人乳头瘤病毒16型DNA转化人胚肺细胞的实验研究

人乳头瘤病毒(HPV)的16,18,31,33型等与宫颈癌的发病有关,其中HPV16与宫颈癌关系密切。为进一步研究HPV16的致癌性,我们用克隆的HPV16 DNA(2μg/10~5细胞)转染体外培养的人胚肺细胞,并进行了细胞存活时间、血清依赖性、着壁依赖性、间接免疫酶检测、HPV16 DNA、同源序列检测、染色体核型等生物学的研究。结果表明,转染细胞存活时间延长、在软琼脂培养基中形成集落、HPV16特异抗原得以表达、HPV16 DNA的同源序列存在于细胞中。表明本实验用HPV16DNA转染的人胚肺细胞具备转化细胞的某些特征,HPV16有使人胚肺细胞转化的作用。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对HPV11早期基因E6、E7mRNA表达的影响

目的 利用人工构建的含人乳头瘤病毒(HPV)11型基因组的HaCaT细胞(简称为HPV11.HaCaT细胞),研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对该细胞生长的抑制作用,以及受试物对HPV11早期基因E6和E7 mRNA表达的影响。方法 在HaCaT及HPV11.HaCaT细胞培养基中添加不同浓度的EGCG后,应用MTT比色法检测受试物对细胞生长增殖的影响;用相对荧光定量PCR法检测HPV11.HaCaT细胞中HPV11 E6、E7 mRNA表达的改变。结果 EGCG能抑制HaCaT和HPV11.HaCaT细胞的生长,不同浓度EGCG作用下,细胞生存率为52%~95%、64%~90%,呈浓度和时间依赖趋势。EGCG作用于细胞12h和24h后,HPV11.HaCaT细胞中HPV11 E6、E7基因的mRNA表达水平明显下降(P<0.05)。结论 EGCG在体外能抑制含HPV11基因组的HaCaT细胞生长,并能抑制HPV11功能基因E6、E7表达。     

HPV16 E7"自杀性"DNA 疫苗的构建及其体外表达特性研究

目的构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7基因的"自杀性"DNA疫苗,并研究其体外表达能力及诱导细胞凋亡作用。方法以pET32/E7质粒为模板,用PCR方法扩增HPV16 E7基因,构建真核表达重组质粒pSCA/E7,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,将重组质粒转染BHK-21细胞,然后用免疫荧光技术检测HPV16 E7在细胞中的表达,用dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)进行染色检测其诱导细胞凋亡作用。结果PCR扩增得到约400 bp的目的基因片段,测序结果与GenBank中的东亚型HPV16 E7基因序列100%同源。免疫荧光技术检测证实,pSCA/E7重组质粒能在BHK-21细胞中表达目的基因。TUNEL检测证实,pSCA/E7重组质粒能诱导被转染的BHK-21细胞发生凋亡。结论成功构建HPV16 E7基因的重组质粒pSCA/E7,该重组质粒可在BHK-21细胞中表达,并能诱导被转染的细胞发生凋亡。     

外源性HPV16 E7癌基因表达对宫颈癌HeLa细胞Cyclin E表达的影响

目的研究重组腺病毒介导人乳头状瘤病毒（HPV）16型E7病毒癌基因感染对人宫颈癌HeLa细胞周期蛋白E（Cyclin E）表达的影响,探讨HPV16 E7癌基因以及Cyclin E在宫颈癌发生发展中的作用。方法用含有HPV16 E7病毒癌基因的重组腺病毒载体感染体外培养的人宫颈癌HeLa细胞。免疫荧光染色后激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）检测感染前后Cyclin E表达的差异。结果HPV16 E7感染后Cyclin E表达较感染前明显增加。结论HPV16 E7基因的表达促进Cyclin E的表达,对宫颈肿瘤细胞有增殖促进的作用。     

HPV16 E7“自杀性”DNA疫苗的构建及其体外表达特性研究

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E7基因的“自杀性”DNA疫苗，并研究其体外表达能力及诱导细胞凋亡作用。方法以pET32／E7质粒为模板，用PCR方法扩增HPV16 E7基因，构建真核表达重组质粒pSCA／E7，经PCR、酶切和测序鉴定正确后，将重组质粒转染BHK-21细胞，然后用免疫荧光技术检测HPV16 E7在细胞中的表达，用dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）进行染色检测其诱导细胞凋亡作用。结果PCR扩增得到约400bp的目的基因片段，测序结果与GenBank中的东亚型HPV16 E7基因序列100％同源。免疫荧光技术检测证实，pSCA／E7重组质粒能在BHK-21细胞中表达目的基因。TUNEL检测证实，pSCA／E7重组质粒能诱导被转染的BHK-21细胞发生凋亡。结论成功构建HPV16 E7基因的重组质粒pSCA／E7，该重组质粒可在BHK-21细胞中表达，并能诱导被转染的细胞发生凋亡。     

人乳头瘤病毒在人大肠癌中检出

用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)法对28例大肠癌(均为分化程度不同的腺癌)及18例相应癌旁组织中人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16和18型DNA分别进行检测。在28例大肠癌组织中分别检测到3例(10.8％)呈HPV16DNA阳性和18例(64.5％)呈HPV18DNA阳性。而相应的18例癌旁组织中仅检测到3例(16.7％)呈HPV18DNA阳性,未检测到HPV16DNA。为了证实扩增产物的特异性,我们用限制性内切酶对PCR产物分别进行了酶切分析,结果与预期的完全相符。本文提示HPV感染可能是大肠癌的发病因素之一。     

宫颈癌和宫颈上皮内瘤样变细胞中人乳头瘤病毒分子状态的研究

目的了解宫颈癌和宫颈上皮内瘤样变(CIN)细胞中HPV DNA的分子状态，并建立其分子生物学检测技术。方法建立了采用多重聚合酶链反应(Multiplex PCR)平行检测HPV-16 DNA EA和E6基因以判定HPV DNA分子状态的方法，并对17例HPV-16 DNA阳性的宫颈癌和CIN组织标本进行了应用研究。结果Multiplet PCR技术能够有效判断HPV DNA的分子状态。HPV DNA整合的发生与宫颈上皮细胞恶性化程度关系密切。结论检测高危型HPV DNA感染的分子状态是判断和预测宫颈上皮细胞恶性化趋势的有效指标。     

宫颈癌患者HPV16感染及其血清抗体检测分析

目的：探讨宫颈癌与人乳头瘤病毒16（HPV16）感染及其血清抗体的关系，为HPV感染及宫颈癌的临床诊断提供理论依据。方法：选择28例宫颈癌患，用PCR方法检测宫颈癌组织的HPV型别；并采用重组杆状病毒－昆虫细胞系统制备HPV16病毒样颗粒（VLPs），用ELISA方法检测其血清HPV16VPLs抗体，同时以36份尖锐湿疣患血清及72份健康体检查血清作为对照。结果：宫颈癌HPV通用型DNA阳性率为50％（14／28），HPV16DNA阳性率为42．9％（12／28），HPV18DNA阳性率为3．5％（1／28），较健康对照组阳性率为1．4％（1／72）、中位数－0．0220）－0．0265）和尖锐湿疣组阳性率为8．3％（3／36）、中位数为0．0165（0．0145）差异具显性意义（P＜0．01）。HPV16DNA检测法与HPV16VLPsELISA血清抗体检测法两间呈中度相关（K＝0．471，P＜0．05）。结论：本组宫颈癌以HPV16感染为多见，HPV16VLPs血清ELISA抗体检测可用作HPV16感染的血清学诊断和宫颈癌的免疫学研究。     

人乳头状瘤病毒16型DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系的建立(英文)

目的建立人乳头状瘤病毒（HPv）16型DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系，确证HPv与喉癌的发生有无关系。方法采用脂质体介导法，将pSVHPV16DNA导入原代培养的人喉上皮细胞，继续培养、传代，取20代细胞，用PCR检测细胞是否含有病毒的特异片段，用免疫组化染色检测E6、E7蛋白的表达，用倒置显微镜、生长曲线、流式细胞仪、细胞角蛋白免疫组化染色、透射电镜及软琼脂克隆形成试验检测细胞的生物学特性。结果有3株细胞已连续培养传代超过20代，细胞含有HPV16DNA的特异片段并有E6、E7蛋白的表达，细胞呈锚着依赖性、接触抑制性单层平铺生长，生长曲线呈典型的“s”型，细胞增殖指数为48％，所有细胞均表达角蛋白，胞浆含张力原纤维，软琼脂培养克隆形成试验阴性。结论成功建立了HPV16DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系，为喉癌研究提供了新的理想模型，HPV16对人喉上皮有致癌作用，在喉癌组织标本中检测到的HPV16DNA必定在其多步癌变过程中发挥了重要作用。     

黑龙江省尖锐湿疣组织HPV感染的型别分析

目的 分析黑龙江省尖锐湿疣组织中感染的人乳头瘤病毒(HPV)基因型分布情况,比较保守引物和序列特异引物PCR扩增方法.方法 提取26例尖锐湿疣组织标本中DNA,用HPV L1区通用引物及HPV 6b、HPV11、HPV16、HPV18型L1区特异引物进行PCR扩增,分析尖锐湿疣组织中感染的HPV型别分布并比较两种扩增方法的结果.结果 26例标本中,HPV 6b和11型感染例数分别为4和11例,各占15.4%和65.4%;HPV 16型感染2例,占总例数7.7%;有2例合并HPV6b/11型混合感染,占7.7%;1例合并HPV11/16/18型的混合感染,占3.8%.用通用引物扩增后26例标本中1例为阴性. 结论黑龙江省地区尖锐湿疣组织HPV DNA检出率为100%,以低危型别11和6b型为主,偶见高危型别16、18型感染.鉴定HPV感染保守引物与型别特异性引物PCR方法相比,前者可导致少量假阴性产生.     

HPV E7与子宫颈上皮内瘤样病变细胞DNA损伤应答的相关性研究

目的 通过原代培养HPV阳性的宫颈上皮内瘤变Ⅲ度（CINⅢ）的成纤维细胞与HPV阴性的小儿包皮成纤维细胞,探索HPV E7在DNA损伤应答过程中的作用。方法 选取临床病理确认为HPV16阳性的CINⅢ新鲜宫颈组织和HPV16阴性的小儿包皮组织,组织块经胶原酶A消化后培养,用慢病毒E7或pLV感染HPV16-成纤维细胞,用离子射线（X光,2 Gy或5 Gy）分别照射HPV16阴性与HPV16阳性细胞以及经pLV或E7慢病毒感染的细胞0~8 h,诱导细胞DNA双链断裂,采用间接免疫荧光法检测DNA双链断裂应答相关蛋白53BP1、BRCA1、NBS1、RPA32的应答特征。结果 成功从宫颈上皮内瘤变组织及小儿包皮组织原代培养出HPV16阳性及HPV16阴性的成纤维细胞。间接免疫荧光染色发现X光照射后,HPV16阳性细胞中53BP1、BRCA1、NBS1、RPA32灶点多于HPV16阴性细胞（P<0.05）,E7感染细胞中53BP1、RPA32、NBS1灶点少于pLV感染细胞（P<0.05）,均为6 h(2 Gy)或4 h（5 Gy)达峰。结论 利用原代培养CIN成纤维细胞成功建立了研究DNA损伤中E7作用的模型,在宫颈癌前病变发展过程中,HPV E7能够抑制DNA双链断裂修复应答反应。     

口腔鳞状细胞癌中人乳头瘤病毒16型转化基因E_7的检测

【目的】准确检测口腔鳞状细胞癌及正常口腔粘膜中人乳头瘤病毒 16型 (HPV16)的感染状况 ,探讨人乳头瘤病毒 16型与人口腔鳞状细胞癌之间的关系。【方法】从 30例未经治疗的口腔鳞状细胞癌患者肿瘤组织及 30例健康志愿者正常口腔粘膜切取标本 ,液氮冷冻保存 ;常规提取组织DNA ,设计HPV16E7转化基因特异性引物 ,进行聚合酶链反应 ,对PCR结果进行检测 ,记录结果。【结果】 30例口腔鳞状细胞癌患者中检测到 11例HPV16阳性 ,感染率 36 7% ;30例正常对照组中检测到 4例HPV16阳性 ,感染率 11 1%。经 χ2 检验 ,两者差别有显著性。【结论】人乳头瘤病毒 16型与人口腔鳞状细胞癌有一定关系 ,但HPV16在人口腔鳞状细胞癌发生发展过程中所起的作用还有待进一步研究。     

鼻咽癌组织中人乳头瘤状病毒DNA的研究

应用多聚酵链反应(PCR)及4型人乳头瘤状病毒(HPV)DNA探针杂交技术，检测福建58倒鼻咽癌活检的石蜡包埋组织中人乳头瘤状病毒DNA的存在及其类型。结果发现HPV DNA阳性者14例(24％)，其中16型5例(35．7%)，6型4例(28．6％），16型和6型同时阳性者4例(28.6%)，未知类型者1例(7％)。未发现18型和11型病例。5例慢性鼻咽炎粘膜中未检出HPV DNA。42例癌旁粘膜被覆的鳞状上皮中见有挖空细胞、角化过度和疣状增生等HPV感染效应。结果表明在鼻咽癌高发区HPV DNA有较高检出率，它与鼻咽癌的发生有一定关系。     

人乳头瘤病毒16/18型与宫颈癌的关系探讨

目的探讨高危型人乳头瘤病毒16/18型感染与宫颈癌的关系。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法对我院115例宫颈癌患者及192例宫颈炎症患者的宫颈分泌物进行HPV16/18 DNA检测,计算两组HPV16/18型阳性率及各组中HPV-DNA病毒载量拷贝对数值。结果宫颈癌患者组HPV16/18型阳性率76.5%,宫颈炎患者组HPV16/18型阳性率30.4%,两组的阳性率和病毒载量统计学上均有显著差异。结论人乳头瘤病毒16/18型病毒感染与宫颈癌的发生发展密切相关,实时荧光定量PCR检测对早期诊断、治疗宫颈癌具有重要的指导意义。     

绝经后妇女HPV的持续性感染

目的:人类乳头瘤病毒(HPV)持续性感染与年轻女性的宫颈鳞状上皮内病变(SIL)及宫颈癌发病率升高相关。由于这种关联在老龄绝经后妇女中很少被关注,因此,本文针对这部分女性人群的HPV持续性感染情况进行了研究。方法:对105例年龄在45～64岁的妇女每年都进行宫颈脱落细胞中的HPV检查,历时7年。应用PCR、斑点杂交及DNA测序等技术手段检测HPV类型。结果:累积HPV感染率为34%,24%感染有与生殖器恶性肿瘤发病相关的高危致瘤型HPV;最常见致瘤型是HPV-16(72%)和HPV-31(16%),HPV持续性感染率为16%;无特殊的高危因素与反复病毒感染相关。…     

人滋养层细胞内丙型肝炎病毒样颗粒的免疫电镜形态学研究

目的：应用免疫电镜技术观察体外培养的人胎盘滋养层细胞感染丙型肝炎病毒（HCV）情况。方法：采用胰蛋白酶消化法及Percoll密度梯度分离法分离培养人胎盘组织中滋养层细胞，以HCV RNA阳性血清对滋养层细胞进行体外感染实验，胶体金免疫电镜检测滋养层细胞内的HCV病毒颗粒，逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）定性检测滋养层细胞内HCV RNA。结果：体外培养的人胎盘滋养层细胞内可观察到胶体金颗粒吸附的病毒样颗粒，形态及直径符合HCV特点。RT—PCR定性检测结果阳性，进一步证文所观察到的病毒样颗粒为HCV。结论：HCV可感染体外培养的人胎盘滋养层细胞。     

新疆维吾尔族宫颈癌组织中HPV—DNA表达及存在状态的研究

目的 探讨高危型人乳头瘤病毒（HR—HPV）在新疆维吾尔族宫颈癌患者中的表达、存在状态及其与宫颈癌的相关性。方法 选择第2代杂交捕获（Hybrid capture,HC2）检测HR—HPV阳性的30例维吾尔族宫颈鳞癌（SCC）患者,利用巢式PCR检测其组织标本中的HPV16-DNA的表达,多重Taqman探针荧光定量PCR检测HPV16～DNA在组织中的存在状态。结果 巢式PCR检测结果 显示宫颈鳞癌患者HPV16-DNA检出率为96．7％,与HC2法的HPV—DNA检出率差异无统计学意义（P〉0．05）;HPV16-DNA在宫颈癌组织中以整合态存在,其整合率为89．7％;HPV16-DNA的表达水平与宫颈癌患者的年龄、有无淋巴结转移无关（P〉0．05）,但其在病理分级高的患者中表达高于病理分级低的患者（P〈0．05）,在临床分期高的患者中表达高于低分期患者（P〈0．05）。结论 HR—HPV感染是导致宫颈癌的主要因素,而HPV16是新疆维吾尔族宫颈癌主要的病毒类型,其在组织中多以整合态存在,在宫颈癌发病中起主要作用,HPV—DNA整合状态与宫颈细胞的恶性转化密切相关。     

高危型人乳头状瘤病毒在子宫颈癌组织和外周血表达的意义

目的: 分别检测子宫颈癌组织和外周血标本中人乳头状瘤病毒(HPV)(16型,18型),探讨HPV感染与子宫颈癌的关联性以及在肿瘤微转移中的表达。方法: 采用荧光定量PCR(FQ-PCR)和逆转录PCR (RT-PCR)技术检测24份子宫颈癌组织及其治疗前后48份外周血标本,慢性子宫颈炎组织及其外周血标本各20份。结果: 24份子宫颈癌组织(Ⅰ~Ⅱb期)中HPVDNA 16型阳性率为66.7%,HPV DNA 18型阳性率为29.2%,两型均阳性的阳性率为8.3%;48份外周血标本HPV mRNA 16型阳性率为2.1%;20份慢性子宫颈炎组织HPV DNA 16型阳性率为15.0%,HPV18型为阴性,其外周血均为阴性。子宫颈癌HPV DNA 16型组与慢性子宫颈炎HPV DNA 16型组比较差异有统计学意义(P<0.005~P<0.05)。结论: 高危型HPV感染与子宫颈癌发生高度相关。外周血HPV检出率低,临床价值有待进一步研究。     

宫颈病变人乳头状瘤病毒分子检测及分型的意义

目的 探讨宫颈癌前病变患者进行人乳头状瘤病毒(HPV)DNA检测及基因分型的意义.方法 采集2153例宫颈中心就诊患者的宫颈脱落细胞,采用杂交捕获技术对HPV DNA进行检测.采用凯普导流杂交HPV分型技术检测342例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者的HPV亚型.结果 ①2153例受检者中701例HPV DNA检测阳性.阳性率达32.6%;其中以宫颈癌患者感染率最高,达93.9%,其次为宫颈上皮内瘤变,达54.6%.②高危型HPV感染好发于30岁以上,40～59岁是高危型HPV最高发的年龄阶段.③随着宫颈病变的严重程度,高危型HPV DNA病毒载量有上升趋势.④宫颈上皮内瘤变患者高危型HPV主要的感染类型为16、52和58亚型.低危型主要为11、6和42亚型.⑤CIN I主要感染亚型为16、52和33亚型,CINⅡ主要亚型为16、58和18亚型.CINⅢ主要亚型为16、52和58亚型.⑥高危型HPV感染者多重感染率为23.O%,其中双重感染18.9%.三重及以上感染4.1%.CIN I、CINlI和CIN III多重感染发生率未发现明显增高趋势.结论 高危型HPV DNA检测用于宫颈癌前病变筛查极有价值.HPVl6仍然是最应关注的高危亚型.     

FQ—PCR检测尖锐湿疣皮损中HPV—DNA

目的：了解尖锐湿疣（CA）组织中人乳头瘤病毒（HPV）感染的型别及其DNA含量。方法：采用HPV6／11和HPV16／18型荧光定量PCR诊断试剂盒,对临床表现典型的CA组织进行FQ－PCR检测。结果：HPV－DNA阳性检出率95．15％,其中HPV6／11型阳性检出率86．4％。HPV6／11含量在10^5～10^9opies,占92．13％。结论：CA主要为HPV6／11感染,皮损中HPV6／11DNA含量检测可以临床提供一定的参考。