人睾丸基因TDRG1重组真核载体的构建及其表达

目的 构建人睾丸基因TDRGl的真核表达质粒,并研究其表达.方法 取人新鲜正常睾丸组织,提取总RNA,采用逆转录.聚合酶联链反应(RT-PCR)扩增TDRG1基因编码序列;将该基因克隆到真核表达载体pYD5中,构建真核细胞表达载体pYD5-TDRG1,用限制性内切酶酶切分析,DNA序列分析鉴定重组质粒;将测序正确的重组质粒pYD5-TDRG1在脂质体介导下转染293细胞,间接免疫荧光法和Western Blot法鉴定目的 蛋白质的表达.结果 RT-PCR扩增出TDRGl基因编码序列,目的 插入片段长约303bp:产物行限制性内切酶酶切后连接到真核表达载体pYD5,重组质粒pYD5-TDRG1经酶切及DNA测序鉴定构建成功:该质粒转染293细胞48h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,阳性细胞率96.42%;行Western blot分析检测到约39-8kD的目的 蛋白表达.结论 成功构建了人类睾丸基因TDRG1的真核表达载体pYD5-TDRG1,TDRG1基因在293细胞内成功表达.     

pCGN-HAM-N1-wcAPC质粒的构建及其功能

目的 构建带有HAM标签的真核表达重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC及探讨其功能.方法 制备高效率感受态;用聚合酶链反应(PCR)扩增,将腺瘤息肉病(APC)基因截短的片段APC1克隆于T载体;同时将pCMV-neo-bam-APC酶切,得到APC基因的另一个8300 bp截短片段kAPC亚克隆于pCGN-HAM-N1真核表达载体,得重组质粒pCGN-HAM-N1-kAPC;再运用双酶Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ同时酶切TA克隆、pCGN-HAM-N1-kAPC,将APC1片段插入载体pCGN-HAM-N1-kAPC,获含野生型全长APC基因重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC.用酶切,测序鉴定.脂质体法分别将含全长,截短的重组质粒,空载体与WNT信号系统的β-连环蛋白(β-catenin)、topflash和荧光素酶共同转染293T细胞,利用双荧光报告测试系统,检测转染后荧光素酶活性.结果 重组质粒经酶切其大小与预期一致,经测序比对证实与GeneBank中给出的序列一致.转染pCGN-HAM-N1-wcAPC组的荧光素酶活性明显低于转染空载体组pCGN-HAM-N1(P＜0.05).结论 含野生型全长9000 bp大片段APC基因分段成功插入pCGN-HAM-N1载体,带有HAM标签的真核表达重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC构建成功,pCGN-HAM-N1-wcAPC抑制T细胞因子/淋巴增强因子(Tcf/Lef)启动子的活性.     

抗肝癌单链免疫毒素在肝癌细胞系SMMC-7721中的表达

目的 构建分泌型抗肝癌单链免疫毒素真核表达载体并在人肝癌细胞系SMMC-7721中表达。方法 采用PCR方法在抗肝癌sFv的5′端引入引导序列使其能够在真核细胞中表达并分泌，在其下游连接人TNF-α基因，构建分泌型抗肝癌单链免疫毒素基因，并将该基因克隆人带有GFP报告基因的真核表达载体，用磷酸钙共沉淀法转染人肝癌细胞系SMMC-7721进行瞬时表达。结果 DNA序列分析证实在sFv的5′端引入正确的60bp引导肽序列，酶切鉴定证明成功构建了分泌型抗肝癌单链免疫毒素融合GFP真核表达载体，并在SMMC-7721细胞中成功地表达了融合荧光蛋白。结论 成功构建并表达了分泌型抗肝癌单链免疫毒素融合GFP基因，为肝癌免疫基因治疗的进一步研究奠定了基础。     

重组端粒酶pEGFP-hTRT质粒的构建

目的 构建具有绿色荧光蛋白报道(GFP)基因的端粒酶真核质粒载体，为转染细胞、延长细胞寿命提供基础。方法 酶切含人端粒酶逆转录酶(hTRT)基因的pGRNl45质粒获取hTRT片段，插入经酶切及磷酸化处理的GFP载体pEGFP—C1，形成8．1kb质粒，经HindⅢ、NotI酶切电泳筛选、鉴定并测序。结果 经酶切电泳分析得到3．4kb及4．7kb大小的两片段；测序结果显示接头两端序列正确。结论 重组竭粒酶pEGFP—hTRT质粒的成功构建，可用于细胞转染，对进一步研究组织工程种子细胞的衰老问题具有重要意义。     

Fibulin-5真核表达载体的构建及稳定转染人膀胱癌细胞的研究

目的 构建Fibulin-5真核表达载体并转染人膀胱癌5637细胞.方法 经聚合酶链反应(PCR)扩增Fibulin-5 cDNA,然后将其与pMD-19T载体连接.pMD-19T-Fibulin-5重组体经过限制性内切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ的消化后产生Xho Ⅰ-Fibulin5-EcoR Ⅰ片段.将该片段插入增强型绿色荧光蛋白载体(p-EGFP N1)质粒的相似位点并最终合成p-EGFP-F5质粒重组体,并通过BgⅢ单酶切鉴定.通过脂质体介导法将p-EGFP-F5质粒转染至人膀胱癌5637细胞株内.结果 PCR扩增片段长度为1429 bp.Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切的片段经DNA测序显示Fibulin-5 cDNA插入正确.p-EG-FP-F5质粒重组体经BgⅢ单酶切出一约450 bp的条带.转染48 h后,pEGFP-Fibulin-5和pEGFP-N1转染成功的细胞均有不同程度的绿色荧光表达.结论 成功构建Fibulin-5绿色荧光蛋白真核表达载体并转染至人膀胱癌细胞内.     

人 Orail基因真核表达载体的构建及在足细胞中的表达

目的构建重组人 Orail基因真核表达载体,观察其在小鼠肾小球足细胞株（MPC5）中的表达。方法根据GenBank数据库检索到的人 Orail基因序列,人工合成法合成Orail基因编码区（coding sequence,CDS）全长序列,克隆至质粒表达载体PG-CMV-IRES-EGFP,构建重组质粒载体PC-CMV-Orail,通过PCR、双酶切及基因测序等方法进行鉴定;以脂质体转染法将重组质粒转染至MPC5细胞,应用荧光显微镜观察绿色荧光检测转染效率,RT-PCR、Western blot法分别检测Orail基因的转录与翻译。结果PCR扩增的片段长度为906bp,双酶切出现两条带,其中约906bp处可见目的条带。核酸测序结果与GenBank中所报道的人 Orail基因的CDS序列完全一致。转染后48h置荧光显微镜下观察,85％以上的足细胞中可见绿色荧光。RT-PCR及Western blot实验结果分别显示转染后的MPC5细胞在mRNA与蛋白水平表达Orail均有所增强。结论成功构建了重组人 Orail基因真核表达载体PG-CMV-Orail,并建立了过表达Orail基因的肾小球足细胞模型,为深入研究钙库操纵的Ca2’通道与足细胞病之间的关系奠定了良好的实验基础。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2基因重组腺病毒

目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2(BMP2)基因重组腺病毒并在293E细胞中扩增制备重组病毒。方法自人骨形成蛋白2真核表达载体pcDNA3-hBMP2中酶切出hBMP2基因，插入pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrackCMV—hBMP2，经酶切线性化后，采用电穿孔转化到事先电转化腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中，挑选同源重组质粒，酶切线性化重组质粒并转染293E细胞包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清感染293细胞，荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体，为进一步研究rBMP2基因治疗奠定了基础。     

CD147-shRNA对肝癌细胞CD147表达的抑制作用

目的构建CD147-shRNA重组质粒并检测其对肝癌细胞SMMC-7721和HepG2内源性CD147表达的抑制作用。方法根据Genebank中CD147序列设计3条特征性靶序列,合成的核苷酸序列连接到线性化pBS/U6载体,采用酶切法及测序鉴定重组质粒的正确性;将重组质粒转染至人肝癌细胞SMMC-7721和HepG2中,采用Western blot法和免疫荧光法观察该重组质粒对CD147内源性表达的抑制作用。结果酶切鉴定和测序证实成功构建pBS/U6/CD147-shRNA,且对人肝癌细胞SMMC-7721和HepG2 CD147表达有抑制作用,而以pBS/U6/CD147-shRNA3抑制作用最为显著。结论构建pBS/U6/CD147-shRNA成功,并筛选出基因抑制效果最佳的pBS/U6/CD147-shRNA3,为进一步实验打下了基础。     

SD大鼠MSX-2基因真核表达载体的构建与功能鉴定

目的 构建SD大鼠颅颌面发育相关基因MSX-2与PcDNA 3.1融合的高效真核表达载体,为研究MSX-2基因的功能奠定基础.方法 根据SD大鼠MSX-2基因的核苷酸序列,设计并合成引物,采用PCR技术,扩增编码MSX-2基因,TA克隆到PMD18-T载体上,再亚克隆到真核表达载体PcDNA 3.1的BamHI和Xhol位点.对该重组体进行酶切鉴定,以及测序验证.重组体转染HEK293细胞,RT-PCR和Western blot检测重组MSX-2基因的RNA和蛋白表达情况.结果 重组真核表达载体PcDNA3.1-MSX-2经PCR扩增、酶切鉴定均显示有476bp左右的特异性基因片断,证明MSX-2基因正向插入真核表达载体中;碱基序列的测定证明重组质粒中含有SD大鼠的MSX-2基因序列.重组体转染HEK293细胞,RT-PCR和Western blot可检测到重组MSX-2基因的mRNA和蛋白的特异表达.结论 成功构建SD大鼠MSX-2基因的高效真核表达载体,为进一步研究MSX-2基因的功能及基因治疗奠定了基础.     

酸性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体的构建及转染肌卫星细胞

目的 探讨通过构建酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)基因真核表达载体转染大鼠肌卫星细胞(MSCs)建立细胞工程种子细胞可行性.方法 首先提取人类肌肉组织总RNA,RT-PCR法调取aFGF基因,然后用直接化学合成法合成人类白细胞介素2信号肽序列(SPS),通过基因融合得到SPS-aFGF,再通过定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1,最终得到重组质粒PEGFP-N1-SPS-aFGF,对重组质粒做测序和酶切鉴定;差速贴壁法获取大鼠MSCs,观察细胞形态,做免疫荧光鉴定;经鉴定正确的细胞随机分为3组:目的基因组(aFGF加N1)、空载质粒组(N1)、空白对照组(blank),前两组分别加入质粒PEGFP-N 1-SPS-aFGF与pEGFP-N1质粒,空白对照不加入任何质粒,均在脂质体Lipofectamine 2000TMReagent介导下转染,转染后荧光显微镜统计发绿色荧光的细胞占各组细胞比例,计算转染效率;转染72h后利用实时荧光定量PCR与Western blot检测aFGF基因在MSCs中表达情况.结果 ①重组质粒测序结果与GenBank公布的序列一致,酶切鉴定条带与实际大小相符.②荧光显微镜下观察到转染细胞有荧光表达,并在转染72 h达到最高峰.③转染后72 h,实时荧光定量PCR结果显示目的基因组表达量平均相对比值(aFGF加N1)组(1464.96)显著高于N1组(1.016)、Blank组(1.000),差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测显示aFGF表达呈极强阳性,而N1组及Blank组aFGF表达极弱.结论 成功构建aFGF基因真核表达载体并转染MSCs,aFGF在MSCs内高表达,此种方法有希望获取具备特殊生物学功能细胞.     

稳定表达Angiopoietin-1基因肝癌细胞株的建立及其意义

目的 通过将Angipoietin-1基因转染培养人肝癌细胞SMMC－7721,建立长期表达Angipoietin-1基因的肝癌细胞模型。方法 基因重组构建Angipoietin-1真核表达质粒pcDNA3/Angipoietin-1,经脂质体将pcDNA3/Angipoietin-1质粒转染培养人肝癌细胞株SMMC－7721,G418筛选阳性细胞克隆,逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测转染后25-30d细胞Angipoietin-1基因mRNA表达水平。结果 （1）限制酶切和凝胶电泳证明成功构建表达质粒pcDNA3／Angipoietin-1;（2）通过脂质体Dosper将质粒pcDNA3／Angipoietin-1转染SMMC－7721,经G418筛选后获得阳性细胞克隆;（3）RT－PCR证明经脂质体转染的人肝 癌细胞株SMMC－7721可较稳定表达Angipoietin-1基因。结论 成功建立稳定表达Angipoietin-1基因的肝癌细胞株SMMC－7721／Angipoietin-1,为通过在体途径探讨Angipoietin-1对肿瘤血管生成的调节作用奠定了基础。     

pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体的构建和鉴定

目的构建pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为研究TFPI-2基因的功能做准备。方法从胎盘组织中提取总RNA,逆转录合成cDNA,再以PCR法进行扩增。将扩增的TFPI-2基因片段克隆到pEGFP-N3真核表达载体上,经XhoI和KpnI双酶切后,行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定,同时测定其DNA序列。将pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体以脂质体LipofectamineTM2000介导的方法转染Top10感受态细胞（转染组）,同时设空白对照组（仅转染pEGFP-N3质粒）和未转染组（不予转染）。采用Westernblot法检测3组细胞中TFPI-2蛋白的表达情况。结果总RNA经分光光度法验证,其纯度符合PCR法扩增的要求。构建的pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体经XhoI和KpnI双酶切后,行1％琼脂糖凝胶电泳,结果显示,分别在708bp处和4700bp处有特异扩增条带,大小与理论值一致。DNA序列测定结果证实,pEFFP-N3-TFPI-2真核表达载体的序列完全正确。Westernblot法结果显示,TFPI-2蛋白的表达量转染组为0．6573±0．0325,空白对照组为0．3017±0．0287,未转染组为0．3143±0．0266,转染组TFPI-2蛋白的表达量高于空白对照组和未转染组,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论本实验成功构建了pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为TFPI-2基因功能的研究奠定了基础。     

鼠源性血管抑素对裸鼠种植性肿瘤的抑制作用

目的　探讨鼠源性血管抑素转染入人肝癌细胞SMMC 772 1后对裸鼠种植性肿瘤的影响。　方法　建立鼠源性血管抑素基因的人肝癌SMMC 772 1细胞株 ,实验动物分 3组 :空白对照组种植SMMC 772 1细胞 ,空载体组种植SMMC 772 1/pcDNA3 1(+)细胞 ,血管抑素组种植SMMC 772 1/pcDNA3 1 mAST细胞。比较各组裸鼠肿瘤体积、重量和肿瘤微血管密度 (MVD)。　结果　在肿瘤细胞种植 35d时裸鼠肿瘤体积 :空白对照组 (35 38 1± 6 43 3)mm3 ,空载体组 (312 8 5± 5 46 6 )mm3 ,血管抑素组 (75 5 8± 198 2 )mm3 ;肿瘤重量 :空白对照组 (6 0± 0 7)g,空载体组 (5 9± 0 5 )g ,血管抑素组(2 1± 0 5 )g;肿瘤MVD :空白对照组 5 2 2± 6 6 ,空载体组 49 4± 7 0 ,血管抑素组 2 5 5± 4 1。血管抑素组裸鼠肿瘤体积、重量和MVD显著小于空白对照组和空载体组 (P均 <0 0 1) ,肿瘤的抑制率达78 6 %。　结论　转染血管抑素基因的人肝癌细胞SMMC 772 1在裸鼠体内的致瘤力明显降低 ,肿瘤的体积、重量和微血管密度显著低于对照组 ,表明血管抑素可通过抑制肿瘤血管生成而显著抑制肿瘤生长     

RMP基因对肝癌细胞稳定性及迁移能力的影响

目的 研究RMP基因对肝癌细胞稳定性及迁移能力的影响.方法 将SMMC-7721细胞等量分为对照组和实验组.合成RMP基因的小干扰RNA真核表达载体,转染到实验组肝癌SMMC-7721细胞内,用G418筛选出实验组干扰RMP基因的细胞株,RT-PCR检测两组细胞内RMP基因的表达,划痕实验法检测两组细胞的迁移能力.结果 成功构建稳定的RMP基因干扰细胞株,与未干扰细胞对照组比较,实验组细胞p21基因表达减弱,细胞迁移能力降低.结论 RMP基因有维持肝癌细胞基因组稳定的重要作用,对保持细胞的迁移能力也有作用.     

Nodal靶向RNA干扰对人肝癌细胞的影响

目的：观察RNA干扰技术对人肝癌细胞Nodal基因表达的干扰效应,探讨靶向Nodal基因在肝癌基因治疗中的可行性。方法：采用一段含针对Nodal特异shRNA序列的质粒载体,转染人肝癌细胞株SMMC-7721,观察其转染效率后,分别以实时荧光定量PCR和Western blot检测Nodal基因和蛋白的表达水平,并观察Nodal基因干扰对SMMC-7721细胞体外增殖的影响。结果：表达shRNA的质粒载体对SMMC-7721细胞有较高的转染效率,转染后可明显抑制SMMC-7721细胞Nodal基因和蛋白的表达,且对其体外增殖有明显抑制作用。结论：运用RNA干扰技术,可以有效地抑制肝癌细胞Nodal基因和蛋白的表达,并抑制细胞增殖,Nodal基因可望成为肝癌治疗的新靶点。     

pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因靶向性治疗人原发性肝癌的实验研究

目的研究pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因对人肝癌细胞系SMMC-7721裸鼠移植瘤模型的靶向性治疗作用。方法建立人原发性肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分成肿瘤对照组、空质粒组、丙氧鸟苷（GCV）组、pcDNA3/TK/Angio组及pcDNA3/AFP/TK/Angio组5组。于瘤体内分别直接注射不同的质粒,同时于裸鼠腹腔内注射GCV,观察不同时段皮下肿瘤的生长情况并做病理学检查,免疫组化法检测肿瘤微血管密度（MVD）以及血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达量,原位末端标记（TUNEL）法检测细胞原位凋亡。放免法检测裸鼠血清甲胎蛋白（AFP）的变化,透射电镜观察肿瘤细胞超微结构的变化。结果裸鼠皮下成瘤率100%;pcDNA3/TK/Angio组及pcDNA3/AFP/TK/Angio组的肿瘤体积、血清AFP含量、肿瘤MVD和VEGF表达强度均明显低于对照组、空质粒组和GCV组（P〈0.05）,细胞凋亡指数都明显高于后3组（P〈0.05）,可见较多的凋亡细胞。而pcDNA3/AFP/TK/Angio组的肿瘤体积、AFP、MVD及VEGF表达强度又明显低于pcDNA3/TK/An-gio组（P〈0.05）,凋亡指数高于后者（P〈0.05）。结论pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因系统可显著抑制肿瘤的生长,有望成为治疗原发性肝癌的新型生物制剂之一。     

全反式维甲酸对肝癌细胞株细胞连接蛋白基因表达的影响

目的观察全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）对肝癌细胞株CX26、CX32和CX43基因表达的影响.方法体外培养肝癌细胞株SMMC-7721和BEL-7404.分别用常规培养基和含ATRA（10-5 mol/L）的培养基培养两种细胞,在ATRA处理后的24、48、72 h提取细胞总mRNA.采用RT-PCR方法检测CX26、CX32、CX43基因的表达.结果用常规培养基培养的SMMC-7721细胞不表达CX26 mRNA和CX32 mRNA,但是经ATRA培养48 h开始出现CX26 mRNA的表达,经ATRA培养72 h后出现CX32 mRNA的表达.常规培养的BEL-7404细胞没有CX26 mRNA和CX32mRNA的表达,但是经ATRA培养48 h开始出现CX26 mRNA和CX32 mRNA的表达.两种肝癌细胞株在经ATRA处理前后均有CX43 mRNA的表达.结论全反式维甲酸能够在转录水平上调CX26、CX32基因在肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7404中的表达.     

人胃动素受体基因表达载体的构建

目的 构建人胃动素受体基因的原核表达载体。方法 通过巢式PCR扩增人基因组DNA，获得人胃动素受体基因的658bp的靶片段，将其粘端克隆，然后应用限制性酶切、半巢式PCR扩增及测序鉴定。结果 成功克隆了人胃动素受体基因表达片段，测序证实读框正确。结论 人胃动素受体表达片段获得成功克隆。