亚洲牛带绦虫NOMO1基因在原核细胞中表达

目的 构建亚洲牛带绦虫NOMO1基因原核重组质粒,进行原核表达、纯化及免疫学研究.方法 以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中含NOMO1基因的质粒作为模板,扩增该基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,测序鉴定重组质粒后再行诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,并用蛋白免疫印迹(Western-blotting)分析其免疫反应性.结果 成功建构了原核重组质粒pET28a(+)-NO-MI1.该基因在大肠埃希菌中以包涵体形式存在,破包涵体后纯化蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果表明该基因在大肠埃希菌BL-21/DE3得到高效表达.Western blotting结果显示,该重组蛋白可被亚洲牛带绦虫、牛带绦虫病人血清识别,具有免疫反应性.结论 成功克隆亚洲牛带绦虫NOMO1基因、表达和纯化得到了该基因的重组蛋白并且证明该基因具有免疫反应性,为进一步研究该基因的功能提供条件.     

亚洲牛带绦虫Spefl-Like基因克隆、表达及纯化

目的 扩增、克隆和表达亚洲牛带绦虫(Taenia saginata aslatica)Spefl-Like基因全长cDNA,并进行表达产物的纯化.方法 以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中含Spcfl-Like基因的质粒作为模板,扩增该基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,测序鉴定重组质粒,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化.结果 PCR,双酶切及DNA测序见过均表明重组质粒pET-28a(+)-Spcfl-Like构建成功,该基因在大肠埃希菌中以上清表达,纯化后蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果表明该基因在大肠埃希菌BL-21/DE3得到高效表达.结论 成功克隆了亚洲牛带绦虫Spefl-Like基因,并表达和纯化了Spcfl-Like蛋白,为研究Spefl-Like的功能及其疫苗等研究提供了基础依据.     

亚洲牛带绦虫26kDa GST基因表达及免疫学分析

目的 对亚洲牛带绦虫成虫26kDa谷胱甘肽S-转移酶基因(glutathione S-transferase,GST)进行克隆、表达和免疫学初步分析研究,为深入研究其生物学功能提供依据.方法 将亚洲牛带绦虫成虫26kDa GST克隆到原核表达质粒pET-30a( )中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹(Western Blotting)进行免疫学分析.结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-30a( )-Ta GST构建成功.SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白.重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性;并且能识别感染了亚洲牛带绦虫的猪血清和亚洲牛带绦虫患者血清,表明其具有免疫反应性.结论 亚洲牛带绦虫成虫26kDa谷胱甘肽S-转移酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达.     

牛带绦虫乳酸脱氢酶基因原核表达及免疫学特征

目的 克隆牛带绦虫乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)基因在大肠杆菌中表达,研究其免疫学特征.方法 将牛带绦虫成虫LDH基因与质粒pET-28a(+)连接构建原核重组质粒,在大肠埃希菌BL21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷诱导表达,表达产物通过十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blotting)进行分析.结果 牛带绦虫乳酸脱氢酶基因编码332个氨基酸,理论分子量为35.4kDa,PCR、双酶切及DNA测序的结果均证明pET-28a(+)-LDH构建成功;SDS-PAGE结果表明,牛带LDH基因在大肠埃希菌高效表达,经过亲和层析高纯度蛋白,且该重组蛋白可以被亚洲带绦虫、牛带绦虫及猪带绦虫感染病人血清识别,表明其具有免疫反应性.结论 牛带绦虫LDH基因可在原核系统中有免疫活性的高效表达.     

亚洲牛带绦虫肌动相关蛋白基因克隆及表达

目的 对亚洲牛带绦虫(Taenia saginata asiatica)成虫肌动相关蛋白2/3复合体亚单位4(Actin related protein 2/3 complex subunit 4)基因进行克隆、表达和免疫学研究.方法 以亚洲牛带绦虫eDNA文库中肌动相关蛋白2/3复合体亚单位4的已知序列设计合成一对特殊引物,进行PCR技术扩增目的 基因,克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,在CaCl2制备的感受态大肠埃希茵BL21/DE3中经过异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导目的 基因表达,表达产物经过十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定.由于蛋白在包涵体表达,故通过N-十二烷基肌氨酸钠(SKL)法纯化获得纯化重组蛋白并用蛋白印迹(Western-blotting)进行免疫学分析.结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明,pET-28a(十)-Arp2/3重组质粒构建成功.SDS-PAGE结果表明,基因在大肠埃希菌BL21/DE3包涵体中表达,经过包涵体沉淀的溶解、重折叠和离子交换层析方法获得高纯度蛋白.重组蛋白能识别亚洲牛带绦虫患者及牛带绦虫患者血清,表明该蛋白具有免疫反应性.结论 成功克隆亚洲牛带绦虫肌动相关蛋白2/3复合体亚单位4基因,表达和纯化得到了该基因的重组蛋白并且证明该基因具有免疫反应性,为进一步研究该基因的功能提供条件.     

亚洲带绦虫EIFs3克隆与免疫反应性分析

目的对亚洲带绦虫真核翻译起始因子3(eukaryotic translation initiation factor3 subunit,EIFs 3)进行克隆及免疫学初步研究。方法利用在线生物信息学工具从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出含有EIFs3基因,并将该基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹(Western blotting)进行免疫学分析。结果 PCR,双酶切及DNA测序均显示重组体构建成功,用亲和层析法得到高纯度的蛋白,且该重组蛋白可被亚洲带绦虫及牛带绦虫及猪带病人血清识别,表明其具有免疫反应性。结论亚洲带绦虫成虫EIFs 33基因可在原核表达系统中获得具有免疫活性的高效表达。     

亚洲带绦虫包虫诊断抗原P-29基因克隆表达

目的 识别亚洲带绦虫包虫诊断抗原P-29(Hydatid disease diagnostic antigen P-29)的已知序列并行克隆和蛋白表达及免疫学研究.方法 利用在线生物信息学工具序列分析后以亚洲带绦虫成虫包虫诊断抗原P-29基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析.结果 重组体构建成功并以包涵体形式存在,破包涵体纯化蛋白并得到高纯度的蛋白,且该重组蛋白可被亚洲带绦虫及牛带绦虫病人血清识别,表明其具有免疫反应性.结论 亚洲带绦虫成虫包虫诊断抗原P-29可在原核表达系统中获得具有免疫活性的高效表达.     

亚洲牛带绦虫TaCRISP基因克隆、表达和序列分析

目的 通过筛选亚洲牛带绦虫(Taenia saginata asiatica)成虫cDNA质粒文库,识别半胱氨酸分泌蛋白(Ta CRISP),并进行克隆表达,为进一步研究其功能提供基础依据.方法 用生物信息学方法从亚洲牛带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别TaCRISP的全长编码基因并预测编码蛋白质的各种结构与功能;将其编码区序列克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,测序鉴定重组质粒,之后进行诱导表达,表达产物经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定.结果 该基因全长1 090bp,编码239个氨基酸,1aa-16aa位为分泌信号肽,理论分子量为26 973.8,等电点为5.96.生物信息分析揭示,Ta CRISP与中殖孔绦虫CRISP一致性为38%,相似性为54%;所构建的重组体经PCR、双酶切及测序鉴定与目标基因相符.SDS-PAGE结果表明,目的 基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中表达成功.结论 发现亚洲牛带绦虫Ta CRISP基因,成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白.     

猪带绦虫成虫EF-1基因生物信息分析及原核表达

目的 分析和预测牛带绦虫成虫精氨酰-Trna转移酶(arginyl-Trna-protein transferase,ATE)基因及其编码蛋白的结构域特性,并进行原核表达.方法 利用在线生物信息学网站及工具对牛带绦虫精氨酰-Trna转移酶基因的功能进行预测并将其编码区序列克隆到原核表达载体Pet-28a(+)上,测序鉴定重组质粒.结果 该基因全长1 476 bp,编码区为141～1 617 bp,编码491个氨基酸;该基因为全长基因,无跨膜区,具有多个磷酸化位点,蛋白的理化性质稳定,理论分子量为56 436.3Da;没有质体、线粒体定位序列;十二烷基一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果表明,目的基因在大肠埃希菌BL21-DE3中表达成功.结论 筛选出牛带绦虫成虫精氨酰-Trna转移酶基因,成功构建重组原核表达质粒.     

牛带绦虫ATE基因功能预测及原核表达

目的 分析和预测牛带绦虫成虫精氨酰-Trna转移酶(arginyl-Trna-protein transferase,ATE)基因及其编码蛋白的结构域特性,并进行原核表达.方法 利用在线生物信息学网站及工具对牛带绦虫精氨酰-Trna转移酶基因的功能进行预测并将其编码区序列克隆到原核表达载体Pet-28a(+)上,测序鉴定重组质粒.结果 该基因全长1 476 bp,编码区为141～1 617 bp,编码491个氨基酸;该基因为全长基因,无跨膜区,具有多个磷酸化位点,蛋白的理化性质稳定,理论分子量为56 436.3Da;没有质体、线粒体定位序列;十二烷基一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果表明,目的基因在大肠埃希菌BL21-DE3中表达成功.结论 筛选出牛带绦虫成虫精氨酰-Trna转移酶基因,成功构建重组原核表达质粒.     

细粒棘球蚴重组犛狋 犈犵．犳犲狉狉犻狋犻狀疫苗构建与免疫性分析

摘要：目的　探讨以减毒沙门菌为载体,构建表达细粒棘球蚴Ｅｇ．ｆｅｒｒｉｔｉ蛋白口服活载体疫苗的可行性。方
法　从细粒棘球蚴包囊中分离原头节, 超声粉碎后提取总ＲＮＡ, 通过ＲＴ ＰＣＲ 扩增细粒棘球蚴
犈犵．犳犲狉狉犻狋犻狀基因, 然后将犈犵．犳犲狉狉犻狋犻狀基因插入到ｐＹＡ３３４１ 表达载体中, 构建重组质粒ｐＹＡ３３４１
犈犵．犳犲狉狉犻狋犻狀,将重组质粒依次电转入减毒鼠伤寒沙门菌Ｘ３７７０ 和Ｘ４５５０,获得重组菌株犛狋 犈犵．犳犲狉狉犻狋犻狀,
对重组菌的稳定性、安全性以及免疫原性进行评价。结果　经酶切鉴定成功构建了重组质粒ｐＹＡ３３４１
犈犵．犳犲狉狉犻狋犻狀,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果证实Ｅｇ．ｆｅｒｒｉｔｉｎ蛋白在重组菌中获得了表达;重组菌株在体外至少传代１０次
而保证重组质粒不丢失;小鼠免疫试验证实,重组菌安全无毒性;重组菌口服免疫小鼠可检测到Ｅｇ．ｆｅｒｒｉｔｉｎ
特异性ＩｇＧ抗体。结论　本试验成功构建了能稳定表达细粒棘球蚴Ｅｇ．ｆｅｒｒｉｔｉｎ蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌
活载体疫苗株,并显示了良好的免疫原性和安全性,为包虫病新型口服基因工程活载体疫苗的研制奠定基础。
关键词：细粒棘球蚴;犈犵．犳犲狉狉犻狋犻狀;减毒鼠伤寒沙门菌;免疫原性
中图分类号：Ｒ３８３．３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９ ６６３９ （２０１４）０５ ０４９５ ０４     

戊型肝炎病毒嵌合蛋白的免疫应答的初步研究

目的：对含有HEV主要抗原表位的嵌合蛋白进行表达与纯化，并对其免疫原性进行研究。方法：将含有一段HEV ORF2基因片段（394-660aa）和HEVORF3全基因的表达质粒pHEV23在大肠杆菌中进行异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，其表达产物经Ni^2＋-NTA树脂亲和纯化，透析复性。纯化蛋白免疫小鼠，用ELISA检测小鼠血清IgG抗体，T细胞增殖反应检测细胞免疫应答。以Western-blot检测纯化蛋白对患者阳性血清的免疫反应性。结果：纯化蛋白的分子量为55KDa，纯度达90％以上；实验组特异性抗体水平明显高于对照组；T细胞增殖反应实验组与对照组比较有极显著性差异。纯化蛋白能与患者阳性血清呈特异反应。结论：嵌合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性，为进一步研究开发HEV诊断试剂盒及基因工程疫苗提供了基础。     

空肠弯曲菌peb1A基因的克隆表达及免疫性鉴定

目的:克隆空肠弯曲菌peb1A基因,构建其原核表达载体;鉴定重组表达产物的免疫原性。方法:PCR扩增空肠弯曲菌peb1A基因,构建pET-28a(+)-peb1A表达载体。转化E.coliBL21(DE3)后诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物。采用Ni-NTA亲和层析法收集表达的目的重组蛋白PEB1。采用CJ全菌抗体的Western blot鉴定rPEB1免疫反应性,双向免疫扩散试验鉴定rPEB1免疫家兔的抗血清效价。结果:所克隆的基因与报道的核苷酸序列同源性为99.9%,转化E.coliBL21(DE3)后,表达产物最高表达量占全菌总蛋白的33%左右,纯化后获得纯度为96%的重组蛋白。Western blot证实rPEB1能与CJ全菌抗体发生特异性免疫结合反应。兔抗rPEB1血清的双向免疫扩散效价为1:16。结论:成功地构建了高效表达载体pET-28a(+)-peb1A,并获得rPEB1,所表达的rPEB1具有良好的免疫原性和免疫反应性,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

Immunogenicity and protective efficacy of DnaJ (hsp40) of Streptococcus pneumoniae against lethal infection in mice

The present study was carried out to evaluate the immunogenicity and protective efficacy of DnaJ (hsp40) of Streptococcus pneumoniae, by cloning the full-length DnaJ of S. pneumoniae and expressing in heterologous host E. coli BL-21 (DE3). PCR amplified DnaJ was ligated in pQE-30 expression vector and subsequently transformed in E. coli DH5alpha strain. Cloning of DnaJ was confirmed by double digestion and PCR, followed by DNA sequencing. The His-tag containing recombinant protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography. To determine the immunogenicity of DnaJ, the mice (10 mice/group) were immunized by injecting 40 microg DnaJ protein/mouse i.p. There was a significant increase in IgG titres (2 x 10(5)) in mice immunized with DnaJ protein. Isotyping studies revealed that antibodies produced are predominantly IgG2a type indicating the predominance of Th1 response. A significant increase in lymphocyte proliferation was observed in mice immunized with DnaJ protein as compared to the control mice. Further, there was a significant increase in IL-2 and gamma-IFN levels in culture supernatants of splenocytes isolated from immunized mice. To determine the efficacy of DnaJ vaccination in eliciting protection, the mice were challenged with 1 x 10(5)cells of S. pneumoniae A66 type 3 capsular strain intra-nasally after 7 days of last immunization. All the control mice died within 2 days of post-infection, while 70% of animals immunized with DnaJ survived the lethal challenge by S. pneumoniae. The study reveals that immunization of mice with DnaJ elicits protective immunity against S. pneumoniae infection.     

结核分枝杆菌16KD重组蛋白的纯化及血清学诊断应用价值的研究

目的：纯化获得结核分枝杆菌重组16KD蛋白，并评价其在血清学诊断方面的应用价值。方法：应用亲和层析方法纯化结核分枝杆菌重组16KD蛋白，应用ELISA方法检测220例血清中的抗结核抗体。结果：结核分枝杆菌重组16KD蛋白以包涵体形式表达，以48名正常人血清0D492＋2S为正常限值，57例PPD阳性血清，47例菌阳结核患者血清和68例菌阴结核患者血清阳性检出率分别为19．30％、93．62％和82．35％。结论：结核分枝杆菌16KD重组蛋白以包涵体形式高效表达，具有较强的抗原特异性和免疫反应性。     

杆状病毒和分批补料发酵联用高效表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D

目的利用Bac-to-Bac表达系统和分批补料式培养技术在草地夜蛾昆虫细胞(Sf9)中高效表达重组单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D(HSV-2 gD2)。方法 以HSV-2基因组DNA为模板克隆全长gD2基因,利用Bac-to-Bac表达系统构建含目的基因的重组杆状病毒。同时采用分批补料式培养技术高密度培养Sf9细胞实现重组gD2蛋白的高效表达。构建豚鼠生殖器疱疹模型,研究重组HSV-2 gD2蛋白的免疫活性。结果在一个5 L生物反应器内,在15 mmol/L葡萄糖、0.4 g/L谷氨酰胺以及45%溶解氧的培养条件下,重组gD2蛋白的产量高达192 mg/L。此外,纯化后的重组gD2免疫能显著降低豚鼠生殖器疱疹模型的外阴皮损症状。结论 重组HSV-2 gD2蛋白利用杆状病毒和分批补料发酵联用得到高效表达,并表现出良好的免疫原性,为发展HSV-2疫苗奠定了基础。     

Construction and immunogenicity of recombinant adenovirus expressing ORF2 of PCV2 and porcine IFN gamma

The capsid structural protein encoded by the gene ORF2 of Porcine Circovirus Type 2 is critical for eliciting the broad protective immunity. We constructed and characterized the recombinant adenovirus encoding the capsid and porcine IFN gamma, designated as rAd-ORF2-IFN-γ. The construct was further confirmed by the enzyme digestion, PCR, sequencing and transfection. The humoural immunity to the capsid protein, induced by the recombinant in the mice, was tested by ELISA. Notably, this recombinant induced a much better ORF2-specific antibody response than that of rAd-ORF2 alone or the adenovirus itself. Clearly, the porcine IFN gamma could strongly enhance the immunogenicity of ORF2. The results showed that the recombinant adenovirus might be an attractive candidate vaccine for preventing the disease associated with PCV2 infection.     

Immunogenicity and protective effects of recombinant bivalent COVID-19 vaccine in mice and rhesus macaques

Coronavirus disease (COVID-19) is still spreading rapidly worldwide, and a safe, effective, and cheap vaccine is still required to combat the COVID-19 pandemic. Here, we report a recombinant bivalent COVID-19 vaccine containing the RBD proteins of the prototype strain and beta variant. Immunization studies in mice demonstrated that this bivalent vaccine had far greater immunogenicity than the ZF2001, a marketed monovalent recombinant protein COVID-19 vaccine, and exhibited good immunization effects against the original COVID-19 strain and various variants. Rhesus macaque challenge experiments showed that this bivalent vaccine drastically decreased the lung viral load and reduced lung lesions in SARS-CoV-2 (the causative virus of COVID-19)-infected rhesus macaques. In summary, this bivalent vaccine showed immunogenicity and protective efficacy that was far superior to the monovalent recombinant protein vaccine against the prototype strain and provided an important basis for developing broad-spectrum COVID-19 vaccines.     

鹦鹉热嗜衣原体CPSIT-0531融合蛋白原核表达载体的构建、表达及免疫原性检测

目的构建鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci,Cps)CPSIT-0531原核表达载体,表达并纯化该融合蛋白,检测其免疫原性。方法采用PCR技术从Cps 6BC基因组中扩增CPSIT-0531基因,并构建pET30a-CPSIT-0531原核表达载体,然后转化到宿主菌E.coli BL21中,IPTG诱导His-CPSIT-0531融合蛋白表达,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA分析His-CPSIT-0531蛋白的免疫原性。结果成功构建了pET30a-CPSIT-0531原核表达载体,并表达和纯化较稳定的重组蛋白;GST-CPSIT-0531免疫小鼠后,ELISA检测免疫小鼠的血清特异性抗体效价为1:640 000。结论成功克隆表达了His-CPSIT-0531,该蛋白具有较好的免疫原性。     

Immunogenicity of a foreign peptide expressed within a capsid protein of an attenuated coxsackievirus

The immunogenicity of soluble peptides can be improved by expression within recombinant microorganisms. The immunogenicity of a peptide expressed within a capsid protein of an attenuated coxsackievirus B4 was evaluated. The insertion site was chosen based on its antigenic structure. A foreign peptide was inserted into a region of the VP1 capsid protein that was identified as a T helper cell epitope. A recombinant virus containing ten amino acids of ovalbumin sequence was genetically stable and retained the biological and physical characteristics of the parental virus. The recombinant was able to elicit a T helper cell response against ovalbumin sequences. This study shows, for the first time, that coxsackievirus can be used as an expression vector and that insertion of heterologous peptides into an immunogenic region is a viable strategy for inducing T helper cell responses against foreign sequences. The implications of this work are that the attenuated coxsackievirus variant may be useful as a vaccine vector for expressing T helper cell epitopes that are important in inducing protective immunity.