Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin 4 induce the malignant transformation of the bone marrow-derived human adult mesenchymal stem cells

Background  The purpose of the study was to examine the effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 4 (IL-4) on the bone-marrow-derived human adult mesenchymal stem cells (hMSCs).

Methods  The hMSCs were isolated and cultured with GM-CSF and IL-4 for a period of one month. A single colony of transformed cells was then isoloated and their phenotype was characterized by morphology, surface marker expression, and in vivo tumorigenesis.

Results  After one month culture, the transformed mesenchymal cells exhibited the morphology and phenotype similar to those of tumor cells, and also caused multiple fast growing lung deposits when it was injected into immunodeficient mice.

Conclusion  Cytokines-driven malignant transformation of hMSCs may be a useful model for studying signaling pathways initiating malignant transformation of hMSC.

     

小鼠骨髓来源树突状细胞培养鉴定和诱导T淋巴细胞增殖

目的:建立一种体外诱导培养小鼠树突状细胞(DCs)的方法,并观察其不同生长阶段生物学形态及刺激淋巴细胞增殖的能力。方法:联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)诱导培养小鼠骨髓单个核细胞向DCs分化,并从形态学、表型及功能方面对其加以检测。结果:用GM-CSF和IL-4诱导培养小鼠骨髓来源的单核细胞,3 d后可见细胞形态改变,并呈集簇生长,培养至5 d可见典型的树突状突起,体外诱导培养8 d后获得大量成熟的DCs,扫描电镜可见典型的树突状细胞形态,高表达骨髓来源DCs特异性标记CD11c和共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ,成熟DC具有很强的刺激同基因型和同种异基因型T淋巴细胞增殖的能力。结论:小鼠骨髓来源的单个核细胞体外诱导培养可生成大量成熟的DCs,为进一步抗肿瘤疫苗的实验研究奠定了基础。     

克隆化的人骨髓间充质干细胞系的建立及其生物学特性的研究

目的:分离人骨髓间充质干细胞(hMSCs),建立克隆化扩增的细胞系并初步鉴定其分化特性和细胞的分子标记.方法:利用间充质干细胞贴壁生长的特性,显微镜下挑取原代单个成纤维样生长单位中的细胞,逐步扩大培养,最终得到克隆化扩增的hMSCs.选择有利于其生长的血清,低密度培养,传70%～80%生长汇合时传代保种.RT-PCR检测其Oct-4、SDF1、CD49a、CK19、c-met基因的表达;流式细胞术检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD14、CD44、CD29、CD90、HLA-1和HLADR;体外向骨、软骨、脂肪细胞方向诱导分化鉴定其分化潜能.结果:建立了人骨髓间充质干细胞系并在体外实现了克隆化扩增,该细胞系在体外连续培养达60个细胞倍增时间仍保持多向分化的潜能.细胞不表达CD34、CD45、CD14、HLA-DR,但表达Oct-4、SDF-1、CD49a、CK19、c-met、CD44、CD29、CD90、HLA-1.体外能诱导出骨、软骨、脂肪细胞.结论:得到了一个可稳定传代的克隆化扩增的人骨髓间充质干细胞系,该细胞系在体外可以分化为骨、软骨、脂肪细胞,并表达Oct-4、CK19和c-met.     

人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向血管内皮细胞（ECs）诱导分化的可行性。方法：用贴壁法从成人骨髓中分离出间充质干细胞,培养扩增后,加入10ng／ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和人血管内皮生长因子（hVEGF）向ECs诱导分化,分别于0、24d流式细胞术检测细胞表型及荧光染色鉴定细胞。结果：hMSCs向ECs诱导分化24d,细胞CD34、KDR转为阳性,CD54、CD106、vWF表达增加。可摄取ac—LDL,并可结合UEA。结论：hMSCs经bFGF和VEGF作用,分化为具有ECs的表型和部分功能的细胞。     

人骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的:探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外分离培养及鉴定。方法:成人骨髓取自手术中非血液系统疾病、非肿瘤及乙肝表面抗原阴性患者摘取的肋骨,采用贴壁筛选法进行体外扩增;用免疫组织化学法对培养的细胞进行鉴定。结果:体外培养的原代hMSCs9d融合,免疫组织化学染色CD44表达阳性。结论:贴壁筛选法在体外很容易分离培养和扩增hMSCs,可作为获得hMSCs的一种有效手段。     

STUDIES ON THE RELATIONSHIP BETWEEN CHROMOSOME No15 AND THE BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF MALIGNANT TRANSFORMED SYRIAN HAMSTER FIBROBLAST CELL LINES

During the course of malignant transformation of mammalian cells in vitro,a regular varia-tion in chromosome number and structure is usually found.In order to elucidate the rela-tionship between chromosomal changes and maligannt expression,we isolated fire clonesfrom a malignant transformed Syrian hamster fibroblast cell line and analyzed their biologicalcharacteristics,as well as chromosomal changes.A positive correlation betweetn chromosomeNo 15 monosomy and the transformed and malignant phenotype was observed.We suggestthat a suppression gene may be located on chromosome No 15,and its deletion or the lossof the chromosome may result in expression of the malignant phenotype.     

微小RNA可在人骨髓间充质干细胞分化来源的心肌样细胞中表达

目的研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）分化来源的心肌样细胞中代表性微小RNA（miRNAs）的表达。方法利用FITC-偶联的CD29、CD34和CDllb抗体在流式细胞仪上检测分离的hMSCs的抗原表型。分别用5-氮胞苷（5-aza）和乳鼠心肌非接触共培养法诱导传至3代的hMSCs分化为心肌样细胞。用免疫化学法检测hMSCs分化来源的心肌样细胞中心肌特异的α-肌节辅肌动蛋白和心肌肌钙蛋白（cTnI）的表达：利用逆转录PCR和DNA测序鉴定5个代表性的心脏特异的初级微小RNA（pri-miRNAs）的表达。结果hMSC标志分子CD29表达率为98．87％．而造血细胞标志分子CD34和CDllb的表达率只是5％和0．4％。免疫化学分析显示．分别经5-aza和乳鼠心肌非接触共培养诱导的hMSC均可表达α-肌节辅肌动蛋白和cTnI,而在未分化的hMSCs中无表达。miRNA-143,-181可在5-aza诱导的hMSCs中表达,miRNA．143,-181,-206,-208可在乳鼠心肌非接触共培养的hMSCs中表达．而两种诱导方法均未能诱导miRNA-1-2在hMSCs中表达。结论利用5-aza和乳鼠心肌非接触共培养法诱导hMSCs分化的心肌样细胞中可以表达不同的心脏特异的pri-miRNAs。     

人骨髓间充质干细胞脑内移植对大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用

目的:观察人骨髓间充质干细胞(hMSCs)移植对缺氧缺血性脑损伤幼年大鼠脑功能影响及其在脑组织中的迁移、分化过程,探讨hMSCs移植对缺氧缺血性脑损伤的保护作用,为后续研究奠定基础.方法:大鼠随机分为hMSCs移植组(n=18)、移植对照组(n=18)、模型组(n=6)和假手术组(n=6).前3组均建立幼年Wistar大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型,3 d后hMSCs移植组缓慢注射约5×105 个hMSCs至大鼠的左背侧海马,移植对照组注射等体积的磷酸盐缓冲液,假手术组和模型组未移植.其中hMSCs移植组和移植对照组又随机分为5组,分别于移植后0 d、3 d、1周、2周(均n=3)和4周(n=6)处死.模型组与假手术组均于造模后31 d(即移植后4周)处死.大鼠处死前均行交替电刺激Y迷宫行为学实验,处死后取脑组织行H-E染色观察病理变化;hMSCs移植组和移植对照组大鼠同时还行免疫组化染色检测hMSCs在脑内的分布.结果:免疫组化结果显示hMSCs移植后1周主要沿脑室系统迁移,部分沿胼胝体向对侧迁移,移植后4周细胞沿脑室向周围实质迁移,广泛分布于脑组织.Y迷宫实验显示hMSCs移植组总错误次数(TE)明显少于移植对照组(5.00±2.82 vs 12.67±3.72),差异有统计学意义(P<0.05),提示hMSCs移植组大鼠空间记忆能力显著优于移植对照组.H-E染色结果显示hMSCs移植组大鼠脑组织损伤较移植对照组及模型组轻.结论:hMSCs脑内移植后可在大鼠中枢神经系统内存活并迁移,且hMSCs移植能在一定程度上促进损伤脑组织和脑功能的恢复,值得进一步研究.     

人外周血树突状细胞的体外培养扩增

目的：P在体外从人外周血中培养坟拉树突状细胞。方法：从正常人外周血分离PBMC,经两次孵育粘附,弃去悬浮细胞后加细胞因子（GM-CSF,IL-4）和培养液进行培养,并对培养过程进行观察鉴定。结果：培养1周后即可培养出典型的树突状细胞,经FITC-CD1a单抗标记a表达率为65%,并能刺激同种淋巴细胞增殖反应,结论：利用GM-CSF和IL-4可以从人外周血中扩增出大量DC,可为后续研究做准备。     

小鼠脾脏来源树突状细胞的体外扩增培养

目的建立简便的体外扩增小鼠脾脏树突状细胞(DC)的方法。方法联合应用粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)诱导培养小鼠脾脏单个核细胞分化为DC,并从形态学、表型及功能方面对其加以检测。结果体外诱导培养8 d后获得大量成熟的DC,细胞表面具有典型的树枝状突起,高表达DC相对特异性表面分子CD11c(78.5%)、MHC-Ⅱ(92.7%)及CD86(87.2%),同时具有较强的刺激同种异基因混合淋巴细胞增殖能力。结论小鼠脾脏细胞体外诱导培养可生成大量功能成熟的DC,为进一步抗肿瘤疫苗的研究奠定了基础。     

慢性乙型肝炎病人外周血树突状细胞功能的研究

目的：体外培养慢性乙型肝炎病人的树突状细胞,并从细胞表型和功能方面与正常人树突状细胞进行比较。方法：从慢性乙型肝炎病人及正常人外周血分离单个核细胞,加入含1000U／ml GM-CSF和500U/ml IL-4的无血清培养基AIM－V体外培养,获得树突状细胞。利用流式细胞仪检测细胞因子TNF－α对树突状细胞培养的影响,IL－12ELISA试剂盒检测树突状细胞分泌IL－12的水平,并采用MLR方法检测树突状细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果：1．慢性乙型肝炎病人的外周血单个核细胞用AIM－V培养及细胞因子诱导后,可获得成熟的具有典型形态的树突状细胞,加入TNF－α后,IL－12分泌增高,CD83表达增加;2．病人树突状细胞与正常人比较,CD80表达较正常人的低（P＜0．05）,刺激同种异体T细胞增殖能力低于正常人。结论：1．慢性乙型肝炎病人的树突状细胞与正常人一样可用AIM－V无血清培养基及特定的细胞因子诱导在体外大量获得;2．慢性乙型肝炎病人的树突状细胞与正常人相比较在功能上降低,在形态数量上差异无显著意义。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为心肌细胞实验方法的建立

目的:探讨体外培养并诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs) 分化为心肌细胞（CMs）的实验方法。方法:采用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离、纯化hMSCs,采用5-氮杂胞苷( 5-Aza)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对hMSCs进行联合诱导,诱导3～4周,观察细胞形态学的变化,免疫组织化学方法鉴定肌细胞及心肌细胞特异蛋白的表达。结果:hMSCs体外经5-Aza 和bFGF联合诱导1～2周后,细胞体积较诱导前增大,呈长梭形。诱导2～3周后细胞伸出伪足呈多爪形;诱导3～4周后细胞伪足间相互连接形成肌管样结构。联合诱导3～4周后免疫组织化学鉴定结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白(cTnⅠ)和横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）表达均呈阳性。结论:hMSCs在体外经5-Aza和bFGF联合诱导可以分化为CMs。     

Role of cyclinD1 and CDK4 in the carcinogenesis induced by silica

To study the role of cyclinD 1 and CDK4 in malignant transformation of human fetal lung diploid fibroblast cell line （2BS） induced by silica. Methods Recombination vectors with sense and antisense pXJ41-cyclinD1 and pXJ41-CDK4 were constructed, and then transfected into the malignant transformed cells induced by silica, respectively. At the same time, pXJ41-neo was used as the control. Results During the progress of the malignant transformation of 2BS cells induced by silica, cyclinD 1 and CDK4 were overexpressed. Antisense RNA suppressed cyclinD 1 and CDK4 gene expression in the antisense pXJ41-cyclinD1 and pXJ41-CDK4 transfected cells. Antisense RNA led to cell cycle arrest, resulting in lengthened G1 phase （the percentages of cells in the G1 phase changed from 45.1% to 52.7% and 58.0% for cyclinD1 and CDK4 transfected cells, respectively）, and eventually attenuated the increase of the proliferation of malignant transformed cells induced by silica. Compared with malignant transformed cells induced by silica, cells transfected with antisense pXJ41-cyclinD1 and pXJ41-CDK4 showed obviously reduced growth rates. On the 8th day, the suppression rates were 58.69 and 77.43% （the growth rate of malignant transformed cells induced by silica was 100%）, doubling time changed from 21.0 h to 31.4 h and 21.0 h to 42.7 h, respectively, the growth capacities on soft agar of cells transfected by antisense pXJ41-cyclinD1 and pXJ41-CDK4 decreased obviously. Conclusion CyclinD 1 and CDK4 play an important role in maintaining transformed phenotype of the cancer cells.     

CGRP对人骨髓间充质干细胞增殖影响的研究

目的探讨外源性重组人降钙素基因相关肽（hCGRP）对人源性骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）的增殖的影响,进而探索CGRP促进成骨的作用机制。方法采用梯度离心法和选择性培养基分离、纯化骨髓间充质干细胞,培养体系中添加不同浓度CGRP。于传代第三代进行细胞鉴定,光镜下观察细胞形态、MTT法检测细胞增殖能力、流式细胞仪测定细胞周期,以观察CGRP对MSCs增殖能力的影响。结果CGRP对MSCs增殖形态无明显影响,MTT示CGRP组细胞增殖速率快于对照组,流式细胞仪检测示CGRP组的MSCs的G2/G1期比例明显升高。结论CGRP对MSCs的增殖有直接促进作用,从而有利于骨形成。     

腺病毒介导多基因在胆管癌细胞中的表达

研究腺病毒介导的多基因（ＧＭ－ＣＳＦ,Ｂ７－１,ｐ５３、ＩＬ－２）在胆管癌细胞系ＱＢＣ９３９中的表达及对其生长的影响。方法：构建同时含ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ７－１、ｐ５３、ＩＬ－２ ４种目的基因的重组腺病毒载体Ａｄ－ｍｕｌｔｉｇｅｎｅｓ,应用流式细胞仪、ＥＬＩＳＡ、免疫组化等方法。     

人骨髓间充质干细胞分离培养鉴定及VEGF基因的转染

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSC）分离培养、鉴定方法及人血管内皮生长因子（hVEGF）165基因转染hMSC后表达情况,拟构建血管化组织工程皮肤.方法：用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,筛选贴壁细胞培养并传代.观察细胞形态,生长情况.检验细胞CD44、CD29、CD14、CI45等表面标记.利用基因重组技术,构建pCDN3.1＋VEGF表达质粒,并将其转染第3代hMSC.经G418抗性筛选后扩大培养并用Western blot实验检测其蛋白产物.结果：骨髓密度梯度离心法分离hMSC,接种培养瓶后26 h呈对数生长,6d后达到高峰.hMSC表达CD29,CD44,不表达造血细胞标记物CD14和CD45.通过酶切鉴定验证成功构建pCDN3.1＋ VEGF表达质粒.Western blotting实验证实转染后hMSCs表达VEGF增加.结论：成功建立hMSC分离培养鉴定体系.利用基因重组技术可成功将hVEGF基因导入hMSC并产生预期效应.     

人骨形成蛋白-7基因在人骨髓间充质干细胞中的表达和对其分化表型的影响

目的：观察人骨形成蛋白-7(BMP-7)基因在人骨髓间充质干细胞(hMSC)中的表达及对其成骨表型的影响。方法：利用AdEasy腺病毒表达系统构建人BMP-7基因表达腺病毒AdB7V，体外感染hMSC后观察绿色荧光蛋白(GFP)表达及RT-PCR、免疫组化方法鉴定外源基因的表达，通过对感染细胞的碱性磷酸酶(ALP)染色和钙盐染色鉴定其成骨分化表型。结果：hMSC经AdB7V感染后72h可观察到GFP表达，RT-PCR、免疫细胞化学方法证实外源性BMP-7在hMSC中表达，感染细胞的ALP染色和钙盐染色均为阳性。结论：外源性的人BMP-7基因可在hMSC中表达并诱导其向成骨细胞分化。     

体外模拟心肌微环境中人骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

目的：研究在体外模拟心肌微环境中人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向心肌细胞（CM）的分化。方法：体外分离培养扩增hMSCs,进行流式细胞仪分析鉴定其免疫学表型CD34、CD44和CD45,以未加一抗只加二抗的hMSCs作为平行对照组;同时原代培养SD乳鼠的CM以模拟体外心肌微环境。选用生长良好、纯度达到95%的第5代hMSCs,与乳鼠原代培养的CM共培养,并进行心肌特异性标志cTnI的免疫组化鉴定。结果：体外分离纯化培养扩增出的hMSCs,不表达CD34及CD45,高表达CD44,其CD44阳性率平均为（93.26±2.48）％,与平行对照组［(3.42±1.09)%］ 比较差异有显著性(P<0.01)。hMSCs与CM共培养后,其形态逐渐向CM形态过渡,并表达心肌特异性抗体cTnI。结论：hMSCs在体外模拟的心肌微环境中可分化为CM,干细胞的分化具有环境依赖性。     

人骨髓间充质干细胞与汗腺细胞共同培养诱导细胞表型转化的初步研究

目的研究人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs)在体外与损伤的人汗腺细胞(human sweat gland cells, hSGCs)共培养时的转化情况.方法体外分别分离培养和扩增hMSCs和hSGCs,用二步免疫细胞化学法检测hMSCs和hSGCs抗原表达情况.用5 μmol/L的5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)对培养的hMSCs进行连续培养标记.待原代培养的hSGCs达70%融合后,给予47℃高温处理40 min造成热损伤体外模型,37℃冷却1-2 h,然后加入(1-2)×105 BrdU标记的hMSCs共同培养,2周后,以抗癌胚抗原(CEA)和抗BrdU单克隆抗体作为一抗,采用免疫细胞化学双染法检测共培养的细胞.结果 hMSCs 和hSGCs均呈克隆样生长, hMSCs表达CD44和CD105,不表达CD34和CEA;hSGCs表达CK7、CK8、CK19、CEA.用BrdU 标记hMSCs 阳性率可达90%,hSGCs经高温损伤后,大多数细胞的细胞间连接消失.共培养2周后,部分细胞同时表达CEA和BrdU,并有多核现象.细胞染色示双染细胞可达1%～5%,多核细胞且核染色不同的细胞约为0.01%～0.05%,多核细胞与其他双染细胞相比,细胞明显的宽大扁平.结论在损伤的微环境下,hMSCs可以向hSGCs转化,其机制可能是细胞分化、细胞融合甚至是核融合.     

IL-6抑制LPS诱导的小鼠髓源性DCs成熟的实验研究

目的观察白细胞介素-6(IL-6)对于内毒素(LPS)诱导的小鼠髓源性树突状细胞(DC)成熟效应的抑制作用。方法分离小鼠骨髓细胞,采用黏附法结合GM-CSF和IL-4刺激法在体外培养髓源性DCs(BMDCs)。用相差倒置显微镜观察BM-DCs的形态特点。用LPS诱导DC成熟。采用FACS结合混合淋巴细胞反应,观察IL-6处理与否,LPS诱导的BMDCs在表型和刺激同种淋巴细胞增殖功能上的变化。结果形态观察和FACS分析的结果表明:体外成功培养了纯度较高的高表达CD11c的BMDCs,LPS能明显诱导BMDCs表面MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD40的表达上调;而经过IL-6处理后,LPS诱导BMDCs表面CD80、CD86、CD40表达上调的能力被显著削弱(P0.05)。混合淋巴细胞反应显示,与单独用LPS处理的BMDCs相比,经IL-6处理后的BMDCs刺激同种淋巴细胞增殖的能力明显减弱,并呈剂量依赖关系(P0.05)。结论IL-6能明显抑制LPS诱导的BMDCs成熟,可能是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一。