ELK-1 rniRNA干扰质粒构建及鉴定

目的 设计及构建ELK-1微小干扰核糖核酸(miRNA)质粒,最终鉴定出有效干扰质粒.方法 设计及构建4对ELK-1的pcDNATM 6.2-GW/EmGFPmiR miRNA及1对无效对照miRNA干扰质粒,通过测序鉴定.将干扰质粒用脂质体法转染293T细胞,通过顺时转染获得细胞系.通过倒置荧光显微镜下观察绿色荧光确定转染效率,RT-PCR检测4对干扰质粒、阴性对照质粒ELK-1的mRNA的表达水平.结果 测序表明,ELK-1干扰序列及读框完全正确,干扰质粒瞬时转染的293T细胞系在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光达90%以上.RT-PCR结果显示,MR-2、MR-3干扰质粒对ELK-1 mRNA有较好的抑制效果.结论 成功构建了ELK-1干扰真核表达载体,筛选出有效干扰质粒,为进一步研究ELK-1在肿瘤细胞中的作用提供参考.     

表皮生长因子受体基因RNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定研究

目的构建表皮生长因子受体(EGFR)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据。方法合成EGFR基因的miRNA干扰序列,构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-EGFR质粒,测序验证插入序列正确,连接到慢病毒载体pLenti6.3-MCS/V5 DEST中,获得pLenti6.3-EGFR-miRNA质粒,与慢病毒包装质粒Packaging MIX、POLOdelivererTM3000 Transfection Reagent共转染293T细胞株,细胞包装产生慢病毒颗粒,测定慢病毒滴度。结果 PCR和测序结果证实,EGFR miRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液滴度为1.8×106ifu/ml。结论成功构建EGFR基因RNAi慢病毒载体,为研究其在胶质瘤细胞中的生物学功能奠定基础。     

RORα miRNA真核表达载体构建及对人胃癌细胞增殖的影响

目的构建RORα(Retinoid acid receptor related orphan receptorα,维甲酸相关孤核受体α)miRNA真核表达载体,分析其对人胃癌MGC803细胞RORα蛋白表达及细胞增殖的影响。方法构建针对设计RORαmiRNA表达的3对miRNA干扰序列,克隆入pcDNATM6.2-GW/EmGFP miRNA真核表达载体,在测序鉴定无误后将含RORαmiRNA转染人胃癌MGC803细胞,用Western blo检测MGC803细胞转染前后RORα蛋白的表达水平变化。MTT法检测对转染MGC803细胞增殖的影响。结果 Western blot结果证实,MGC803细胞转染RORαmiRNA后24h RORα蛋白表达水平明显低于转染阴性组(P<0.05)。MTT结果显示,转染RORαmiRNA后细胞增殖率(光吸收值)高于转染阴性组(P<0.05)。结论 miRNA靶向抑制RORα表达后,可促进人胃癌MGC803细胞增殖,提示RORα是一个潜在的胃癌基因及药物治疗的靶点。     

大鼠VR1基因siRNA表达载体的构建及体内研究

目的探讨辣椒素受体(vanilloid receptor subtype1,VR1)在慢性疼痛发生机制中的作用,构建携带VR1siRNA的慢病毒载体并检测其对大鼠DRG神经元VR1基因的干扰作用。方法设计靶向大鼠VR1基因的发夹状siRNA,合成两对互补的寡核苷酸序列,退火后克隆到酶切的pRNAT-U6.2/Lenti siRNA载体,通过PCR和DNA测序鉴定重组质粒。空载体及重组质粒分别与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生成慢病毒载体。通过蛛网膜下腔将慢病毒载体注射到大鼠体内,采用RT-PCR方法检测L4-L6DRG神经元内VR1的沉默效果。结果测序鉴定证实目的寡核苷酸片段被克隆到pRNAT-U6.2/Lenti载体中;经蛛网膜下腔注射后,pRNAT-U6.2/Lenti-siVR1可下调正常大鼠L4-L6DRG神经元内VR1mRNA的表达。结论成功构建了靶向VR1基因的siRNA载体,可有效抑制VR1mRNA的表达,为深入研究和治疗慢性痛提供了有力的工具。     

胰腺癌Bx-PC3细胞Survivin基因ShRNA质粒表达载体的构建

目的：构建针对胰腺癌Bx—PC3细胞Survivin基因2条shRNA的质粒表达载体。方法：以Survivin基因为靶点，通过自行设计并构建包含两段短发夹状RNA（small hairpin RNA，shRNA），携带有各自的U6启动子和终止码、共同的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，EGFP）基因和Neo基因的pGenesil-1 Survivin shRNA载体，利用脂质体介导的方法转染人胰腺癌Bx—PC3细胞，RT—PCR观察其对Bx—PC3细胞Survivin基因表达的影响。结果：HE1质粒和HE2质粒的酶切鉴定正确，质粒转化菌液HE1、HE2进行测序分析均为插入正确的克隆质粒。胰腺癌Bx—PC3细胞转染成功。转染细胞后SurvivinmRNA的表达有明显抑制。结论：实验构建针对胰腺癌细胞Survivin基因2条shRNA的质粒表达载体成功。     

大鼠促黄体素基因β亚基的克隆和在COS细胞中的表达

从摘除卵巢的雌性大鼠脑垂体中提取总RNA，利用RT-PCR技术扩增了促黄体素（LH）的亚基基因。序列分析表明该基因序列与国外报道的促黄体素（LH）的亚基基因序列安全相同。将该基因片段插入到真核表达载体pcDNA3.1(-)上，构建表达质粒pcDNA3.1(-)/LH，利用脂质体包裹技术转染COS细胞，放免检测结果显示LH的表达量达6.2miu/ml。     

LYRM1基因过表达对P19细胞凋亡的影响

目的 观察LYRM1基因过表达对P19细胞凋亡的影响.方法 将人LYRM1基因的真核表达载体(pcDNATM 3.1/myc-HisB-LYRM1)和空载体pcDNATM 3.1/myc-HisB,分别转染P19细胞,通过G418筛选2周,建立稳定过表达人LLYPM1基因的P19细胞系.用Western blot技术验证稳定表达细胞株.将稳定转染pcDNATM3.1/myc-HisB-LYRM1载体质粒和空载质粒的P19细胞以无血清培养基37℃孵育24 h以诱导细胞凋亡,收获细胞用流式细胞术检测细胞凋亡.结果 建立了稳定转染LYRM1的P19细胞系,成功地表达了目的 基因.流式细胞术检测结果发现过表达LYRM1基因的P19细胞凋亡率显著降低.结论 LYRM1基因具有抑制P19细胞凋亡的作用.     

Id1 miRNA表达载体构建与转染乳腺癌细胞

目的构建正义、反义Id1真核表达载体,并成功转染乳腺癌MDA．MB-231细胞系,筛选稳定表达细胞株。方法设计针对Id1基因的mRNA效的干扰序列。将干扰序列插入pcDNA6．2-GW／EmGFP-miR表达载体,构建Id1 miRNA真核表达载体,脂质体转染法转染乳腺癌MDA-MB-231细胞系,杀稻瘟霉素筛选稳定表达的细胞株。结果Id1 mRNA真核表达载体的构建后,经酶切及测序鉴定正确后。转染乳腺癌MDA-MB231细胞系。经过2周杀稻瘟霉素筛选,获得稳定表达的细胞系。经RT-PCR鉴定,转染Id1 mRNA真核表达载体的细胞系M1表达水平低于对照组。未转染组与阴性对照转染组无明显差异。     

靶向MMP-2基因的RNA干扰质粒表达载体的构建

目的 构建基质金属蛋白酶2(MMP-2)特异的RNA干扰(RNAi)质粒载体,用于探讨抑制MMP-2基因表达在抗胰腺癌侵袭转移中的意义.方法 根据GenBank中提供的MMP-2基因序列,设计能存体内转录小发央结构RNA(shRNA)的cDNA序列,合成该序列并将其连接到pGCsi-U6/Neo/GFP质粒,构建受控于人U6启动子的质粒表达载体.结果 PCR鉴定和测序鉴定显示构建的重组质粒pGCsi-MMP-2含有目的 基因序列.结论 靶向MMP-2基因的RNAi质粒表达载体被成功构建.     

UNC5B基因靶向shRNA表达质粒的构建及体外RNA干扰

目的：探讨人UNC5B基因的双链RNA在体外对UNC5B表达的干扰作用及其规律。方法：构建两个能产生UNC5B的发夹状RNA（shRNA）的质粒载体Pgenesil—UNC581及Pgenesil—UNC582作为实验组，并构建无关序列shRNA表达质粒Pgenesil—NC作为阴性对照，将3种质粒分别转染脐静脉内皮细胞（HUVEC）。转染24h后，荧光倒置显微镜下观察质粒转染效率，用G418筛选得到稳定转染的细胞，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测UNC5B在HUVECs中的表达情况。结果：转染24h后，在荧光显微镜下可见绿色荧光，转染效率约为40％～50％。实验组经G418筛选后稳定转染的细胞UNC5BmRNA均受到抑制。两种UNC5B基因靶向shRNA表达质粒对HUVECs中UNC5B抑制率分别为88％和52％。结论：本研究所构建的UNC5BshRNA表达质粒可在体外高效特异地抑制UNC5B的表达，为进一步实验奠定了基础。     

携带大鼠ICAM-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 探讨携带大鼠细胞问黏附分子1(ICAM-1)核糖核酸下扰(RNAi)的重组慢病毒构建方法,筛选出基因抑制效率最高的重组慢病毒.方法 (1)根据基因序列,设计并合成针对4个靶点的寡核苷酸,将其与双链DNA oligo进行连接反应;将连接产物转化DH5α大肠杆菌,PCR筛选获得阳性克隆并进行基因测序.(2)将重组载体与病毒包装质粒共转染人胚肾293 T细胞,获得病毒颗粒.(3)重组慢病毒体外转染NRK细胞,以RT-PCR法筛选出基因抑制效率最高的重组慢病毒.结果 (1)经过酶切、连接、转化后获得阳性克隆;基因测序结果完全正确.(2)经RT-PCR证实,3号病毒在感染复数(MOD=50时,基因抑制率即达到88.4%.结论 成功构建了含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的大鼠ICAM-1 RNAi慢病毒载体.     

结肠癌细胞株HT-29中针对Survivin基因的RNAi实验

目的：转染Survivin基因的siRNA对结肠癌HT-29细胞的影响。方法：设计2条针对Survivin基因CDS区不同位点的siRNA片段并构建shRNA表达载体,重组质粒使用阳离子脂质体法转染结肠癌细胞株HT-29。以空白质粒组作为阴性对照,Western blot法检测转染后Survivin基因的蛋白表达。结果：成功构建含有siRNA片段的shRNA重组质粒,转染HT-29细胞后,Survivin基因的蛋白含量明显下降。结论：构建Survivin基因的shRNA,脂质体瞬时转染结肠癌HT-29细胞,成功的沉默了Survivin基因。     

大鼠Adrb3基因重组慢病毒干扰载体的构建及其对血管平滑肌细胞Adrb3表达的影响

目的 构建大鼠Adrb3 （rAdrb3） 基因慢病毒干扰载体, 筛选高效率rAdrb3基因干扰序列, 观察其对大鼠血管平滑肌细胞 （VSMC） Adrb3基因表达的影响, 为进一步研究Adrb3在心力衰竭中的作用机制提供实验工具。方法 设计2条rAdrb3基因shRNA寡核苷酸序列, 构建慢病毒干扰质粒并进行测序鉴定。三质粒法共转染293T细胞包装慢病毒, 测定慢病毒滴度。大鼠VSMC设置正常对照组 （Normal组）, 空载慢病毒组 （Lv-rAdrb3-shRNA-control组）,携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体1组 （Lv-rAdrb3-shRNA-1组）, 携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体2组 （Lv-rAdrb3- shRNA-2组）, 感染5 d后, 收集细胞。提取细胞总RNA和蛋白, Real-time PCR检测rAdrb3 mRNA表达, Western blot 检测rAdrb3蛋白表达。结果 构建2个携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体, 滴度均为2×108 TU/mL。慢病毒感染大鼠 VSMC 72 h后, 感染效率可达80%。与Normal组比较, Lv-rAdrb3-shRNA-1、 Lv-rAdrb3-shRNA-2组Adrb3 mRNA水平沉默效率为87.18%、 65.27% （P＜0.05）; 与Normal组比较, Lv-rAdrb3-shRNA-1、 Lv-rAdrb3-shRNA-2组rAdrb3蛋白水平沉默效率为85.57%、 70.04% （P＜0.05）。结论 成功构建并筛选出有效携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体, 可显著抑制大鼠VSMC Adrb3的表达。     

STK15基因RNA干扰真核表达载体的构建及对人结肠癌细胞侵袭的影响

目的 构建STK15基因特异的RNA干扰（RNAi）真核表达质粒,将其转染人结肠癌细胞SW480后,观察对STK15基因表达的抑制作用及对肿瘤细胞侵袭能力的影响.方法 设计并合成能表达小发夹结构RNA （shRNA）的DNA序列,退火后与载体pGPU6/GFP/Neo连接,构建重组表达载体pGPU6/GFP/NeoSTK15 shRNA,转化DH5α菌株后挑选阳性克隆,提取质粒进行序列测定.脂质体介导重组质粒转染人结肠癌SW480细胞,于转染后24h和48 h通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白印迹法分别在mRNA和蛋白水平检测STK15基因的表达,并通过细胞体外侵袭实验检测肿瘤细胞的侵袭能力.结果 测序证实插入pGPU6/GFP/Neo载体的DNA序列、方向和位点均正确.与阴性质粒转染组比较,pGPU6/GFP/Neo-STK15 shRNA质粒转染细胞24h和48 h后,STK15基因的mRNA和蛋白表达水平均明显降低,且呈现时间依赖性,STK15 mRNA水平分别下调80％和98％,蛋白水平分别下调40％和80％.与阴性质粒转染组比较,pGPU6/GFP/Neo-STK15shRNA质粒转染细胞的侵袭能力分别下降约67％和89％.结论 成功构建了针对STK15基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制STK15基因的表达和细胞的侵袭能力,为进一步研究STK15基因功能以及探讨结肠癌治疗的新途径奠定了基础.     

RNA干扰沉默DDX1基因的胶质瘤细胞系的建立

目的以短发夹核糖核酸(RNA)慢病毒载体建立DEAD-box解旋酶1(DDX1)基因稳定沉默的胶质母细胞瘤细胞株。方法针对DDX1基因设计2组短发夹RNA序列,退火形成的双链DNA与线性p LKO. 1-puro-e GFP质粒载体连接,构建慢病毒质粒载体,测序正确后进行慢病毒包装;将获得的重组慢病毒转染人胶质瘤U251细胞,转染细胞分为对照组和干扰组,对照组转染对照慢病毒(sh NC);干扰组转染慢病毒载体p LKO. 1-puro-e GFP-shRNA-DDX1(sh DDX1-1,sh DDX1-2)。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,进行嘌呤霉素抗性筛选;用实时定量聚合酶链式反应(PCR)、蛋白免疫印迹法检测转染后U251细胞中DDX1 mRNA及蛋白表达。结果测序证实成功构建对照组和靶向DDX1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,病毒悬液滴度均> 3×10~8TU·m L^-1。荧光显微镜下观察显示,对照组和干扰组转染效率高于85%;嘌呤霉素筛选后,干扰组sh DDX1-1、sh DDX1-2中DDX1 mRNA的抑制率分别为85. 44%和71. 66%,DDX1蛋白表达水平分别下降了99. 1%和96. 7%,均较对照组(100%)显著降低(均P <0. 01)。结论成功构建沉默DDX 1基因的胶质瘤细胞系,为研究DDX1对胶质瘤生物学行为的影响提供细胞模型。     

PC12细胞SLC6A4基因沉默稳转细胞系的建立及SLC6A4基因沉默对缺氧PC12细胞凋亡的影响

目的 构建SLC6A4基因RNA干扰（RNAi）-短发夹RNA（shRNA）慢病毒表达载体,建立慢病毒介导沉默SLC6A4基因的PC12细胞稳转细胞系,检测SLC6A4基因沉默对缺氧诱导的细胞凋亡的影响。方法 设计合成3条针对SLC6A4基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,在293T细胞中共转染进行慢病毒包装。转染大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞,荧光显微镜观察GFP荧光,筛选最佳shRNA干扰序列,应用嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。应用RT-PCR方法检测SLC6A4基因的表达,Western blot方法检测蛋白5-HTT的表达变化,流式细胞术检测沉默SLC6A4基因对缺氧诱导的PC12细胞凋亡的影响。结果 成功构建SLC6A4-shRNA慢病毒载体并转染PC12细胞,与正常对照组及干扰对照组比较,干扰组细胞内SLC6A4基因和蛋白表达明显降低（P<0.01）,证实慢病毒载体能够有效沉默SLC6A4基因,沉默SLC6A4基因可以逆转缺氧诱导的细胞凋亡。结论 通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默PC12细胞SLC6A4基因,沉默SLC6A4基因可以逆转缺氧诱导的细胞凋亡。     

RNA干扰ezrin基因真核生物表达载体的构建及鉴定

目的 构建用于RNA干扰(RNAi)的小发夹RNAshRNA表达载体并检测其对ezrin基因的沉默效果.方法 以ezrin为靶基因,以pGenesil-1质粒为载体,设计和构建重组体,根据GeneBank数据库提供的ezrin核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,设计2条小发夹结构的DNA序列,经退火形成互补双链,克隆到空载体pGenesil-1中,转化DH5a菌株,提取质粒,予以酶切和测序鉴定;重组质粒转染786-0肾癌细胞株,运用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法进行筛选鉴定.结果 酶切及测序鉴定表明成功地构建重组质粒shRNA-ezrinl、shRNA-ezrin2;荧光实时定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示,肾癌细胞中shRNA-ezrinl、shRNA-ezrin2 mRNA相对表达量分别为(0.3376±0.0166)及(0.4661±0.0266),shRNA-ezrinl与shRNA-ezrin2相对表达量差异有统计学意义(P＜0.01),根据基相对表达量算出shRNA-ezrinl,shRNA-ezrin2 ezrin-mRNA的表达量抑制率分别为66.33％及53.29％.转染重组质粒后显著抑制786-0细胞中ezrin mRNA和蛋白表达,其中shRNA-ezrinl的抑制效率最高.结论 成功构建ezrin基因的shRNA表达载体,并筛选出抑制率较高的重组质粒载体shRNA-ezrinl,为进一步研究ezrin基因沉默对肾癌786-0细胞株生物学行为的影响奠定基础.     

bcr／abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建ber/abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr/abl mRNA和P210蛋白的影响.方法:根据GenBank数据库提供的bcr/abl基因核苷酸序列,按照Tusch Ⅰ设计原则,选择设计双链小干扰RNA(siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的真核表达载体pTER117,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT-PCR分析bcr/abl mRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达.结果:构建bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24 h后,pTER117使bcr/abl mRNA的相对水平下降50%,使P210蛋白下降47%.结论:bcr/abl融合基因siR-NA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr/abl的表达.     

脂质体介导的小发夹干扰RNA对卵巢癌顺铂耐药细胞中切除修复交叉互补基因1表达的影响

目的:探讨脂质体介导的小发夹干扰RNA(shRNA)对卵巢癌顺铂耐药细胞中切除修复交叉互补基因1(ERCC1)表达的影响。方法:设计合成针对ERCC1基因的小发夹干扰RNA(ERCC1-shRNA),构建携带ERCC1-shRNA的重组质粒表达载体,采用脂质体Lipofectamine 2000转染COC1/DDP细胞。分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(Western blot)检测转染后细胞中ERCC1 mRNA及蛋白的表达,流式细胞计数检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果:转染后COC1/DDP细胞中ERCC1mRNA表达较转染前明显降低(F=203.73,P<0.01),ERCC1蛋白表达亦显著下降。RNA干扰ERCC1基因后48h,COC1/DDP细胞的凋亡率较对照组有明显升高(t=20.65,P<0.01)。结论:构建的重组质粒表达载体转染COC1/DDP细胞可明显下调ERCC1 mRNA及蛋白的表达,诱导肿瘤细胞凋亡。     

大鼠雪旺细胞Neuritin基因shRNA表达载体构建及其体外抑制效应

目的构建针对大鼠neuritin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并研究该载体对neuritin基因表达的沉默效应及雪旺细胞生存的影响。方法设计并合成neuritin靶向siRNA序列,连接pGCSIL-GFP慢病毒表达载体后,将neuritin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染入293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞,分为空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)和干扰组(C组)。RT-qPCR、Western blot及Annexin V/PI方法分别检测细胞neuritinmRNA、蛋白表达及细胞凋亡情况。结果与A、B组相比,C组雪旺细胞neuritin mRNA和蛋白表达水平降低,而细胞凋亡明显增加(P<0.01或P<0.05)。结论成功构建neuritin基因shRNA慢病毒表达载体。其转染的雪旺细胞neuritin基因表达受抑制,并导致细胞凋亡增加。