黄芪诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的实验研究

目的 研究原代人脐带间充质干细胞(UCMSCs)的生物学特性及其体外向神经细胞诱导分化的条件,为组织化人工神经的制备提供干细胞资源.方法 无菌条件下从人脐带华尔通胶(Wharton jelly)分离并贴壁培养人UCMSCs,免疫组化技术检测UCMSCs表面特异标志物表达;四组细胞分别加入单纯培养液空白对照组(A组)、单纯生长因子诱导组(B组)、单纯黄芪诱导组(C组)和黄芪联合生长因子诱导液(D组),倒置显微镜下观察其形态并检测NSE、NF和GFAP的阳性表达,结果进行统计学分析.结果 人UCMSCs表面标记CD29、CD44、CD105强阳性,CD106弱阳性,CD34、CD45阴性,符合人UCMSCs的特征;人UCMSCs经黄芪诱导后细胞表面GFAP、NSE均为强阳性表达.结论 人UCMSCs可以在体外采用组织块贴壁培养法培养成功,黄芪可将人UCMSCs成功的诱导为神经样细胞,为组织化人工神经的制备和周围神经缺损的治疗提供了新的方法.     

黄芪诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的实验研究

目的 研究原代人脐带间充质干细胞(UCMSCs)的生物学特性及其体外向神经细胞诱导分化的条件,为组织化人工神经的制备提供干细胞资源.方法 无菌条件下从人脐带华尔通胶(Wharton jelly)分离并贴壁培养人UCMSCs,免疫组化技术检测UCMSCs表面特异标志物表达;四组细胞分别加入单纯培养液空白对照组(A组)、单纯生长因子诱导组(B组)、单纯黄芪诱导组(C组)和黄芪联合生长因子诱导液(D组),倒置显微镜下观察其形态并检测NSE、NF和GFAP的阳性表达,结果进行统计学分析.结果 人UCMSCs表面标记CD29、CD44、CD105强阳性,CD106弱阳性,CD34、CD45阴性,符合人UCMSCs的特征;人UCMSCs经黄芪诱导后细胞表面GFAP、NSE均为强阳性表达.结论 人UCMSCs可以在体外采用组织块贴壁培养法培养成功,黄芪可将人UCMSCs成功的诱导为神经样细胞,为组织化人工神经的制备和周围神经缺损的治疗提供了新的方法.     

黄连素体外诱导人脐带间充质干细胞向神经样细胞定向分化的实验研究

目的:探讨黄连素体外诱导人脐带间充质干细胞(hUMSCs)向神经细胞分化的作用。方法:体外对hUMSCs进行培养,以不同浓度黄连素(分4组：对照组即0 mg/L组、50 mg/L组、100 mg/L组和200 mg/L组)诱导其向神经样细胞分化,显微镜下观察细胞形态改变并记录,并通过细胞免疫化学及免疫荧光技术检测细胞表...     

条件培养液诱导人脐带间充质干细胞分化为Leydig细胞的实验研究

目的:探讨睾丸Leydig细胞(LC)来源的条件培养液诱导人脐带间充质干细胞(Hu MSCs)分化为LC的可行性。方法:用贴壁法和酶消化法分别分离培养Hu MSCs和LC。用LC来源的条件培养液诱导Hu MSCs,诱导前的Hu MSCs作为对照。培养3、7、10 d后,对干细胞进行RT-PCR检测LHR、St AR和3β-HSD的mRNA表达;培养2周后,对诱导后的干细胞进行CYP11A1、CYP17A1和3β-HSD免疫荧光检测;培养4周后,Western印迹检测3β-HSD。结果:干细胞诱导3、7、10 d后,RT-PCR发现LHR、St AR及3β-HSD表达阳性;诱导2周后,免疫荧光检测发现CYP11A1、CYP17A1、3β-HSD表达阳性;诱导4周后,Western印迹检测发现3β-HSD表达阳性。对照组各项检测均为阴性。结论:在LC来源的条件培养液诱导下,Hu MSCs具有向合成类固醇激素的细胞分化的可能,并最终可能分化为LC。     

淫羊藿苷诱导人脐带间充质干细胞分化为成骨细胞的实验研究

目的 研究淫羊藿苷对脐带间充质干细胞的生物学作用,以及诱导其向成骨细胞分化.方法体外分离、培养及扩增人脐带间充质干细胞,免疫组化技术检测人脐带间充质干细胞(huCMSCs)表面特异标志物表达.取第3代细胞,设立2组,空白对照组加入基础培养基,实验组加入淫羊藿苷诱导.用倒置光学显微镜、碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测定细胞.进行对比,研究人脐带间充质干细胞增殖和分化规律.结果 免疫组化结果显示huCMSCs表面标记CD44、CD34阴性,检测结果符合huCMSCs的特征.随着培养天数的增加,淫羊藿苷组诱导后细胞液中成骨细胞特征性碱性磷酸酶强阳性表达及钙沉积.淫羊藿苷组细胞内ALP含量与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 huCMSCs可以在体外采用组织块贴壁培养法培养成功,淫羊藿苷对人脐带间充质干细胞的增殖和成骨分化具有促进作用,可作为骨性诱导因子.

Abstract：

Objective To study the biological effect of Icariine on human umbilical cord derived mesenchymal stem cells(huCMSCs) and inducing them to differentiate into osteoblasts. Methods MSCs were isolated and expanded in vitro and their surface antigens of huCMSCs were detected by immunohistochemistry. HuCMSCs were assigned into two groups. In the blank control group, huMSCs were incubated in basic medium. In the experimental group huMSCs were incubated in Icariine medium, The proliferation and differentiation of huMSCs were examined by inverted microscope, Alkaline phosphatase (ALP) staining and the determination of ALP activities. Results HuCMSCs were strongly positive for CD44, and negative for CD34; strongly positive expression for ALP and calcium deposition was detected from the second day to the fourth day in Icariine group; blank control group and Icariine group had significant differences (P ＜ 0.05).Conclusion HuCMSCs can be successfully cultured from the adherent tissue pieces, Icariine enhances proliferation and osteogenic differentiation of huCMSCs and be used as an osteoinductive factor.     

人脐带间充质干细胞向血管内皮祖细胞诱导分化的实验研究

目的探讨人脐带间充质干细胞定向诱导分化为血管内皮祖细胞的可行性,为构建组织工程血管瓣膜内皮化提供新的细胞来源。方法无菌条件下取剖宫产新生儿脐带,复合胶原酶消化法获取脐带间充质干细胞进行培养,以流式细胞仪检测脐带间充质细胞的表面标志。取扩增3～6代的脐带间充质干细胞用VEGF和b-FGF诱导分化。用免疫荧光法鉴定内皮祖细胞的标志。结果脐带间充质干细胞可以诱导分化为血管内皮样细胞,表达CD34、CD133和vWF,且Dil-acLDL实验阳性。结论脐带间充质干细胞可以诱导分化为血管内皮祖细胞,可为构建组织工程血管瓣膜提供新的种子细胞来源。     

低氧对人脐带间充质干细胞成脂肪分化的影响

目的：研究低氧（2%O2）对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）成脂肪分化的影响,为脂肪组织工程种子细胞的筛选提供实验依据。方法：培养条件有低氧（2%O2）、常氧（20%O2）、10%FBS完全培养基（GM）、10%FBS成脂培养基（DM）;将第3代hUCMSCs根据培养条件分为3组,对照组（常氧＋GM5天,常氧＋DM2周）、实验组1（低氧＋GM5天,低氧＋DM2周）、实验组2（低氧＋GM5天,常氧＋DM2周）;在诱导后2周分别进行油红O染色并观察其成脂效率。结果：与对照组相比,实验组1脂肪样细胞数量明显减少,实验组2脂肪样细胞数量明显增加。结论：将hUCMSCs预先进行低氧处理再转换为常氧培养可显著提高其成脂分化能力。     

人脐带间充质干细胞应用研究进展

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于中胚层的一种具有自我更新多向分化潜能的成体干细胞,存在于全身结缔组织和器官间质中.人脐带间充质干细胞成功克服了骨髓间充质干细胞含量低、受年龄影响大等诸多限制,而且具有来源广泛、免疫原性低等优点.Mitchell[1]首次自脐带华尔通氏胶中成功地分离出成纤维样细胞并证实其具有多能干细胞的分化潜能以后,对于脐带来源的MSCs便引起了人们的广泛关注.近年来实验研究表明脐带间充质干细胞在组织工程、神经系统、肝脏疾病、心血管系统、免疫疾病、肿瘤疾病等方面取得了巨大的进展.本文主要在脐带间充质干细胞应用方面予以综述.     

复方麝香注射液在人脐带间充质干细胞神经分化中的作用

目的 观察复方麝香注射液在体外对人脐带间充质干细胞(hUMSCs)神经分化的影响.方法 取足月妊娠剖宫产健康新牛儿脐带,获取间充质干细胞,采用流式细胞术进行细胞表型鉴定.以碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24 h,再以含5、10、15、20、25g/L复方麝香注射液的无血清培养基进行神经分化诱导,采用免疫细胞化学检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微观相关蛋白-2(MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果 流式细胞检测显示hUMSCs表达CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166和HLA-ABC抗原,不表达CD31、CD34、CD38、CD45、CD133和HLA-DR抗原.经不同浓度复方麝香注射液诱导5 d后,各诱导组中均出现神经样细胞.5、10、15、20、25 g/L组显微镜每随机视野中NSE阳性细胞数分别为19.00±3.61、66.60±5.37、60.20±10.06、44.80±9.44、47.80±10.45,MAP-2阳性细胞数分别为9.20±3.27、53.40±10.92、59.40±10.41、46.60±8.88、46.80±8.93.以10 g/L和15 g/L组中的NSE、MAP-2阳性细胞数为最多.各诱导组中仅极少数细胞呈GAFP弱阳性.结论 人脐带富含问充质干细胞(MSCs),适量复方麝香注射液可有效诱导人脐带间充质干细胞分化为神经元细胞.     

人脐带间充质干细胞在大鼠睾丸间质内向Leydig细胞分化的实验研究

目的:研究人脐带间充质干细胞(HUMSCs)在大鼠睾丸间质内向Leydig细胞分化的可行性。方法:贴壁法获得HUMSCs,分别通过流式细胞表面抗原染色与三系分化验证其纯度与多向分化能力,用CM-Dil标记HUMSCs后将其移植入大鼠睾丸间质内,并在移植后4周与8周对大鼠睾丸进行免疫荧光染色观察HUMSCs的存活与分化情况,移植后8周获得大鼠睾丸细胞悬液,通过流式细胞染色检测HUMSCs表达Leydig细胞标志物3β-HSD判断细胞分化的效率,通过流式细胞分选获得悬液内CM-Dil标记的在睾丸内分化后的HUMSCs,并对其进行培养,培养3 d后收集培养液,检测其睾酮水平。结果:Leydig细胞标志物CYP11a1在HUMSCs移植8周后有表达,而在移植4周后未见表达。3β-HSD流式染色显示其分化效率约为14.5%,流式细胞分选后细胞可存活,且其培养液内能检测出睾酮。结论:HUMSCs在大鼠睾丸间质内可向Leydig细胞分化。     

人脐血间充质干细胞修复大鼠坐骨神经损伤的实验研究

目的 评价用人脐血间充质干细胞(HUCBMSCs)构建组织工程化人工神经修复大鼠坐骨神经10 mm缺损的治疗效果. 方法 用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的MesencultTM进行培养获得MSCs.30只SD大鼠随机分为3组,每组10只.A组:将HUCBMSCs与生物蛋白胶混合,种植于羊膜管中修复坐骨神经缺损;B组:仅将生物蛋白胶种植于羊膜管中:C组:坐骨神经切下后再将其缝合.9周后,行大体观察、坐骨神经功能指数、腓肠肌湿重测定、组织学染色,S100免疫组化染色等检查. 结果 32份脐血18份可培养出MSCs,但传代培养大量扩增只有4份.HUCBMSCs植人手术后9周检查结果显示,坐骨神经功能指数、腓肠肌湿重测定A组(-64.2234±2.9461、41.29524±3.88421)优于B组(-74.5882±3.3298、28.34097±3.42889),差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 人脐血中含有MSCs并且能够分离培养扩增,HUCBMSCs能够促进大鼠坐骨神经损伤的神经再生.     

脐带间充质干细胞向汗腺样细胞分化后的表型变化

目的：比较人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）向汗腺样细胞诱导前后表型特征的变化.方法：对hUC-MSCs进行分离、培养、鉴定,通过显微镜观察、免疫细胞化学、流式细胞术等方法比较hUC-MSCs经汗腺分化诱导培养液培养前后细胞形态变化及癌胚抗原（CEA）、角蛋白7（CK7）、CK8、CK14、CK18、CK19表达的差异.结果：hUC-MSCs向汗腺样细胞诱导前呈梭形,呈成纤维细胞样;流式细胞仪检测发现CD29、CD90表达阳性;而CD34、CEA、CK14、CK19表达阴性.经汗腺诱导培养基诱导后hUC-MSCs分化为外形肥大、不规则、类似铺路石样的细胞,聚集性增殖;免疫细胞化学检测显示CK7、CK8、CK18抗原表达阳性;流式细胞仪检测结果显示CEA、CK14、CK19的阳性表达率分别为77.98%,48.47%,20.85%.结论：hUC-MSCs经过汗腺分化诱导培养基培养后能够分化为表达汗腺细胞标记物抗原的汗腺样细胞.     

人脐带间充质干细胞与蚕丝素多孔支架的体外复合培养

目的观察蚕丝素多孔支架对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）吸附作用及支架对hUCMSCs形态、功能及活性的影响,为脂肪组织工程支架选择提供实验依据。方法将hUCMSCs制成细胞悬液接种在蚕丝素多孔支架,荧光倒置相差显微镜、扫描电镜和四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察hUCMSCs的吸附和生长情况。结果培养1～2d后可见hUCMSCs与蚕丝素多孔支架充分附着。培养5～7d细胞生长增殖十分活跃,10d左右时,蚕丝素多孔支架孔中hUCMSCs成片状融合。荧光倒置相差显微镜和扫描电镜见细胞与支架黏附良好并有大量基质分泌,且活性指标与正常培养的hUCMSCs比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论蚕丝素多孔支架对hUCMSCs具有良好的吸附作用,并能维持其正常形态、功能及活性,蚕丝素多孔支架是hUCMSCs三维立体培养时的良好天然支架。     

人脐带间充质干细胞用于衰老相关疾病治疗的研究进展

随着干细胞移植技术的发展,通过输入干细胞进行抗衰老治疗或治疗退行性疾病成为人们研究的热点。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs)是一种存在于脐带沃顿胶以及血管周围组织中的独特前体细胞,具有自我更新和多向分化潜能。目前大量科学研究显示HUCMSCs通过再生和修复衰老的细胞、组织和器官达到抗衰老作用。该文对HUCMSCs的生物学特性、组织再生修复作用和抗衰老治疗机制的研究进展进行了详细回顾,并对目前HUCMSCs临床前研究现况进行了总结,提示HUCMSCs是一种具有良好应用潜力和价值的干细胞类型。     

人脐带间充质干细胞复合去细胞神经基膜管修复大鼠坐骨神经缺损

目的 探讨诱导后的脐带间充质干细胞作为组织工程种子细胞修复大鼠坐骨神经缺损的可行性.方法 从正常足月新生儿脐带中分离培养间充质干细胞并诱导分化为神经样细胞,与去细胞神经基膜管共培养以构建组织工程神经;用30只健康成年雄性SD大鼠建立坐骨神经缺损(10 mm)的动物模型并随机分成3组:A组为脐带间充质干细胞复合去细胞神经基膜管组,B组为单纯去细胞神经基膜管组,C组为自体神经桥接组.术后10周通过神经电生理检测、组织学观察等评测效果.结果 在局部观察和肌肉测量、神经电生理检测、组织学观察等方面,脐带间充质干细胞复合去细胞神经基膜管组(A组)神经再生及肢体功能情况良好,效果接近于自体神经桥接组(C组),明显优于单纯去细胞神经基膜管组(B组).结论 脐带间充质干细胞复合去细胞神经基膜管构建的组织工程神经可有效促进大鼠坐骨神经缺损(10 mm)的修复.     

人脐血间充质干细胞修复颅骨缺损的实验研究

目的 应用人脐血间充质干细胞(umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)复合脱钙骨材料构建组织工程化骨,修复裸大鼠颅骨标准缺损.方法 体外扩增培养、成骨诱导人UCB-MSCs,采用Alizarin Red染色和钙离子半定量的方法测定细胞成骨分化能力.将第2代细胞接种在脱钙骨支架材料上继续诱导培养,扫描电镜检测细胞在材料上的生长状况.制备裸大鼠双侧颅骨全层标准缺损(直径5 mm),一侧以细胞材料复合物修复作为实验侧(n=8);另一侧以单纯脱钙骨材料修复作为对照侧(n=8).术后6、12周取材,分别通过大体形态观察、显微CT(Micro-CT)、组织学方法检测颅骨缺损的修复效果.结果 UCB-MSCs体外能够诱导分化为成骨细胞,且在脱钙骨支架材料上生长良好.Micro-CT检测显示术后6周实验侧有部分新生骨组织形成,12周时骨缺损修复率达(78.19±6.45)%,脱钙骨材料降解完全;对照侧6周时无明显新骨生成,12周时材料完全降解,骨缺损未修复.组织学检测显示12周时实验侧有较多成熟骨生成,为骨性愈合;对照侧骨缺损为纤维愈合.结论 成骨诱导的人UCB.MSCs复合脱钙骨材料构建的组织工程化骨可修复裸大鼠颅骨全层标准缺损,有望成为新的组织工程骨种子细胞来源.     

脐血间充质干细胞的培养鉴定及成骨诱导后的免疫原性研究

目的通过观察体外培养人脐血间充质干细胞(Umbilical cord blood-mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)并作诱导成骨分化,探讨其作为组织工程的骨种子细胞的可行性。方法体外分离培养UCB-MSCs,流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达及其变化规律;体外成骨诱导UCB-MSCs2周,采用Alizarin Red染色和钙离子半定量测定的方法评价细胞成骨活性。取P2代UCB-MSCs细胞,流式细胞仪检测加入IFN-γ前后的HLA-Ι、HLA-Ⅱ、CD40、CD80等分子的表达情况;流式细胞仪检测UCB-MSCs在成骨诱导分化前后HLA-Ι类分子、HLA-Ⅱ类分子的表达情况以观察成骨诱导分化的MSCs免疫抗原性的变化。结果第1、3、5代细胞的CD29、CD105和CD166均呈阳性表达,而造血细胞系的表面标记CD31、CD34和CD45则呈低表达,且随传代次数增加含量逐渐下降。UCB-MSCs成骨诱导2周后,Alizarin Red染色为阳性。对照组则无明显钙盐沉积。钙离子半定量的检测结果则表明,UCB-MSCs成骨诱导2周后的钙离子含量远高于未诱导组。流式细胞检测结果显示,人UCB-MSCs高表达HLA-Ι类分子,不表达HLA-Ⅱ类分子和CD40,CD80等共刺激分子;经IFN-γ刺激诱导后,HLA-Ι类分子的表达未发生改变,HLA-Ⅱ类分子呈阳性表达,而CD40和CD80的表达仍为阴性。人UCB-MSCs在成骨诱导分化前后HLA-Ι类分子均为阳性表达;而HLA-Ⅱ类分子在成骨分化前为阴性,诱导后阳性表达率增高。结论①UCB-MSCs能诱导分化为成骨细胞,有望成为较理想的组织工程骨种子细胞;②成骨分化使UCB-MSCs的免疫原性发生相应变化。