钠泵抑制物噬菌体单链抗体库的构建

目的　应用噬菌体展示技术构建钠泵抑制物单链抗体库 .方法　用 OUA- OVA(ouabain- ovalbumin)免疫小鼠 ,取脾脏 ,分离淋巴细胞 ,提取 m RNA,逆转录成 c DNA第一链 ,用简并引物经 PCR分别扩增轻、重链抗体库 ,经重叠延伸PCR由 L inker将轻、重链拼接成 Sc Fv(单链抗体 ) ,用 RS引物以 Sc Fv为模板进行第 2次 PCR,同时在 5 及 3 端分别加上 Sfi I,N ot I酶切位点 .经 Sfi I,N ot I酶切后 ,在 T4连接酶的作用下将 Sc Fv与 p CANTAB 5 E噬菌粒连接 ,电转化进入TG1大肠杆菌 ,挑取 12个单菌落提取质粒用 Eco R 和 H ind 进行酶切鉴定 ,后经 M13KO7辅助噬菌体拯救 ,离心收集上清即为全套 Sc Fv基因的噬菌体表面展示文库 .结果　以OU A- OVA免疫小鼠 ,检测血清中抗体效价可达 (1∶ 2×10 6 ) ,用通用引物分别扩增出轻、重链片段的大小为 32 5 bp和 34 0 bp,将两者拼接得到约 72 0 bp大小的单链抗体库 ,以8× 10 1 1 的转化效率转染 TG1细胞 ,Eco R 和 H ind 酶切后 ,12个单菌落所提噬菌粒 DNA中有 10个切出了约为 2 .1kb的目的条带 ,所构建的噬菌体抗体库库容量约为 1.2× 10 8.经 M13KO7超感染后 ,测噬斑滴度为 9× 10 1 4 pfu· L- 1 .结论　成功地构建了钠泵抑制物噬菌体单链抗体库 .     

Pharmacological limitations of phage therapy

Abstract

Clinical trial results of phage treatment of bacterial infections show a low to moderate efficacy, and the variation in infection clearance between subjects within studies is often large. Phage therapy is complicated and introduces many additional components of variance as compared to antibiotic treatment. A large part of the variation is due to in vivo pharmacokinetics and pharmacodynamics being virtually unknown, but also to a lack of standardisation. This is a consequence of the great variation of phages, bacteria, and infections, which results in different experiments or trials being impossible to compare, and difficulties in estimating important parameter values in a quantitative and reproducible way. The limitations of phage therapy will have to be recognised and future research focussed on optimising infection clearance rates by e.g. selecting phages, bacteria, and target bacterial infections where the prospects of high efficacy can be anticipated, and by combining information from new mathematical modelling of in vivo pharmacokinetic and pharmacodynamic processes and quantitatively assessed experiments.     

噬菌体展示肽库技术应用的研究进展

噬菌体展示肽库技术是一种新的肿瘤筛选技术，它将随机多肽文库表达于丝状噬菌体的表面，使高通量筛选多肽配体变得容易些。该技术在研究蛋白质之间的相互作用、寻找肿瘤特异性抗原和治疗性靶肽以及在新型诊断试剂和疫苗研制中都有重要用途。     

噬菌体展示技术的研究进展

噬菌体展示技术是将外源蛋白通过与丝状噬菌体外壳蛋白融合而表达于噬菌体颗粒表面,被展示的外源多肽可保持相对独立的空间结构和生物活性。最近有实验表明噬菌体表面展示的外源多肽模拟了天然抗原的空间结构,利用筛选肽库的方法确定抗原的线性和构象型表位是可行的。这对于发现与疾病相关的抗原表位具有一定的普遍意义,有可能在未知的情况下进行疫苗及诊断分子的设计。     

噬菌体抗体库技术

１９７５年创立的Ｂ淋巴细胞杂交瘤技术［１］,使第一代抗体－血清多克隆抗体发展到了第二代抗体－单克隆抗体（ＭｃＡｂ）,并在医学和生物学领域得到广泛应用。但鼠源ＭｃＡｂ对人体具有免疫原性,而杂交瘤技术制备人源ＭｃＡｂ未获进展,这就极大地限制了ＭｃＡｂ作为...     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP2生物学特性的研究

目的　确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的形态与大小、裂菌特性、最佳感染复数、一步生长特性等基本的生物学特性。方法　电镜观察纯化噬菌体颗粒 ;制备PaP2噬斑 ,观察其特点 ;提取噬菌体感染的细菌基因组 ,用SmaⅠ酶切 ,通过脉冲场电泳观察酶切产物的带型特点 ;测定不同感染复数 ,培养 3 5h后细菌 噬菌体液中的噬菌体滴度 ;加入宿主菌及噬菌体使MOI =10 ,进行一步生长实验 ,在 0时刻和每隔 15min测定噬菌体滴度。结果　噬菌体PaP2头部直径约为 5 2nm ,无囊膜 ,有一短尾 ;噬斑雾状半透明 ,直径约 1～ 2mm ;被噬菌体感染的宿主菌基因组的SmaⅠ酶切产物带型 ,比未感染宿主菌的多出了 1条大于噬菌体基因组的片段 ;当MOI =10时宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高 ;绘制出了一步生长曲线。结论　PaP2属短尾噬菌体科 ,是溶原性噬菌体 ;最佳感染复数是 10 ;感染宿主菌的潜伏期是 75min ,裂解期是 90min ,平均裂解量是 3 4     

噬菌体抗体库几种筛选方法的比较

目的：对多种不同的噬菌体抗体库筛选方法进行比较研究。方法：应用抗原固相化吸附筛选法,生物素化抗原液相筛选法和解离速率筛选法对半合成噬菌体抗体库或轻链替换库进行抗角蛋白噬菌体抗体的筛选,比较各自的筛选效率和优缺点。结果：3种方法筛选抗角蛋白抗体均获成功,抗原固相化吸附筛选法效果可靠,所获抗体特异性高但抗原消耗量大,生物素化抗原液相筛选法方法敏感且节省抗原,可以根据实验目的和抗体库性质灵活调节筛选体系,其不足是筛选获得的克隆中容易出现非特异性结合的克隆,而解离速率选是选择性获得高亲和力抗体的有效手段,结论：不同的筛选策略各具优势,在实际应用中可根据不同的实验目的选择相应的筛选方法。     

大库容量人源性天然单链抗体库的构建

目的：构建一个大库容量（＞10^8）的人类天然单链抗体库。方法：从正常人400mL外周血分离林巴细胞,提取mRNA后反转录出cDNA第一链, 行半套式PCR扩增VH和VL基因片段,依次插入含Loxp和Loxp511序列的pDNA5,电转化TG1大肠杆菌,构建初级库进一步用初级库感染BS1365使其VH,VL发生重组从而获得次级库。结果：所有VH,VL亚类基因都得到了扩增,scFv克隆效率为99．9％,重组效率为每个单克隆BS1365中含至少8种不同的scFv基因。初级库容量为10^7,次级库容量至少为10^11。结论：我们采用细胞内重组的方法构建了10^11的人类天然抗体库。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组测序

目的 对新分离的铜绿假单胞菌dsDNA溶原性噬菌体PaP3进行基因组测序。方法 用CsCl梯度离心纯化噬菌体PaP3颗粒，撮噬菌体基因组DNA，建立shot-gun随机文库，从文库中随机挑取克隆进行测序并完成序列组装，同时通过限制性内切酶图谱结合酶切片段的变性、复性实验分析基因组末端。结果 共进行了778条序列的测定与拼接，测序量达到13.5倍覆盖率，得到一条长为44249bp的重叠群，此重叠群错误率为9.46ERR/10KB，测序结果和酶切图谱分析表明该PaP3基因组是一44249kp长的线笥平端dsDNA分子。其碱基组成为A＝24.24%，G＝26.18%，T＝23.63%，C＝25.94%；稀有碱基＝0；A＋T＝47.87%，C＋G＝52.13%。结论 噬菌体PaP3基因组是由44249bp组成的线性平端双链DNA分子。测序完成为生物信息学分析和功能基因研究奠定了基础。     

噬菌体展示随机十五肽库的构建

为了满足药物筛选的需要,本实验以pCANTAB 5E噬菌粒为载体,构建表达于丝状噬菌体尾丝蛋白P3N末端的随机十五肽库。通过自行设计引物与模板,人工合成编码随机十五肽的寡核苷酸片段及含有酶切位点的引物。通过PCR技术进行模板扩增获得编码随机十五肽的基因。将扩增后的目的基因经过Sfi Ι,Not Ι两个限制性内切酶双酶切后,与经同样双酶切的5′去磷酸化的噬菌粒载体连接,将重组产物电转入大肠埃希菌TG1感受态细胞。集合菌落后进行库容和多样性检验。所建肽库库容可达5×10⁸。随机挑取20个克隆测序,其核苷酸序列及推断出的氨基酸序列均随机。成功构建了库容量与多样性都满足筛选要求的噬菌体展示随机十五肽库。     

噬菌体显示库在病毒研究中的应用

噬菌体显示技术近年来在分子克隆领域应用极为广泛,其是将蛋白质表达于噬菌体表面,将病毒的抗原或抗体表达于噬菌体表面,或从噬菌体随机肽库中筛选出某种病毒的抗原或抗体表位,这些技术在病毒的研究中呈现出巨大的潜力,为病毒构象的研究及疫苗的开发开辟了新的途径。本文作者对噬菌体表面表达的抗原或抗体的构建及筛选作一综述。     

鼠抗脂多糖单链噬菌体抗体库的构建

目的　构建一个鼠源性的抗脂多糖 (Lipopolysaccharide ,LPS)单链噬菌体抗体库 ,以供进一步生物医学应用。方法　用纯LPS免疫BALB/c小鼠 4个星期后 ,从脾细胞中提取总RNA ,用RT PCR技术扩增出小鼠抗体重链、轻链可变区基因 (VH ,VL) ,然后用Linker将VH ,VL交联形成单链抗体可变区片段 (ScFv)。经NotI、SfiI双酶切后与经同样双酶切的pCANTAB5E噬菌粒载体相连 ,转化入感受态大肠杆菌TG1,构建鼠抗LPS单链噬菌体抗体库 ,并随机抽取转化后的 4个大肠杆菌TG1菌落 ,以检测外源DNA的转入情况。结果　ELISA法检测小鼠血清中抗LPS的效价为 1∶12 80 0。提取的总RNA浓度为 12 .3 813 μg/ml ,纯度较好。扩增出的VH长约 3 4 0bp ,VL长约 3 2 0bp ,ScFv长约 80 0bp。转化入TG1后有约 1.9× 10 7个菌落 ,抽提 4个菌落后经SfiⅠ、NotⅠ双酶切的结果显示有 1个菌落的质粒转化进了外源DNA片段。结论　成功地构建出了一个有效库容量为 4.75× 10 6的鼠抗LPS单链噬菌体抗体库。     

噬菌体呈现技术研制特异性人抗骨肉瘤干扰素

目的利用噬菌体表面呈现技术研制高活性、特异性抗骨肉瘤干扰素。方法将干扰素IFNαlc／86DDNA插入噬菌体质粒载体pCANTAB5E,并构建噬菌体IFNαlc／86DAB环突变文库;通过在OS732细胞上竞争性亲合洗脱、MTT法对比检测抗肿瘤活性,筛选针对OS732细胞的高活性噬菌体-IFN突变体。结果获得2个噬菌体-IFN突变体,其抗OS732细胞增殖活性较突变母体分别提高4和16倍。结论αl型干扰素可在噬菌体表面正确折叠表达。这一技术可用于研制高活性特异性IFN。     

噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用

噬菌体展示技术是近年发展起来的新技术,在研究蛋白质与蛋白质之间、抗原抗体之间的相互作用、新药开发、疾病诊断、疫苗研制以及病毒研究等方面具有广泛应用。文中就噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用现状作一综述。     

噬菌体Chy2生物扩增法的建立及其检测效果的评价

目的 建立噬菌体Chy2生物扩增法,并评价其检测临床痰标本结核分枝杆菌的应用价值.方法 噬菌斑测试法观察噬菌体杀灭剂灭活Chy2的工作浓度和作用时间;噬菌斑计数法判断Chy2的最佳感染时间和感染滴度;分别用噬菌体Chy2和D29生物扩增法检测58份临床痰标本,以改良罗氏培养法作诊断标准,对比评价Chy2和D29的检测准确性.结果 6％硫酸亚铁铵溶液作用5 min可彻底灭活游离Chy2;Chy2滴度为2.2×1011CFU/mL时,与结核分枝杆菌孵育4h的感染效率最高;噬菌体Chy2生物扩增法对痰标本的检测灵敏度、特异性、Youden指数、阳性预测值和阴性预测值分别为94.7％、85.0％、0.797、0.923、0.895,噬菌体D29生物扩增法的检测结果相应为76.3％、95.0％、0.713、0.967、0.678,噬菌体Chy2生物扩增法的灵敏度、阴性预测值优于噬菌体D29生物扩增法(P＜0.05),两者特异性、Youden指数、阳性预测值无统计学差异(P＞0.05).结论 成功建立了噬菌体Chy2生物扩增法,Chy2较D29检测特异性相当,灵敏度有所提高.     

CD28噬菌体展示载体的构建及鉴定

目的：构建CD28分子胞外区噬菌体展示载体，并对其展示的CD28抗原性进行检测。方法：采用RT-PCR方法扩增CD28胞外区，将其重组于噬菌粒栽体pComb3HSS，构建的重组载体与辅助噬菌体VCSMl3共转染受体菌，使CD28胞外区展示在噬菌体表面。用ELISA和流式细胞仪检测展示在噬菌体上CD28的抗原性。结果：成功构建了CD28的重组噬菌体展示载体pComb3HSS．CD28。噬菌体展示的CD28可与抗CD28抗体结合，也可与Jurkat T细胞表面的CD28竞争性结合抗CD28的抗体。结论：噬菌体展示的CD28具有抗原性。     

噬菌体随机展示肽库及其应用

噬菌体随机展示肽库是一类利用丝状噬菌体发展起来的多肽文库.通过噬菌体展示技术,目前人们已能借助此类文库研究包括抗原决定簇的鉴定、疾病的诊断与治疗等许多领域的诸多关键性问题.本文简介此类文库的基本作用原理及应用.     

卵清白蛋白宫内致敏胎鼠的实验研究

Th1或Th2型免疫反应在由环境过敏原引发的多数过敏性疾病中起重要作用.了解对抗原物质产生特定的Th细胞免疫记忆反应最初如何形成是研究过敏性疾病病因的关键问题,因此寻找"致敏的窗口期"就显得非常重要[1].临床表明,纯母乳喂养的婴儿生后从未接触其它食物抗原如牛奶、鸡蛋等,但很早出现皮肤或消化道症状,并被证实为牛奶或鸡蛋过敏,提示母孕期食物抗原暴露可能是早期致敏原因之一.本研究通过对不同妊娠期BALB/c鼠腹腔注射食物抗原一卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)的方法,寻找宫内致敏的窗口期.     

大肠癌抗原cDNA噬菌体表达库的构建及鉴定

目的 :构建人源性大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 .方法 :从人大肠癌组织中提取总RNA ,纯化mRNA ,用RT PCR反转录合成cDNA第一链 ,用LD PCR合成cDNA第二链 ,除去小于 5 0 0bp的小片段 ,与去磷酸化的λTriplEx2噬菌体连接 ,体外包装 .转染E .coliXL1 Blue大肠杆菌 ,滴定文库的滴度 ,确定文库容量大小 ,用ITPG和X gal测定重组率 .用SfiⅠ酶切鉴定插入的cDNA片段大小 .结果 :构建成含 2 .39× 10 6重组子的人大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 ,重组率为 97.5 % ,插入外源cDNA片段大小范围从 1～ 4kb ,平均长约 2 .4kb .结论 :成功构建人大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 ,适合于大批量筛选cDNA克隆的大肠癌相关抗原基因