert Mtb/RIF检测敏感度和特异度较高,在Mtb及其利福平耐药快速检测方面具有比较好的应用前景。     

荧光定量PCR技术快速检测rpoB基因突变及其临床应用

目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区（RifampicinResistartceDeterminingReglon，RRDR）526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针（526CAC，526TAC，53ITCG和531TrG）．应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而，应用该技术检测84份肺结核病例痰标本，与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较．部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中．其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100％。在84份哺结核病例的痰标本中，罗氏培养阳性62株．其中利福平耐药株48份．荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到53l密码子突变65例，526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中，荧光定量PCR检测43株为531TTG突变．3株为526TAC突变，另2株利福平耐药株，经测序证实，1株514密码子．TTC插入突变，1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变，并能作为I晦床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。     

结核分枝杆菌rv3873基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌（M.tb）rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增MTB rv3873基因，并克隆入pGEM-T Easy质粒。测序正确后，再亚克隆入pET30a（＋）质粒，构建pET30a（＋）：rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5α和BL21（DE3）菌后，经0．4mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导，pET30a（＋）：rv3873表达出分子量为47000左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中，表达量占全菌蛋白质的50％，Western blot证实其具有良好的抗原性。经Ni—NTA柱纯化，获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：rv3873，并获得PPE68重组蛋白，为辅助诊断结核菌的感染奠定了基础。     

用耐药基因检测方法指导老年肺结核病人治疗的临床研究

目的：了解老年肺结核病人的结核分支杆菌耐药情况，评价它们的临床应用价值。方法：采用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（PCR－SSCP）检测结核分支杆菌rpoB,katG,rpsL,pncA,embB基因突变和药物敏感试验（比例法），了解117例老年结核病人结核分枝杆菌耐药情况。探讨和比较2种耐药性检测方法的检测效果。结果：1／2上的肺结核病人至少耐2种抗结核药物，对RFP、INH、SM、PZA和EB总耐药率为82．1％、71．7％、63．2％、51．2％和35．0％，耐多药率为67．5％，rpoB,katG,rpsL,PpncA和embB基因突变率分别为72．8％、64．9％、59．8％、41．0％和30．7％，多基因突变株达76．0％，结核杆菌耐药基因突变与耐药水平联系密切，多数结核分支杆菌耐药基因突变易发生在高耐药区，也有少数基因突变发生在低耐药区。根据药敏试验和耐药基因检测，耐多药结核病人6个月治愈率分别达到54．8％和62．8％，治疗效果满意，两种方法没有显著性差异（P＞0．05）。结论：耐药基因检测指寻治疗是一种新探索，PCR－SSCP方法敏感，特异，可以快速检测结核菌rpoB,katG,rpsL,pncA和embB耐药基因突变，可能会成为临床指导用药的好方法。     

荧光定量PCR技术快速检测rpoB基因突变及其临床应用

目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区（Rifampicin Resistance Determining Region，RRDR）526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针（526CAC，526TAC，531TCG和531TTG），应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而，应用该技术检测84份肺结核病例痰标本，与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较，部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中，其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100％。在84份肺结核病例的痰标本中，罗氏培养阳性62株，其中利福平耐药株48份，荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到531密码子TTG突变65例，526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中，荧光定量PCR检测43株为531TTG突变，3株为526TAC突变，另2株利福平耐药株，经测序证实，1株514密码子TTC插入突变，1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变，并能作为临床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。     

荧光定量PCR技术快速检测rpoB基因突变及其临床应用

目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区(Rifampicin Resistance Determining Region,RRDR)526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针(526CAC,526TAC,531TCG和531TTG),应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而,应用该技术检测84份肺结核病例痰标本,与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较,部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中,其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100%。在84份肺结核病例的痰标本中,罗氏培养阳性62株,其中利福平耐药株48份,荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到531密码子TTG突变65例,526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中,荧光定量PCR检测43株为531TTG突变,3株为526TAC突变,另2株利福平耐药株,经测序证实,1株514密码子TTC插入突变,1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变,并能作为临床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。     

用变性高压液相色谱技术检测耐氧氟沙星的结核分枝杆菌临床株

目的利用变性高压液相色谱（DHPLC）技术快速检测结核分枝杆菌gyrA基因的突变，从而对结核分枝杆菌是否耐受氟喹诺酮类药物做出初步判断。方法提取试验菌株基因组DNA，扩增gyrA基因的氟喹诺酮药物耐受决定区（QRDR）核酸片段；分别与H37Rv标准株（或者含有单纯Ser284突变的临床分离株作为标准）的相应PCR产物混合、杂交后，利用WAVE核苷酸片段分析系统对各杂交产物进行DHPLC检测；序列测定结果与相应的DHPLC检测结果进行比较以验证DHPLC检测的准确性。采用2mg/L的药物浓度进行氧氟沙星（OFLX）药物敏感性试验，确定101株结核分枝杆菌临床分离株对OFLX的敏感性，通过比较药物敏感性和DHPLC检测结果，建立两者之间的对应关系。结果利用DHPLC检测QRDR突变与序列测定具有同样的检出率（100％），两者都能够很好地检测QRDR突变。采用单纯含有Ser284突变的临床分离株代替H37Rv作为标准进行DHPLC检测，可以检测出除Ser284突变点外所有的点突变形式。在101株结核分枝杆菌临床分离株中，有49株对2mg／L OFLX敏感；52株耐受。52株耐药菌株中，有27株能够通过序列测定和DHPLC法得到准确判定。采用含有单纯Ser284突变的临床分离株作为标准进行DHPLC检测菌株的耐药性，检测结果更准确。结论DHPLC法是快速检测出结核分枝杆菌gyrA基因碱基突变的好方法，但是碱基突变与结核分枝杆菌是否耐受氟喹诺酮类药物存复杂的关系，因此该方法应用于临床检测尚需进一步验证。     

结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性和克隆表达

目的鉴定结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性,克隆表达该基因并获得其重组蛋白。方法设计Rv1512基因的特异性引物,并鉴定其特异性。构建pET30a（＋）：Rv1512重组质粒,阳性克隆转化入大肠杆菌BL21。经Ni＋-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE鉴定该蛋白及其纯度。结果结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性被证实;经测序分析证实Rv1512原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE结果显示在40 kD处呈现单一蛋白条带。结论结核分枝杆菌Rv1512基因具有较好的特异性;成功构建表达载体pET30a（＋）：Rv1512并获得重组蛋白,为辅助诊断结核分枝杆菌的感染奠定基础。     

结核分支杆菌五种耐药基因检测的临床应用及评价

目的　检测结核分支杆菌rpoBkatG、rpsL、pncA和embB耐药基因 ,评价其临床应用价值。方法　采用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)分析和药敏试验 (比例法 ) ,了解 10 9例肺结核患者结核分支杆菌耐药情况 ,并分析、比较临床治疗效果。结果　 1/ 2以上的肺结核患者至少耐两种抗结核药物 ,对RFP、INH、SM、PZA和EB总耐药率分别为 80 7%、71 5 %、78 8%、5 7 7%和48 6%。rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变率分别为 76%、68%、71%、5 1%和 3 0 %。结核分支杆菌耐药基因突变率与耐药水平联系密切 ,多数结核分支杆菌耐药基因突变易发生在高耐药株 ,也有少数基因突变发生在低耐药株。根据药敏试验和耐药基因检测结果 ,6个月耐多药结核治愈率分别达到 5 4 8%和 62 8% ,治疗效果满意 ,两种方法差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论　耐药基因检测指导治疗是一种新探索 ,PCR SSCP方法敏感、特异 ,可以快速检测结核分支杆菌rpoB、katG、rpsL、pncA和embB耐药基因突变 ,可能会成为临床指导用药的好方法     

逆向点杂交方法检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变

目的 建立一种灵敏、特异、快速检测结核分支杆菌耐药相关基因突变的方法，用于临床对利福平耐药的快速诊断。方法 将14条特异性探针固定在尼龙膜上，通过在下游引物标记生物素的方法得到生物素标记的结核分支杆菌DNA PCR扩增产物，与固定在尼龙膜上的特异性探针杂交，杂交物通过链酶亲和素标记辣根过氧化物酶及底物（四甲基联苯胺）显色判定结果。将杂交结果与基因测序结果及药敏试验结果进行对比分析。结果 采用逆向点杂交法共检测23株耐利福平及11株敏感型菌株，与药敏试验结果、测序结果符合率分别为28／34和30／34。所发现突变类型依次为：第531位突变11株，第526位突变7株，第533位突变3株。未检测到第516位、第513位碱基突变。结论 该方法可用于临床结核分支杆菌对利福平耐药性的快速检测。     

2001 至 2005年澳门地区耐药结核病的流行趋势分析

目的分析中国澳门地区2001至2005年结核病的耐药情况。方法选取近5年澳门地区新发结核病患者及复治结核病患者结核分枝杆菌分离株进行4种抗结核药物（异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇）的耐药性测定。结果1460株结核分枝杆菌的总耐药率为16．2％（236株），其中初始和获得性耐药率分别为15．0（203／1357）和32．0（33／103）；耐多药率为3．2％（47／1460），其中初始和获得性耐多药率分别为2．3％（31／1357）和15．5％（16／103）；4种抗结核药物的耐药率由高到低依次为异烟肼（11．5％）、链霉素（9．5％）、利福平（3．6％）、乙胺丁醇（2．5％）；耐1种、2种、3种和4种药物的初始耐药率分别为9．9％、2．9％、1．0％和1．2％，获得性耐药率分别为12．6％、3．9％、8．7％和6．8％。近5年新发和复治患者的耐药率没有上升趋势（χ2值分别为0．27和0．03，P均〉0．05）；不同性别和年龄组间初始耐药率的差异无统计学意义（χ2=5．7，P〉0．05）。结论本次流行病学调查结果与1996至1999年澳门地区结核病流行病学调查资料比较，获得性耐药率和获得性耐多药率显著下降，差异有统计学意义（χ2值分别为6．04和7．47，P均〈0．05），但初始耐药率和获得性耐药率高于2004年第3次全球多国耐药监察结果，仍处于高耐药水平，尤其是耐多药率较高的问题，应引起重视。