应用荧光定量PCR检测阴道加特纳菌

目的:确定荧光定量PCR方法检测细菌性阴道病相关细菌阴道加特纳菌的可行性。方法:采用SYBR Green方法建立了阴道加特纳菌荧光定量PCR方法,评价荧光PCR方法的特异性、灵敏度、重复性;并对568例临床分泌物样本进行检测。结果:本实验所建立的荧光定量PCR方法可准确、特异的检测阴道加特纳菌;该方法的灵敏度可达到1拷贝/μl;194例细菌性阴道病患者分泌物标本中荧光定量PCR法检出116例(59.79%)阴道加特纳菌;而在374例非细菌性阴道病患者分泌物标本中荧光定量PCR法检出35例(9.36%)阴道加特纳菌;荧光定量PCR法检出率明显高于细菌培养方法,差异具有显著性,χ2=24.89,P<0.01。结论:荧光定量PCR方法能够应该用于临床分泌物标本中的阴道加特纳菌的检测。     

实时荧光定量PCR快速检测腺病毒方法的建立与评价

目的建立针对人腺病毒Hexon基因的实时荧光定量Taq Man PCR检测方法,用于腺病毒感染的早期诊断及病毒核酸定量分析。方法根据人腺病毒Hexon基因高度保守区设计引物和Taq Man探针,建立人腺病毒实时荧光定量Taq Man PCR快速检测方法。对方法的灵敏度及特异性进行评价;选取3个浓度的标准品,进行5次重复检测,对方法的重复性进行验证;用该方法对90份临床标本进行检测。结果建立的检测方法对人腺病毒的检测与其它呼吸道病原无交叉反应;检测灵敏度为10拷贝/μl;对103、104、105拷贝/μl 3个浓度标准品分别进行5次重复检测,其Ct值的变异系数均小于5%。对临床90份发热病例的咽拭子标本检测的腺病毒阳性率为90%,与普通PCR检测法的结果(90%)一致;检测准确率达100%。结论本研究建立的Taq Man荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度和重复性均好,适用于人腺病毒的日常监测和暴发疫情的应急诊断。     

实时荧光定量PCR技术在群体感染性腹泻病原体快速筛查中的应用

目的:建立快速筛查感染性腹泻标本的实时荧光定量PCR法,考察其在群体感染性腹泻病原体快速筛查中的应用.方法:采用国家标准的细菌培养法(或传统ELISA法)对2006年丽水地区发生的总计14起共487例群体感染性腹泻标本进行病原体筛查,同时采用实时荧光定量PCR方法对该487例标本进行检测,比较两者的实验结果,并考察实时荧光定量PCR方法的特异性和灵敏度.结果:实时荧光定量PCR检测结果与传统检测方法的符合率为97.54%,除完全符合的278例标本之外,另有7例采用传统方法检测为阴性的标本用实时荧光定量PCR检测显示为阳性.表明实时荧光定量PCR方法具有更高的灵敏度;特异性和灵敏度实验表明实时荧光定量PCR方法的特异性达100%,灵敏度为102拷贝/ml.结论:实时荧光定量PCR法具有准确性好、灵敏度高、检测快速等优点.是一种理想的群体感染性腹泻病原体快速筛查的方法.     

实时荧光聚合酶链反应检测副溶血弧菌致病基因

目的建立一种快速、准确、特异、定量检测副溶血弧菌及其致病因子的方法。方法选择副溶血弧菌TLH、TDH和TRH基因作为靶序列,设计并合成引物和探针;收集疑似食物中毒导致腹泻患者粪便标本487份,并对其进行检测分析。结果采用荧光聚合酶链反应检测TLH和TDH基因的灵敏度为1.0×102拷贝,而检测TRH的灵敏度为1.0×103拷贝;487份粪便标本中检出副溶血弧菌TLH基因112例(23.0%),检出携带TDH基因菌株101例(90.2%),未检出TRH基因。结论应用Taqman探针实时荧光PCR技术能够快速、准确检测副溶血弧菌及其致病基因,适合于大样本筛查;临床分离的副溶血弧菌以携带TDH基因为主。     

泰泽氏菌TaqManMGB探针荧光定量PCR方法的—立及应用

目的 建立泰泽氏菌的TaqMan小沟结合物(MGB)探针荧光定量PCR检测方法.方法 针对泰泽氏菌16S rRNA基因的保守区设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性和稳定性.对2008-2011年采集的1156份临床样本进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照.结果 泰泽氏菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肝螺杆菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、侵肺巴斯德氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌之间无交叉反应,检测灵敏度达2.2 copy/μl.标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.204,PCR效率为100％.对1156份临床样本进行检测,荧光定量PCR检出101份泰泽氏菌阳性样本,而普通PCR则仅检出44份.荧光定量PCR方法从临床样本中检出泰泽氏菌DNA仅需2h.结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有特异、灵敏和稳定性,适于泰泽氏菌的快速检测.     

基于TaqMan-MGB荧光定量PCR技术检测 HIV-1 DNA基因方法的建立

目的建立一种基于TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量PCR方法检测人类免疫缺陷病毒(human immanodeficiency virus,HIV-1)感染者外周血中HIV-1 DNA的含量。方法根据HIV-1病毒基因序列设计特异性引物和TaqMan-MGB荧光探针,建立TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法和定量标准曲线,优化反应方案,分析方法的灵敏度、准确性、重复性和精密度。采用该方法对20份HIV-1感染者和10份正常人的外周血进行HIV-1 DNA检测分析,并将结果与罗氏HIV DNA检测试剂盒作比较。结果成功建立了检测HIV-1 DNA TaqMan-MGB双标记探针实时荧光定量检测方法。灵敏度:该体系最低检出限可达10拷贝/ml,标准曲线方程为:Y=-3.339X+45.883,R~2=1。准确性:20份HIV-1阳性样本,HIV-1 DNA检出率100.00%,10例HIV-1阴性的健康对照,检测结果全部阴性;该检测结果与罗氏试剂盒检测结果完全一致。重复性和精密度:对高值(3×10~6拷贝/ml),低值(3×10~2拷贝/ml)2个浓度进行批内批间验证,批内CV分别为2.53%、3.02%;批间CV分别为2.87%,4.52%,均10%。结论成功建立了HIV1-DNA的TaqMan-MGB荧光探针实时定量PCR方法;该方法具有较高的准确性、灵敏度以及精密度和重复性,能够为临床HIV1感染者提供早期诊断和治疗效果监测。     

实时荧光聚合酶链反应检测粪便标本中的金黄色葡萄球菌肠毒素A、D

目的:建立一种快速、准确、特异、定量检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素A、D的方法并探讨肠毒素在食物中毒引起腹泻中的意义。方法:选择femB、SEA和SED基因分别作为金黄色葡萄球菌菌株、肠毒素A、肠毒素D的靶序列,设计合成引物和探针;收集食物中毒导致腹泻患者粪便标本487份,并对其进行检测分析。结果:采用荧光聚合酶链反应检测金黄色葡萄球菌和肠毒素A的灵敏度为1.0×102拷贝,而检测肠毒素D的灵敏度为1.0×103拷贝;487份粪便标本中检出金黄色葡萄球菌femB基因72例(14.8%),检出产肠毒素A菌株为11例(15.3%,11/72),产肠毒素D菌株为9例(12.5%,9/72),同时产肠毒素A、D菌株1例(1.4%,1/72)。结论:应用Taqm an探针实时荧光PCR技术能够快速、准确检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素,适合于大样本筛查。     

TaqMan实时荧光定量PCR检测肠道细菌Akkermansia Muciniphila

目的 建立Akkermansia muciniphila(A.muciniphila)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,实现粪便中A.muciniphila的定量检测。方法 根据GenBank公布的A.muciniphila 16S rRNA基因高保守序列,设计合成特异引物和TaqMan探针,构建重组质粒作为标准品,通过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,同时将建立的方法用于10份成年人粪便标本的检测。结果 TaqMan实时荧光定量PCR检测A.muciniphila,仅需1.5h,该方法线性好,相关系数R²=0.9991,扩增效率E=94.7%;重复性好,组内和组间变异系数均小于3%;灵敏度可达到5×10³拷贝/μl;特异性良好。10份成年人粪便标本共检出9份为阳性,阳性粪便标本中A.muciniphila平均含量为2.70×108cells/g粪便。结论 本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR能够快速、灵敏、特异地定量检测粪便标本中A.muciniphila。     

实时荧光定量PCR检测汉赛巴通体

目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测汉赛巴通体的实时荧光定量PCR方法。方法根据汉赛巴通体特异的16S-23S rRNA间隔区序列设计引物和探针,以克隆的16S～23S rRNA间隔区基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI 7900HT)上建立实时荧光定量检测方法,对所建立的方法分别进行敏感性、特异性及重复性分析,并且对模拟标本进行检测。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(C_(?))与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.997);与普通PCR相比较,荧光定量PCR检测的灵敏度是其1000倍。用荧光定量PCR检测其他相关立克次体和细菌DNA样本,除军团菌检出微弱信号(2个拷贝)外,其余检出结果均为0;对重复性进行了评价,批内和批间的变异系数在0.2%～1.9%之间。用荧光定量PCR检测汉赛巴通体感染的小鼠血标本,在感染后第2天、第3天、第5天,检出少量的汉赛巴通体,在感染后的第1天和第2天从脾脏样本中检出大量的汉赛巴通体。结论检测汉赛巴通体实时荧光定量PCR方法具有高度特异性和高敏感性以及良好的重复性,可用于快速检测各种样本中的微量汉赛巴通体以及作为汉赛巴通体感染的实验室诊断。     

轮状病毒星状病毒和甲型肝炎病毒的单管多重荧光定量RT-PCR检测方法研究

目的建立能同时检测星状病毒、轮状病毒和甲型肝炎病毒的单管多重荧光定量RT-PCR方法。方法根据Gen Bank上下载的上述3种病毒基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析多重荧光RT-PCR的重复性、特异性和敏感性;以所建立方法对128例病毒性腹泻患者粪便标本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果所建立的多重荧光RT-PCR检测方法对轮状病毒、星状病毒和甲型肝炎病毒具有很好的特异性和重复性,轮状病毒灵敏度达到101拷贝,星状病毒和甲型肝炎病毒灵敏度达到102拷贝。128份粪便标本中,轮状病毒和星状病毒的检出率分别为17.97%和3.13%,甲型肝炎病毒未检出。与基因测序比对结果相符。结论用于轮状病毒、星状病毒和甲肝病毒的单管多重荧光定量RT-PCR方法快速、特异且灵敏,可用于临床病原诊断和流行病学调查。     

新型TaqMan-MGB探针法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的探讨新型MGB探针在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速检测中的临床应用价值。方法以TaqMan-MGB探针技术为基础,用已克隆的mecA基因作参比品,实时检测临床标本和阴性参考品。结果所建立方法的最低检测限度为1个基因拷贝/反应,在100~109范围内,CT值(C代表Cycle,T代表阈值)同DNA量的对数呈线性关系;用该方法检测20例MRSA培养阳性的临床标本,结果均为阳性;用该方法检测20个非MRSA细菌株,结果均为阴性。结论所建立的方法适用于临床MRSA快速诊断。     

TaqMan-MGB荧光定量逆转录聚合酶链反应快速检测甲型流感病毒

目的:建立一种特异、灵敏、快速检测甲型流感病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法。方法:根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物软件在甲型流感病毒膜蛋白(MP)基因的保守区设计与筛选引物和MGB探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性和敏感性。并通过对疑似流感临床样本的检测,以评价该方法的实际应用价值。结果:该方法对甲型流感病毒的检测有高度的特异性、通用性,对乙型流感、麻疹、风疹、腮腺炎、RSV和腺病毒等其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TC ID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需2.5 h左右,且操作简便,重复性好。结论:本研究建立的MGB荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于甲型流感疫情的应急快速检测。     

实时荧光定量PCR检测普氏立克次体

目的 采用新型TaqMan—MGB探针建立检测普氏立克次体的实时荧光定量PCR方法。方法 根据普氏立克次体外膜蛋白B的基因（ompB）序列设计引物和探针，以克隆的ompB基因片段作DNA模板，在荧光定量PCR检测仪（ABI7900型）上建立实时荧光定量检测方法。结果 建立的定量标准曲线的循环阈值（Q）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r=0．999）；与巢式PCR相比较，荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测莫氏立克次体及其他相关立克次体和细菌DNA，检出结果均为阴性。用荧光定量PCR检测普氏立克次体感染的豚鼠血标本，某些样本检测为阳性，而用巢式PCR检测的结果均为阴性。结论 研究中建立的检测普氏立克次体实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性，适合于快速检测样本中微量普氏立克次体DNA，可用作临床实验室快速确诊流行性斑疹伤寒。     

应用探针熔解分析法检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的 研究结核分枝杆菌利福平耐药突变实时PCR检测试剂盒(探针熔解分析)的临床应用价值.方法 用37株非结核分枝杆菌考察该方法的特异性,用菌株H37Rv考察其检测限,并检测962份结核分枝杆菌培养标本的rpoB基因利福平耐药决定区突变,检测结果经测序验证.结果 37株非结核分枝杆菌中仅有3株出现耐药突变峰,检测限考察结果表明该方法每反应可重复检出30个菌.用该试剂盒检测962份标本,检出突变株186份,野生株751份,扩增失败标本25份.选取2009年11月以后的标本中试剂盒检出为突变的标本112份,并数字表法随机选取200份试剂盒检出为阴性的标本,进行测序验证,除5份测序失败其余107份标本的DNA序列分析结果与试剂盒检测结果一致.结论 该试剂盒准确快速,方便易行,是检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的有力工具.

Abstract：

Objective To evaluate the clinical performance of a probe melting analysis ( PMA)-based real-time PCR detection kit in rapid detection of rifampin-resistant mutations in Mycobacterium tuberculosis (MTB). Methods The specificity of the assay was evaluated by detecting 37 non-tuberculous mycobacteria (NTM) ,and the detection limit of the method was evaluated by genomic DNA of a standard strain H37Rv. Finally, 962 clinical isolates were analyzed with the PMA assay by detecting mutations in rifampin resistance-determining region (RRDR) of rpoB gene, and results were verified with DNA sequencing. Results Among 37 NTM strains,three strains showed drug resistant mutation signals. The PMA method could detect down to 30 bacteria per reaction. Sample analysis showed that 186 of 962 isolates were mutants,751 isolates were wild type and 25 isolates failed to give amplification signals. Among the mutant samples detected, 112 samples from November 2009 to April 2010 were further analyzed by sequencing, as well as 200 wild-type samples. The results showed a complete agreement with the PMA assay except for 5 samples failed in sequence analysis. Conclusion The PMA assay is rapid, accurate and easy-to-use, and thus can be used for detection of rifampin-resistant in clinical isolate samples.     

How accurate is the culture of Helicobacter pylori in a clinical setting? An appraisal

AIM: The trend towards increasing prevalence of Helicobacter pylori (H. pylori) antibiotic resistance may jeopardize the efficacy of most regimens. Culture of the bacterium, the useful method able to address therapy, is influenced by various factors. Thus, validation of the procedure is fundamental. Most studies have been carried out in microbiological settings, while only few have been conducted in clinical frames. We evaluated the accuracy of culture for detection of H. pylori in a clinical dedicated laboratory. METHODS: Forty-six patients (28 females, 18 males, mean age 56+/-4.7 years) were included. Thirty experienced failure to H. pylori eradication after at least 3 courses of treatment. The control group included 16 subjects suffering from gastroesophageal reflux disease and negativity for H. pylori infection. Diagnostic strategy was based on histology, culture testing, serology and 13C-urea breath test. A patient was considered infected if 2 tests were positive. A commercial culture medium in microaerophilic atmosphere was utilized. RESULTS: Out of 30 positive specimens, culture correctly identified 29. In 1 case, no growth of micro-organisms occurred. In the control group, bacterial culture accurately identified all negative samples. One of them indicated growth but neither aspect nor confirmation tests identified H. pylori. Sensitivity was 96.7%, specificity 100%, and accuracy 97.8%. Positive and negative predictive values were 100% and 94.1%, respectively. CONCLUSIONS: Culture of H. pylori is a feasible method and provides a good level of diagnostic accuracy even in a clinical setting by following international guidelines combined with training of specialized personnel.     

Helicobacter pylori infection in children: prevalence, diagnosis and treatment outcome

The clinical significance of Helicobacter pylori infection in children remains largely unknown. The rate of acquisition at different ages has not been ascertained using reliable tests on gastric biopsies. We determined prospectively the prevalence of H. pylori infection in children and its association with gastroduodenal disease. We evaluated 240 children undergoing upper gastrointestinal endoscopy for H. pylori infection by rapid urease test, culture, ureA PCR and histopathology. Group I constituted 58 children with upper abdominal pain (UAP) and group II (controls) of 182 children without UAP who underwent diagnostic or therapeutic endoscopy for other reasons. Helicobacter pylori-positive children with UAP received anti-H. pylori therapy. Helicobacter pylori infection was significantly higher in children with UAP than controls (53.4% vs. 28%; P<0.001) and overall prevalence increased with age. On follow-up endoscopy, H. pylori had been eradicated from 82% of children with UAP; it was eradicated from the remaining 18% after a second regimen. Treated H. pylori-positive children with UAP remained symptom-free for a median of 25 months. Control children remained chronically H. pylori infected. Chronic inflammation was present in all infected children, and active inflammation in 48.8%. The study shows H. pylori infection increases with age and is strongly linked to UAP in children.     

立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

目的采用TaqMan-MGB探针建立立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测方法.方法依据立氏立克次体外膜蛋白B基因序列设计引物和探针,以克隆的ompB基因片段为DNA模板,在ABI 7900型荧光定量PCR检测仪上建立实时荧光定量PCR检测方法.结果建立的定量标准曲线Ct值与模板拷贝数呈线性关系（R2=0.996）,最低检测浓度为5拷贝/μl;用荧光定量PCR方法检测其他相关立克次体和常见非立克次体病原菌,检出结果均为阴性.用该方法检测立氏立克次体感染的豚鼠血液标本、小鼠脾脏标本及细胞培养标本,检测的结果与立氏立克次体感染相关.结论研究建立的检测立氏立克次体实时荧光定量PCR方法具有高特异性和高敏感性,适用于快速检测各种样本中的立氏立克次体和立氏立克次体感染早期的实验室诊断.     

ABI7900实时荧光PCR系统检测腺病毒DNA性能验证

目的:评估实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测腺病毒(ADV)DNA的性能。方法:采集16名健康者咽拭子标本(16例),选取其中10例阴性标本。阳性标本取自1例ADV4型培养液。采用RT-PCR法检测ADV DNA,并依次对检测试剂的准确性、重复性、检测下限、抗干扰能力和特异性等性能参数进行验证及评价。结果:RT-PCR试剂检测ADV DNA的准确性和重复性均为100%,检测下限为5×10^2 copies/ml。加入100 g/L血红蛋白,药物阿莫西林(5μg/ml)、对乙酰氨基酚(0.15μg/ml)和布地奈德混悬液(0.5 mg/ml)干扰物质后,ADV DNA的Ct均值小于未加入干扰物质的ADV DNA Ct均值的95%的置信区间(95%CI)上限25.51,加入干扰物质未对ADV DNA检测结果造成显著影响。该试剂检测甲型H1N1流感病毒、巨细胞病毒、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、流感嗜血杆菌和鼻病毒等常见的呼吸道病毒和细菌无交叉反应,具有较好的特异性。结论:RT-PCR法检测ADV DNA的准确性高、重复性好且灵敏度高,抗干扰能力和特异性均符合相关标准的要求,是临床检测ADV的首选方法。     

大肠杆菌O157∶H7双重荧光PCR方法的建立与应用

摘要:目的　建立快速检测食品中大肠杆菌O157︰H7的双重荧光PCR 方法。方法　针对大肠杆菌O157︰H7菌体抗原O和鞭毛抗原H的特异性基因rfbE（O157）和fliC（H7）筛选设计引物和探针,优化反应条件,建立可特异性检测大肠杆菌O157︰H7的双重荧光PCR方法,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行评价,对模拟样品和实际样品进行初步验证。结果　利用建立的方法对2株大肠杆菌O157︰H7及12株非大肠杆菌O157︰H7进行检测,O157︰H7菌株检测结果均为rfbE和fliC阳性,非O157︰H7菌株检测结果均为阴性,rfbE和fliC基因的特异性均为100%;2基因的检测灵敏度可达1.16×102 CFU/ml;批内、批间变异系数均小于3.5％;模拟样品立即检测,2个基因的最低检出限（2.7×102 CFU/ml）和细菌纯培养时接近;实际样品检测结果与我国检验检疫行业标准（SN/T 0973-2010）的检测结果一致。结论　建立的荧光定量PCR 方法特异性及重复性好,灵敏度高,可快速准确鉴定大肠杆菌O157︰H7菌株。