两个遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症家系分子缺陷的初步探讨

目的：探讨两个遗传性凝血因子Ⅶ（FⅦ）缺乏症家系的基因突变类型。方法：用DNA直接测序法对2例患者及其家庭成员FⅦ基因进行分析；应用等位基因特异PCR（ASPCR）以及PCR辅助酶切反应鉴定是否有基因改变。结果：家系A中先证者有两种基因突变：6390位T→G导致Trp40Cys,11496位G→A导致Arg353Gln，这两个突变均为杂合子；PCR辅助MspⅠ酶切证实其母亲也是杂合子Arg353Gln。家系B的先证者有11482T→G，导致His348Gln,PCR辅助NspⅠ酶切证实称证者及其女含有同样的杂保子基因突变，不安现有11514位C→T导致Thr359Met,ASPCR证实先证者及其子携带同样的杂合子突变基因。结论：在两个遗传性FⅦ缺乏症家系中找到3种FⅦ基因的错义突变，其中Trp40Cys为首次报道。     

1例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系基因突变分析

目的对1例姑表近亲结婚的遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症家系进行实验室表型诊断和基因突变检测,以期寻找致病基因并初步探讨其分子发病机制。方法检测先证者及其相关家系成员(共3代8人)的血浆凝血酶原时间(PT)、FⅦ活性(FⅦ:C)、FⅦ抗原(FⅦ:Ag)等指标。采用DNA直接测序法对先证者F7基因9个外显子及其侧翼序列、5'和3'非翻译区进行片段扩增测序,发现突变位点后用反向测序予以证实,并检测家系成员相应的突变位点区域。采用ClustalW软件分析氨基酸序列保守性,用PROVEAN、Pyolphen和Mutation Taster等在线生物信息学软件预测突变位点对蛋白质功能可能存在的潜在影响。利用Swiss-pdb Viewer软件分析FⅦ蛋白模型野生型和突变型局部空间构型及分子间作用力的变化。结果先证者PT为31.2 s,明显延长;FⅦ:C和FⅦ:Ag分别为4%和6%,较健康人对照降低;先证者母亲、父亲、大姐、二姐和哥哥PT值均稍延长,FⅦ:C和FⅦ:Ag均下降至健康人对照的一半左右。基因检测结果显示先证者F7基因第8外显子存在c.1224 T>G纯合错义突变导致p.His348Gln,其母亲、父亲、大姐、二姐和哥哥均存在c.1224 T>G杂合错义突变。His348位点在同源物种中高度保守;生物信息学软件预测显示该突变位点会影响蛋白质功能;蛋白质模型分析显示,该突变位点可导致His348和Thr359以及Gly360之间形成的氢键数目减少,可影响蛋白质结构的稳定性。结论先证者的F7基因存在c.1224 T>G纯合错义突变导致p.His348Gln,该突变位点分别来自其近亲婚配的父母,并与其FⅦ水平降低有关。     

四个遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症家系基因分析

目的 探讨4个遗传性凝血因子Ⅻ(FⅫ)缺陷症家系基因突变及分子发病机制.方法 检测凝血酶原时间(PT)、APTT、FⅫ促凝活性(FⅫ∶C)和FⅫ抗原(FⅫ∶ Ag)等凝血指标;PCR扩增FⅫ基因的全部外显子及侧翼序列,PCR产物纯化后测序;在野生型pIRES2-EGFP FⅫ表达质粒上构建突变体FⅫ表达质粒,瞬时转染COS7细胞,测定细胞裂解液和培养上清中FⅫ∶Ag水平和FⅫ∶C.结果 4例先证者APPT均明显延长,FⅫ∶C均＜2％,FⅫ∶Ag亦同步下降至1％.4个家系均检出常见的FⅫ46C/T多态性.家系A先证者检出5741-5742delCA(His101Gln)及7142insertC(Lys346Gln)双重杂合突变;家系B先证者检出6800-6808de19bp杂合缺失突变.FⅫ6800-6808de19bp瞬时转染结果显示,在细胞裂解液中突变体FⅫ∶Ag为野生型的85.6％;在细胞培养上清中突变体FⅫ∶Ag为野生型的51.9％,FⅫ∶C为野生型的56.4％;家系C先证者检出8699G＞ A(Gly542Ser)杂合突变;家系D先证者检出8699G＞A(Gly542Ser)纯合突变(其父母为近亲结婚).结论 4个遗传性FⅫ缺陷症家系除有46C/T多态性外,共发现g.5741-5742delCA、g.7142insertC、g.6800-6808de19bp、g.8699G＞A 4种基因突变.其中g.5741-5742delCA和g.6800-6808de19bp为两种新的突变.FⅫ6800-6808de19bp体外表达显示,FⅫ6800-6808de19bp突变蛋白合成基本正常,但存在蛋白分泌障碍.     

9例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者的基因诊断与表型分析

目的探讨9例遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症患者的基因突变类型与临床特征。方法采用一期法检测患者的FⅦ活性(FⅦ:C),用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其FⅦ抗原(FⅦ:Ag)水平,并抽提患者的外周血基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)扩增FⅦ基因所有外显子及其侧翼序列,采用DNA直接测序进行基因分析。结果在9例遗传性FⅦ缺陷症患者中发现10种基因突变,包括3种剪切位点突变和7种错义突变。1例患者为p.Tyr128(68)Cys纯合突变,其FⅦ:C为0.8%,FⅦ:Ag为2.5%,临床表型为反复重度出血;5例患者携带FⅦ基因双杂合突变,分别为p.Thr241(181)Asn和p.Gly406(346)Asn、IVS1a+5GA和p.His408(348)Gln、IVS5-1GA和p.His408(348)Gln、c.*64GA合并p.Ile213(153)Asn、p.Cys389(329)Gly和p.His408(348)Gln的双杂合突变,其相应的FⅦ:C分别为1.2%、4.4%、1.0%、0.5%和1.2%,患者临床出血症状轻重不一;3例患者携带杂合突变,分别为p.Cys389(329)Gly、p.His408(348)Gln和p.Thr419(359)Met,其FⅦ:C分别为0.5%、8.3%和9.4%,第1位有出血史,后2位无明显出血。结论在9例遗传性FⅦ缺陷症患者中发现了10种基因突变,其中p.Gly406(346)Asn、c.*64GA、p.Ile213(153)Asn为新发现突变。p.His408(348)Gln突变较常见,而FⅦ:C与患者的临床表型间无相关性。     

遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症研究进展

遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症是一种常染色体隐性遗传病，是由凝血因子Ⅶ基因突变所致。体外测定凝血因子Ⅶ:C与临床表型无明显的相关性。而基因突变能够较好地解释其临床表型。     

遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系中R152Q及IVS6+1G→T突变的鉴定

目的检测1个遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系中因子Ⅶ基因的突变。方法应用PCR结合直接测序的方法对先证者的因子Ⅶ基因9个外显子及其侧翼序列进行分析，鉴别其中可能存在的基因变异。应用PCR产物反向测序法或PCR限制性内切酶分析技术对突变位点进行确证。随机选取100名健康体检者作为正常对照。结果先证者FⅦ基因第6外显子和第6内含子分别存在R152Q和IVS6＋1G→T杂合突变，家系分析表明这2个突变是双重杂合子型，前者遗传自父亲，后者遗传自母亲。100名健康对照者均未发现R152Q错义突变。结论FⅦ基因第6外显子R152Q错义突变和第6内含子供体剪接位点IVS6＋1G→T突变可能是先证者因子Ⅶ先天性缺陷的原因。     

遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症研究进展

遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症是一种常染色体隐性遗传病 ,是由凝血因子Ⅶ基因突变所致。体外测定凝血因子Ⅶ :C与临床表型无明显的相关性。而基因突变能够较好地解释其临床表型     

一个遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系两种新的基因突变

目的 探讨遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症的分子发病机制.方法 用DNA直接测序法对1例FⅦ缺陷症家系成员FⅦ基因进行分析;将含突变序列克隆插入pMD19-T Simple TA载体中,对所得两条染色体相应序列分别测序,以确定不同突变在染色体上的分布.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和凝固法检测血浆中FⅦ:Ag和FⅦ:C.结果 家系中有3种基因突变:第8号外显子第15386位核苷酸存在A→C(Arg353Pro)和第15386位核苷酸G→C(Gln353Pro)突变;第8号外显子第15274位核苷酸A→T(Lys316Stop)突变,家系成员中发现的这3种突变均为杂合子;发现先证者父亲存在3种杂合多态性:即启动子区2050～2059位CCTATACCT 10 bp的缺失/插入多态性、1号内含子IVS1a+9 G→A及第15386位A→G(Arg353Gln),且均来自先证者祖父,3种多态性位于同一条染色体上.结论 发现该家系存在1种FⅦ基因的错义突变(Gln353Pro);1种无义突变(Lys316Stop),这两种突变均为国际上首次报道的新突变.

Abstract：

Objective To explore the mutations of coagulation factor Ⅶ ( F Ⅶ ) gene in one pedigree with hereditary F Ⅶ deficiency, and to investigate the molecular mechanisms of F Ⅶdeficiency. Methods FⅦ gene mutations were analysed in the pedigree by direct DNA sequencing. The mutated DNA fragments were cloned into pMD19-T simple TA vector, and sequenced to confirm their distribution on chromosome. The plasma activity of F Ⅶ of the probands and their family members was detected with coagulation assay. The antigen of F Ⅶ were identified with ELISA. Results Three gene mutations were detected in the pedigree: A/G to C at 15386 resulting in Arg353Pro/Gln353Pro, A to T at 15274 resulting in Lys316Stop, all three mutations were heterozygotes. Three kinds of polymorphisms were identified in his father: A to G transition at position 15386 resulting in Arg353Gln, heterozygotic deletion of 2050 -2059 cctatatcct in promoter and G to A mutation in intron 1a, the same polymorphisms were found in his grandfather. The three polymorphisms were located in the same chromosome of his father. Conclusion Two mutations were found in the pedigree with hereditary FⅦ deficiency. One is nonsense mutation( Lys316Stop), the other is missense one(Gln353Pro).Gln353Pro and Lys316Stop might be the molecular mechanisms of FⅦ deficiency. The two novel mutations were reported for the first time in the literature.     

一个遗传性凝血因子Ⅶ与X联合缺陷症家系的基因分析

目的 对1例遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)与因子X(FX)联合缺陷患者进行基因分析和家系调查,鉴定导致FⅦ与FX联合缺陷症的基因突变.方法 检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原、FⅦ促凝活性(FⅦ:C)、FX:C及FⅦ抗原(FⅦ:Ag)、FX:Ag等进行表型诊断;用DNA直接测序法分析先证者FⅦ、FX基因的全部外显子、侧翼、5’和3’非翻译区及家系成员相应的突变位点区域;选择106名健康体检者作对照.结果 先证者PT、APTT延长,分别为84.5 s和63.4 s,FⅦ:C、FⅦ:Ag和FX:C、FX:Ag分别为6％、7％和4％、30％;先证者父亲、母亲、姐姐的PT稍延长,FⅦ:C分别为72％、47％、42％,FX:C分别为76％、54％、47％,FX:Ag分别为100％、69％、58％,其APTT、FⅦ:Ag均无明显异常.先证者FⅦ基因外显子8的g.11267C→T纯合突变导致Arg277Cys,FX基因外显子8的g.28139G→T纯合突变导致Val384Phe;其父亲、母亲、姐姐均存在FⅦ基因g.11267C→T和FX基因g.28139G→T杂合子.结论 FⅦ和FX基因分别存在的Arg277Cys、VM384Phe纯合突变是导致先证者FⅦ与FX联合缺陷的分子机制;Val384Phe突变为国际首次报道,推测可能影响FX蛋白合成或分泌功能.     

一个遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系的基因与表型分析

目的:研究遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷家系基因与表型的特点。方法:一个遗传性FⅦ缺乏家系19名成员的FⅦ及其他凝血因子促凝活性检测和用PCR及DNA序列检测FⅦ基因缺陷,初步探讨遗传性FⅦ缺乏的血液凝固变化。结果:在这一家系中,FⅦ缺乏伴FⅫ∶C下降或FX∶C增高的,在临床上无明显出血现象;FⅦ缺乏症与其基因10827核苷酸C→T突变有关。结论:遗传性FⅦ缺乏发生临床出血除与FⅦ∶C水平有关外,还可能与FⅫ∶C和FⅩ∶C变化引起的凝血和纤溶活性改变有关。     

10例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症分子发病机制与临床特性分析

目的探讨10例遗传性凝血因子Ⅶ(coagulation factor Ⅶ，FⅦ)缺陷症基因突变类型与临床特性。方法 检测凝血指标以明确诊断；用DNA直接测序法对先证者及其家庭成员FⅦ基因的全部外显子及其侧翼、5’和3’非翻译区进行分析，寻找基因突变；将含插入或缺失突变序列克隆人pMD18-T TA克隆载体中，对所得两条染色体相应序列分别测序，以确定突变在染色体上的分布。应用限制性内切酶对先证者及家系成员相应基因片段进行酶切分析，无酶切位点改变的基因片段用等位基因特异的PER(ASPCR)方法，证实测序所发现的突变。结果 在10例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者中发现8种类型的基因突变，其中6390T→C(Phe40Cys)，9482G→T(Argl52Leu)，和11487．9delC3种突变为国际首次报道；6种突变发生在催化区；除一种缺失突变外，其余均为点突变；所有的基因突变都来自先证者的父亲和(或)母亲。Thr359Met和Arg304Trp突变分别在4个及2个无亲缘关系的家系中重复出现。2例Thr359Met纯合突变(FⅦ：C分别为2％和3％)及1例Argl52Leu、11487-9delC及Arg304Trp复合杂合突变(FⅦ：C为1％)临床表型为重型；2例双重杂合突变(His348Gln和Thr359Met，Agr304Trp和Arg304Gln)临床表型分别为中型和无症状(FⅦ：C分别为3．4％和10％)。4例杂合突变(Phe40Cys伴有Arg353Gln杂合多态性、Thr359Met、Arg152Gln、-55C→T)FⅦ：C分别为1％、3．0％、1％、5．5％，临床表型为中型或轻型；1例-323P0／P10、73G→A及Arg353Gln复合杂合多态性(FⅦ：C为1％)的临床表型为轻型。结论 在10例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者中发现了8种类型的FⅦ基因突变，其中3种为新突变。中国汉族人中存在导致FⅦ基因缺陷的突变热点。纯合及双杂合FⅦ基因突变FⅦ：C较低，临床出血常较重；特定的杂合突变可有临床出血倾向，FⅦ基因突变与FⅦ：C及临床表型无明显的相关性。     

遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者表型与基因型分析

目的:对1例遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症患者进行表型与基因型分析,探讨其致病机制。方法:检测患者血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT),并对其FⅦ促凝活性(FⅦ:C)、FⅦ抗原(FⅦ:Ag)等进行表型诊断;采用DNA直接测序法对患者FⅦ基因的全部外显子及侧翼、启动子区进行分析,寻找基因突变,反向测序证实所发现的突变。结果:患者的PT、FⅦ:C和FⅦ:Ag明显异常,分别为26.5s、6.0%和2.1%。患者FⅦ基因外显子1a存在27delCT杂合突变,引起读码框移位,导致终止密码子提前出现,产生截短蛋白。结论:27delCT突变是影响该患者表型的主要因素。     

一个遗传性凝血因子ⅩⅢ缺陷症家系新的基因异常

目的对1例遗传性凝血因子Ⅻ（FⅫ）缺陷症家系进行基因分析，探讨其发病的分子机制。方法用尿素溶解法和Berichrom kit检测患者及其家系成员血浆FⅫ的活性．用火箭电泳和酶联免疫吸附试验测定FⅫ抗原含量。PCR法扩增FⅫA基因的所有外显子和侧翼序列．DNA测序分析基因异常，用直接测序法和限制性内切酶（SfaNⅠ、NspⅠ）分析80名正常人相应序列的PCR产物以排除基因多态性。应用生物信息学软件对所鉴定的突变进行分子模建，探讨其致病的分子机制。结果患者纤维蛋白凝块在5mol／L尿素中30min内完全溶解，加入正常人血浆后则24h不溶解，患者血浆FⅫ活性为0，FⅫA抗原含量〈2％，FⅫB抗原含量在正常范围。家系成员中其父母和外祖母血浆FⅫ活性和FⅫA抗原约为正常人一半。在患者FⅫA基因外显子15中发现两处杂合异常，分别位于177246位碱基（C→T，导：致Arg703→Trp）和177286位碱摹（A→G，导致His716→Arg），直接测序和酶切分析两种方法均排除了基因多态性。患者的母亲与外祖母为Arg703→Trp杂合子，患者的父亲为His716→Arg杂合子．分子模建分析表明，Arg703和His716两个位点突变后均可导致barrel2与core结构域之间距离和结合能力的政变，使蛋白质发生错误折叠，稳定性降低。His716→Arg还可能影响酶的催化活性基因的空间结构形成。结论FⅫA基因外显子15上Arg703→Trp、His716→Arg复合杂合突变影响了蛋白质的正确折叠和稳定性，造成患者FⅫ抗原和活性的缺失。此复合杂合错义突变是一种未报道过的新的突变类型。     

纯合子Thr359Met导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症家系分析

目的 探讨一个遗传性FⅦ缺乏症家系的基因突变模型。方法 检测FⅦ：Ag,FⅦ:C,F,Ⅶa，并对缺陷进行分型；用DNA直接测序法对先证及其家庭成员FⅦ基因的全部外显子及其侧翼进行分析；用蛋白质分子模型模拟软件对基因突变的生物结构病理学进行分析。结果 先证FⅦ基因外显子8的11514位为纯合子C→T导致氨基酸Thr359Met；父母与及其子均为杂合子Thr359Met；Thr359Met导致CRM－型缺陷；蛋白质空间构型模拟分析发现，Thr359Met导致蛋白质空间构型发生改变，有较大侧链的Met置换了Thr后引起空间位阻，同时氢键数目也发生改变。结论 该遗传性FⅦ缺乏症家系为纯合子错义突变Thr359Met；推测此突变影响了蛋白质分子的空间构型，从而生异常FⅦ蛋白的功能。     

遗传性凝血因子ⅩⅢ缺陷症家系致病基因突变的鉴定

目的 分析一个遗传性凝血因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)缺陷症家系中FⅩⅢ基因缺陷.方法 应用PCR结合直接测序法对先证者的FⅩⅢA链基因15个外显子及其侧翼序列进行分析,鉴别其中可能存在的基因变异.应用等位基因特异性扩增法或PCR限制性内切酶分析法,对该家系其他成员及100名健康体检者的FⅩⅢA基因进行检测.结果 先证者FⅩⅢA基因第3外显子和第4外显子分别存在Arg77Cys错义突变和Arg174stop无义突变,后者是人FⅩⅢA基因一种新突变.家系分析表明这2个突变是双重杂合子型,Arg77Cys突变遗传自父亲,Arg174stop突变遗传自母亲.先证者女儿携带Arg77Cys错义突变.先证者丈夫及100名健康对照者均未发现Arg77Cys错义突变和Arg174stop无义突变.结论 发现人FⅩⅢA基因的一种新突变,即Arg174stop无义突变,并对此突变成功地运用了PCR限制性片段长度多态性方法 检测.先证者FⅩⅢA基因同时存在Arg77Cys错义突变和Arg174stop无义突变,可能是其FⅩⅢ先天性缺陷的原因.     

凝血因子Ⅶ C329G突变导致遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症

目的探讨遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症发病的分子机制。方法将野生型和C329G突变型的FⅦ真核表达载体转染BHK-21细胞进行体外表达,并对表达产物进行免疫学和凝血活性检测。结果FⅦC329G突变后,其蛋白的合成和分泌不受影响,突变型与野生型FⅦ的表达量相近,但突变型FⅦ无凝血活性。结论FⅦ第329位的半胱氨酸对其凝血活性功能起关键作用。当它被甘氨酸替换后,即丧失其凝血活性,此为FⅦC329G突变导致遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症发病的分子机制。     

遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症研究进展

凝血因子Ⅴ是凝血过程中重要的辅因子。除了凝血功能,FⅤ也通过辅助活化蛋白C下调活化因子Ⅷ间接参与生理性抗凝旁路途径。FⅤ的这一双重作用,使得FⅤ基因缺陷可能导致出血或血栓,形成两种完全相反的表型。本文着重就FⅤ引起遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症的分子发病机制及其与临床表型的关系作一综述。     

两个遗传性凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺陷症家系FⅪ基因突变分析

目的　检测两个中国汉族人遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系中FⅪ基因的突变。方法　检测先证者及家系成员血浆FⅪ∶C及FⅪ∶Ag ,并以其外周血单个核细胞中提取的基因组DNA为模板 ,PCR扩增FⅪ基因的所有外显子及其侧翼内含子序列 ,用DNA测序仪检测FⅪ的基因突变。结果　在两个家系中共发现三种基因突变 ,Trp2 2 8stop、Glu32 3Lys和Leu172Pro ,均为杂合型 ,且Leu172Pro为两个家系所共有。结论　三种FⅪ基因突变Trp2 2 8stop、Glu32 3Lys和Leu172Pro是导致中国人遗传性FⅪ缺陷的分子发病机制之一 ,突变Leu172Pro为国际首次发现。