慢病毒载体介导的脂肪干细胞miR-1重组表达系统的构建

目的 构建miR-1稳定过表达并且适于体内示踪的基因修饰大鼠脂肪干细胞(rASCs)模型。方法 首先对体外培养的rASCs进行表型鉴定及成骨、成脂诱导分化;然后观察重组慢病毒转染rASCs过程中不同感染复数(MOI)及有无添加聚凝胺(polybrene)对报告基因萤火虫荧光素酶(FLuc)表达和活性的影响;最后采用qRT-PCR检测miR-1-3p和miR-1-5p的表达水平。结果 通过观察FLuc介导酶促反应引起的生物发光筛选出最佳转染条件为MOI 60,且添加聚凝胺能增强慢病毒转染rASCs的效率;随后应用该条件转染rASCs构建miR-1稳定过表达模型,qRT-PCR结果显示miR-1-3p和miR-1-5p的表达水平分别升高了65.6倍和37.4倍(P<0.05),证实该模型构建成功。结论 慢病毒载体能成功介导外源基因在rASCs中稳定过表达,并且报告基因FLuc催化底物产生的生物发光有利于进一步的体内示踪研究。总言之,本研究为基因修饰细胞模型的构建提供了方法学基础,并为心肌组织再生修复提供新的工程细胞株。     

人血管内皮生长因子165的克隆和大肠杆菌中的表达

目的 克隆和在大肠杆菌中表达人血管内皮生长因子１６５（ＶＥＧＦ１６５）。方法 利用ＰＣＲ的方法众胎脑ＣＤＮＡ库扩增得到人ＶＥＧＦ１６５的全长ＣＤＮＡ并测定其核酸序列。利用基因重组技术构建ＶＥＧＦ１６５的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达,用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达产物。结果 经测序表明,克隆的ＶＥＧＦ１６与文献报道相符。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果表明经用ＩＰＴＧ诱导后,ＶＥＧＦ１６５在大     

血管内皮生长因子165基因对大鼠血管损伤后重塑的实验研究

目的探讨局部转染血管内皮生长因子165基因(VEGF165cDNA)对大鼠血管球囊拉伤术后血管重塑的影响。方法制备VEGF165cDNA基因,将30只SD大鼠随机分为基因组、手术对照组及正常对照组(各10只),基因组通过尾静脉输入VEGF165cDNA基因,手术对照组及正常对照组只注入生理盐水,应用免疫组织化学、电镜、光镜等方法观察球囊拉伤后的大鼠股动脉内膜的变化,检测拉伤局部内膜VEGF165基因作用效果。结果基因组球囊拉伤血管24 h后内膜处有少量中性粒细胞浸润,手术对照组损伤内膜有较多的中性粒细胞浸润,14 d后基因组球囊拉伤血管内膜厚度小于手术对照组(P<0.01),管腔内径大于手术对照组(P<0.01),内膜有大量VEGF蛋白表达。结论病理性重塑是血管损伤后再狭窄的主要原因,而VEGF165基因可促进内皮细胞增生,加速损伤内膜的修复,抑制血管内膜平滑肌细胞的增生进而防治再狭窄。     

Hsa-miRNA-9-5p过表达慢病毒载体的构建

目的深讨Has-miRNA-9-5p过表达慢病毒载体的构建。方法采用相关基因shRNA序列设计、病毒载体松建与鉴定以及病毒包装滴度鉴定、表达检测。结果成功构建慢病毒载体Has-miRNA-9-5p过表达系统。结论为miRNA-9-5p的功能研究奠定基础。     

Vasohibin-2慢病毒过表达载体的构建及相关增殖功能研究

目的:构建Vasohibin-2(VASH2)慢病毒过表达载体,获得稳定表达的肝癌细胞株HepG2,并观察其对HepG2增殖的影响?方法:通过逆转录?PCR技术从细胞总RNA中获得VASH2目的基因,引入NheⅠ和PstⅠ酶切位点,连接到pTA2 vector中,经NheⅠ和PstⅠ双酶切后再连接到Lv-CMV-EGFP vector中,并对重组后的质粒进行双酶切和测序分析;VASH2过表达载体?pVSV-G及delta8.91 3个质粒共转染293T细胞,获得慢病毒感染肝癌细胞株HepG2,经流式细胞仪分选阳性细胞;提取细胞总RNA和总蛋白,利用real-time PCR和Western blot鉴定稳转细胞株中VASH2的表达,用MTT法和细胞周期法检测各组HepG2的增殖能力?结果:成功构建VASH2慢病毒过表达载体,感染肝癌细胞株HepG2后能够稳定高表达VASH2;稳定高表达VASH2的HepG2增殖能力明显增强(P < 0.05)?结论:成功构建了VASH2慢病毒过表达载体,并发现VASH2可以促进HepG2的增殖能力,这为进一步研究VASH2在肝癌中的功能及作用机制奠定了基础?     

人血管内皮生长因子165的克隆和在大肠杆菌中的表达

克隆和在大肠杆菌中表达人血管内皮生长因子１６５（ＶＥＧＦ１６５）。方法利用ＰＣＲ的方法从胎脑ｃＤＮＡ库扩增得到人ＶＥＧＦ１６５的全长ｃＤＮＡ并测定其核酸序列。利用基因重组技术构建ＶＥＧＦ１６５的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达产物。结果经测序表明，克隆的ＶＥＧＦ１６５与文献报道相符，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明经用ＩＰＴＧ诱导后，ＶＥＧＦ１６５在大肠杆菌中表达出。结论克隆和表达出ＶＥＧＦ１６５，为以后进一步研究ＶＥＧＦ１６５的功能奠定了基础     

人血管内皮生长因子（VEGF165）在大肠杆菌中的表达及鉴定

【目的】克隆人VEGF165基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达、纯化重组VEGF165(rVEGF165)蛋白。【方法】用PCR技术，从人心脏cDNA库中扩增VEGF165 cDNA，并定向克隆入原核表达载体pET-28a中。用IPTG诱导VEGF165在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。用HisTrap亲合层析柱纯化重组rVEGF165 Western—blot鉴定。根据人VEGF165的促血管内皮细胞增殖的特性，用MTT法检测重组VEGF165的生物学活性。【结果】从人心脏cDNA库中扩增出VEGF165 cDNA片段。克隆的VEGF165 cDNA长576bp，编码191个氨基酸残基，序列与献报道一致。SDS-PAGE电泳显示，经IPTG诱导，高效表达出25ku的rVEGF165，主要存在于包涵体中，约占菌体总蛋白的20％。MTT检测显示，复性后的rVEGF165能呈剂量依赖性地促进脐静脉血管内皮细胞增殖。【结论】克隆、测定了人VEGF165基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出rVEGF165。     

大鼠Tmub1基因过表达慢病毒载体的构建

目的 构建Tmub1基因的过表达慢病毒载体(LV-Tmub1),为研究Tmub1蛋白在肝细胞增殖过程中的作用提供实验材料.方法 化学合成Tmub1基因序列,用BamHI/AgeI酶切化学合成含有目的基因的质粒及GV287载体,PCR产物连接入线性化表达的载体.PCR鉴定引物,再对PCR鉴定阳性的克隆进行DNA测序和比对分析.使用构建的LV-Tmnb1,转染293T细胞,荧光法检测构建的慢病毒滴度.结果 成功构建了LV-Tmub1,并获得相应的病毒,病毒滴度为2×108 TU/mL.结论 LV-Tmub1为进一步研究Tmub1蛋白在肝细胞增殖中的作用提供了实验基础.     

SUMF2基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)基因过表达慢病毒载体,以便进一步研究SUMF2功能。方法 针对人SUMF2 DNA序列设计带酶切位点的引物,PCR法获得目的基因片段;用AgeⅠ和NheⅠ酶双酶切SUMF2基因片段及PLJM1-EGFP载体。用T4连接酶对两种酶切产物进行连接、PCR鉴定、测序。将阳性克隆质粒与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染293T细胞,并荧光显微镜观察EGFP的表达。结果 PCR和测序证实成功构建了SUMF2的慢病毒表达载体,病毒效价为1×10⁸ TU/ml。结论 成功构建SUMF2-PLJM1-EGFP慢病毒载体,并在293T细胞中得到表达。     

miR-186过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞（HEK）293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法：以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin的慢病毒载体FV040中,经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切及测序鉴定后获得重组慢病毒载体。利用Lipofectamine 2000将重组慢病毒质粒FV040 Vector和FV040 miR-186分别与辅助质粒通过共转染至HEK293T细胞中,48 h后收集慢病毒,以FV040 Vector慢病毒作为对照组,FV040 miR-186作为实验组,分别感染HEK293T细胞。感染48 h后,观察HEK293T细胞中绿色荧光的分布情况,并采用实时荧光定量PCR法检测miR-186的表达水平。结果：测序分析,miR-186过表达慢病毒与GenBank上公布的miR-186序列完全一致。与对照组（0.8387±0.1456）比较,实验组HEK 293T细胞中miR-186表达水平（12.6400±0.7884）明显升高（t=14.72,P<0.01）,约为对照组的15.07倍。结论：成功构建miR-186过表达慢病毒载体并包装出慢病毒,miR-186慢病毒成功感染HEK293T细胞,miR-186表达水平在HEK293T细胞中明显升高。     

VEGF165基因转染真皮多能干细胞的实验研究

目的 为获得高表达生物活性血管内皮细胞生长因子VEGF165的皮肤种子细胞,拟将转基因治疗与真皮多能干细胞相结合,为难愈性创面的促愈治疗奠定基础.方法 构建真核表达载体pIRES2-EGFP-VEGF165,经脂质体法介导转染真皮多能干细胞;半定量RT-PCR检测VEGF165 mRNA的表达,Western blot和酶联免疫ELISA法检测VEGF蛋白的表达;并检测了表达产物的生物活性及转染VEGF(dermal multipotential stem cells,DMSCs)增殖活性的变化.结果 转染后VEGF165 mRNA和VEGF蛋白的表达均显著增强(P＜0.01),约为对照组的1.6倍,且转染VEGF后DMSCs的培养上清显著提高hECV304细胞增殖活性(P＜0.01).MTT结果显示转染VEGF后DMSCs增殖活性显著增高,约为转染空载体组DMSCs的2倍(P＜0.01).结论 成功获得了高水平表达并分泌具有生物活性的VEGF的基因治疗种子细胞DMSCs,为下一步动物在体进行基因治疗打下了基础.     

脂肪组织源基质细胞（ADSCs）——细胞学工程的新选择

越来越多的证据证明干细胞包括胚胎干细胞、骨骼肌卫星细胞、骨髓间充质干细胞等可用于组织的再生和修复。但以上细胞的临床应用存在很多问题如来源困难、免疫排斥、伦理学等等。脂肪来源的基质细胞以其取材方便、更容易获取、低免疫原性等特点成为今年来研究的热点。本文对ADSCs的特点进行了较为全面的回顾。     

肾细胞癌组织与正常组织中VEGF165b的差异表达及其意义

目的:研究血管内皮生长因子165b(Vascular endothelial growth factor 165b,VEGF165b)在肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)组织和正常组织中的表达情况,初步探讨其与肾细胞癌发生发展的关系.方法:(1)用S-P免疫组化法检测30例肾细胞癌组织和29例正常肾组织中VEGF165b蛋白的表达情况;(2)用RT-PCR法分别检测32例肾细胞癌组织和30例正常肾组织中VEGF165b mRNA的表达情况.结果:(1)正常肾组织中VEGF165b蛋白表达率为96.55%(28/29),肾细胞癌组织中VEGF165b蛋白的表达率为20.00%(6/30),表达差异有统计学意义(P<0.05). (2)正常肾组织中VEGF165b mRNA阳性表达率为93.33%(28/30),肾细胞癌组织中VEGF165b mRNA的阳性表达率为18.75%(6/32),具有统计学意义(P相似文献   

膀胱移行细胞癌组织与正常组织中VEGF165b的差异表达及其意义

目的:初步探讨VEGF165b与膀胱移行细胞癌(Transitional cell carcinoma of the bladder,TCCB)发生发展的关系.方法:用S-P免疫组化法检测38例TCCB组织和36例正常膀胱组织中VEGF165b蛋白表达;以RT-PCR法检测55例TCCB组织和43例正常膀胱组织中VEGF165b mRNA表达.结果:正常膀胱组织中VEGF165b蛋白表达率为97.22%(35/36),TCCB组织中VEGF165b蛋白表达率为21.05%(8/38),表达差异有显著性(P<0.05);正常膀胱组织中VEGF165b mRNA阳性表达率为95.35%(41/43),明显高于TCCB组织中VEGF165b mRNA阳性表达率18.18%(10/55)(P相似文献   

重组人血管内皮生长因子165在Pichia酵母中的表达

目的：采用基因工程方法构建基因工程菌制备人VEGF165蛋白。方法：自人肿瘤组织中获取人VEGF165 cDNA,构建pPIC9K酵母表达载体,采用Pichia酵母真核表达系统表达目的蛋白。结果：SDS-PAGE及Westem-blot结果显示目的蛋白已成功表达。结论：在Pichia酵母中成功表达人VEGF165。     

骨髓间充质干细胞移植对脑动脉栓塞大鼠VEGF165、Notch1表达的影响

为探究骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对脑损伤大鼠的改善作用机制,本实验通过建立脑损伤大鼠模型,观察BMSCs移植对脑动脉栓塞大鼠血管内皮生长因子(VEGF) 165、Notch1表达的影响。将45只SD大鼠随机分为假手术对照组、动脉栓塞(MCAO)组、BMSCs移植组。检测脑组织栓塞区微血管数量,及各组大鼠VEGF165、Notch1蛋白和mRNA的表达。结果发现MACO组、BMSCs移植组大鼠的脑组织中微血管数量明显多于假手术对照组;MACO组和BMSCs移植组的VEGF165与Notch1的蛋白表达、VEGF165与Notch1的mRNA表达均高于假手术对照组;BMSCs移植组较MACO组更高。根据结果推测BMSCs移植可能通过激活Notch信号通路促进VEGF165的表达,而促进脑动脉栓塞区的血管新生。     

VEGF165的载体构建、表达及其生物学活性

目的:构建血管内皮生长因子(VEGF)165原核表达载体,在大肠杆菌中表达,获得重组VEGF165,并通过细胞和鸡胚尿囊膜试验鉴定其生物学活性.方法: 本实验室保存的T-VEGF165质粒,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,将其克隆至原核表达载体pET28a( )中,获得含人VEGF165全序列基因的表达载体pET28a( )-VEGF165,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,对表达产物进行纯化,获得VEGF165蛋白.通过体外促进HUVEC细胞增殖及鸡胚尿囊膜血管增生实验鉴定其生物学活性.结果:成功构建了VEGF165蛋白的原核表达载体,表达纯化了VEGF165蛋白,经过细胞增殖试验及鸡胚尿囊膜血管增生实验,证明该蛋白具有良好的促进血管内皮细胞增殖的生物学活性.结论:成功地获得了人VEGF165重组蛋白,并证实了该蛋白具有促进血管内皮细胞增殖活性.     

miR-610的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的:克隆微小RNA hsa-miR-610并构建其慢病毒表达载体.方法:将PCR扩增得到的miR-610前体序列和pcDNA6.2-GW/EmGFP载体经双酶切后连接产生pcDNA6.2-miR-610真核表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆.通过BP反应及LR反应将pre-miR-610克隆至慢病毒目的载体pLenti6/V5-DEST,构建miR-610的慢病毒表达载体pLenti6/V5-miR-610.结果:将构建好的慢病毒表达载体导入大肠杆菌Stb13进行扩增,测序表明所构建的载体与预期的完全一致.结论:成功构建了miR-610的慢病毒表达载体pLenti6/V5-miR-610,为深入研究miR-610的生物学功能奠定了基础.