沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究Ct致病机制及DNA疫苗的研究提供理论依据.     

沙眼衣原体pORF5蛋白真核表达系统的构建与鉴定

目的构建沙眼衣原体(Ct)pORF5基因重组质粒pDSRed-C1/pORF5,建立pORF5稳定转染的表达系统并对其进行鉴定。方法PCR法扩增pORF5基因,定向插入pDSRed-C1真核表达载体构建pDSRed-C1/pORF5重组体,重组体经酶切、PCR及测序鉴定后,用脂质体介导的基因转染法,分别将pDSRed-C1/pORF5和pDSRed-C1导入HeLa-229细胞,通过G418筛选获得转入目的基因的阳性细胞克隆;荧光显微镜和Western blot检测pORF5蛋白在细胞中的表达。结果所克隆的pORF5基因片段经测序完全正确;转染pDSRed-C1/pORF5的HeLa-229细胞大部分有pORF5蛋白的表达,而转染空载体pDSRed-C1或未转染的HeLa-229细胞,均未见pORF5蛋白表达。结论成功构建了稳定表达外源新基因pORF5的细胞系,为进一步研究该蛋白的结构功能、阐明Ct的致病机制、研制基因工程疫苗提供了有利的条件。     

沙眼衣原体蛋白激酶CT145的克隆及表达

目的 构建含沙眼衣原体(chlamydia trachomatis,Ct)基因CT145的真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,并检测其在HeLa细胞中的表达.方法 利用PCR技术扩增全长CT145基因,并将其亚克隆到真核表达载体pcDNA4,双酶切和测序检测重组质粒正确性.将正确的重组质粒转染HeLa细胞,并用免...     

E型沙眼衣原体MOMP基因重组质粒的构建与表达

目的：构建E型沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）基因重组真核表达质粒pVAX1-MOMP,为探索安全的E型CtDNA疫苗奠定基础。方法：根据Genebank中E型Ct MOMP基因序列设计引物,用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到约1.1kb的MOMP片段,克隆至pcDNAⅡ载体,测序后亚克隆至表达载体pVAX1,构建卡那霉素抗性真核重组表达质粒pVAX1-MOMP,并以重组质粒转染COS-1细胞进行表达,用Western blotting方法鉴定表达产物。结果：从E型Ct基因组DNA中扩增出特异的MOMP基因片段,酶切鉴定及DNA序列测定证实pVAX1-MOMP重组质粒构建正确,能在COS-1细胞内表达,表达产物能与抗MOMP单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建E型沙眼衣原体MOMP真核表达质粒pVAX1-MOMP,并在真核细胞内获得表达。     

沙眼衣原体质粒蛋白pORF5原核表达及免疫原性鉴定

目的 构建沙眼衣原体(CT)pORF5蛋白基因重组质粒pGEX-6p/pORF5,表达并纯化质粒蛋白pORF5,并鉴定其免疫原性.方法 用PCR法扩增pORF5基因,定向插入pGEX-6p原核表达载体构建原核表达重组体pGEX-6p/pORF5,重组体经酶切、PCR及测序鉴定后,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达pORF5融合蛋白.融合蛋白纯化后免疫BALB/c鼠,ELISA及Western-blot分析pORF5质粒蛋白免疫原性及免疫反应性.结果 PCR扩增出795 bp基因片段,序列测定证实重组质粒插入片段与GenBank登陆的D型Ct一致;pORF5融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达;ELISA检测免疫小鼠的血清效价为1:25 600.结论 pORF5蛋白在原核细胞中可有效表达并具有较好的免疫原性,为进一步研究该蛋白的结构功能、阐明Ct的致病机制、研制基因工程疫苗提供了有利的条件.     

沙眼衣原体热休克蛋白10基因真核表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

目的从临床标本中获得沙眼衣原体（Ct）热休克蛋白（cHSP）10基因，构建真核表达重组质粒。利用脂质体体外转染Hela细胞，为研究cHSPl0生物学功能和Ct核酸疫苗的研制做准备。方法用PCR技术从40例金标法阳性的临床标本中扩增cHSP10基因片断，重组入pMD18-T克隆载体。将pMD18-T／cHSP10外源基因片断经酶切鉴定后。克隆入pcDNA3．1（＋）中，经过序列分析和酶切鉴定后，运用脂质体将该重组体转染Hela细胞。ELISA方法观察目的基因的表达。结果PCR扩增得到cHSP基因全长。大小为306bp，序列测定与GmxBank（M58027）发布的序列一致；构建得到cHSP10基因真核表达载体；该真核表达载体在Hela细胞表达cHSP10。结论成功构建cHSP10基因真核表达载体，该重组质粒能在Hela细胞中表达cHSP10，为进一步研究cHSP10生物学功能和Ct核酸疫苗的研制提供了实验基础。     

沙眼衣原体的基因诊断技术进展

<正>沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis简称Ct)引起的泌尿生殖道感染,目前已成为常见的性传播疾病,并可导致输卵管炎、盆腔炎和不孕等严重的后果。尤其是无症状或症状轻微的感染者,由于未得到广泛的重视和彻底治疗,使得新的感染人群不断扩大。美国每年约有400万,全世界有超过5000万人的Ct新感染者。Ct感染还是导致流产、早产和宫颈癌的危险因素,并可使     

湘南地区泌尿生殖道感染沙眼衣原体的基因型分布

目的：了解湘南地区泌尿生殖道感染沙眼衣原体分离株的基因型（血清型）分布情况。方法：应用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性分析，对湘南部分地区泌尿生殖道感染沙眼衣原体病人的62份阳性标本进行了基因分型。结果：沙眼衣原体基因型中，E型25份，D型14份，F型9份，G型7份，J型4份；有3份不典型基因型，未进一步分型。结论：湘南地区泌尿生殖道沙眼衣原体感染的基因型别以E型为主，其次为D型、F型、G型、J型。     

沙眼衣原体的检测及临床意义

沙眼衣原体的检测及临床意义许福亮，纪恩美，李公宝，马传香（潍坊医学院附院中心实验室潍坊２６１０３１）沙眼衣原体（ＣＴ）与人类疾病关系较为密切。ＣＴ所致的泌尿生殖道感染已成为许多地区常见的性传播疾病。目前其检测方法有Ｇｉｅｍｓａ染色技术、直接荧光抗体测...     

沙眼衣原体pORF8质粒蛋白克隆表达与定位

目的克隆表达沙眼衣原体pORF8质粒蛋白,并在衣原体感染细胞中对其进行定位分析。方法 PCR法扩增pORF8基因,并将其定向插入pGEX-6p载体构建原核表达重组体pGEX-6p/pORF8,重组体转化E.coli XL1Blue后经IPTG诱导表达pORF8融合蛋白,融合蛋白经Glutathione Sepharose亲和层析纯化后免疫Balb/C鼠,制备pORF8多克隆抗体;应用免疫荧光试验对pORF8质粒蛋白进行定位。结果 pORF8基因全长为744 bp,编码247个氨基酸残基,pGEX-6p/pORF8在大肠杆菌中表达相对分子质量约为54 000的GST-pORF8融合蛋白,间接免疫荧光实验结果显示pORF8在感染细胞中的表达模式与主要外膜蛋白基本一致,而与衣原体蛋白酶样活性因子分布模式不同。结论 pORF8质粒蛋白定位于衣原体菌体上,为衣原体菌体蛋白。该研究为进一步研究该蛋白的结构功能、阐明Ct的致病机制奠定了基础。     

沙眼衣原体T细胞抗原CT143原核表达、纯化及免疫活性鉴定

目的克隆沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）T细胞抗原Ct143基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法采用PCR技术从ct基因组中扩增Ct143基因,并构建pGEX-6p—Ct143原核表达质粒,转化E．coli XL1-Blue．IPTG诱导重组GST-CT143融合蛋白表达,经酶切后得到无GST标签的纯蛋白免疫Balb／c鼠,ELISA及Western-blot分析CT143蛋白免疫原性及免疫反应性。结果成功构建了pGEX-6p—CT143原核表达质粒,序列测定证实重组质粒插入片段与GenBank登陆的CtD型一致,长度为843bp;GST—CT143融合蛋白在E．coli中获得稳定高效表达;纯蛋白与佐剂混匀后肌肉免疫小鼠,ELISA检测免疫小鼠的血清效价为1：12800,Westem blot结果表明该蛋白与Ct泌尿生殖道感染病人混合血清中IgG结合,具有免疫反应性。结论成功克隆表达了CtT细胞抗原CT143,该抗原经纯化后具有良好的免疫原性及免疫反应性。     

实时荧光定量PCR检测沙眼衣原体的研究

目的 采用TaqMan探针建立检测沙眼衣原体的实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法.方法 根据沙眼衣原体外膜蛋白A的基因(ompA)序列设计引物和探针,以克隆的ompA部分基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量检测方法.结果 建立的荧光定量PCR检测方法的最低检出限为5 copies/反应,检测线性范围100107线性关系良好(r2=0.997),比巢式PCR敏感100倍;且与鹦鹉热衣原体、淋球菌、解脲脲原体、大肠杆菌等病原菌DNA以及人基因组DNA均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性.以巢式PCR作参比,建立的荧光定量PCR法检测沙眼衣原体的阳性符合率为100.00％,阴性符合率为95.09％,总符合率为96.81％.结论 建立的检测沙眼衣原体实时荧光定量PCR具有特异性强和敏感性高的特点,可快速检测样本中微量沙眼衣原体DNA,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选.     

IgM Chlamydia Trachomatis Antibodies in Cases of Melasma

Background

Melasma is an acquired photosensitive hypermelanosis in sun-exposed areas, especially seen in females. The exact cause of this disorder is not known. Association of melasma with chronic pelvic inflammatory disease (PID) has been described earlier. Chlamydia trachomatis is an important etilogical agent in acute and chronic PID and photosensitivity has been described in almost 50% cases of chronic lymphogranuloma venereum caused by 1.1, 1.2 and 13 serovars of C. trachomatis.

Method

Blood of 38 cases of melasma in women and 31 healthy females was tested for the presence of C. trachomatis IgM antibodies by ELISA.

Results

The average age of the patients was 35.6(range 19-51) years and that of controls was 38(range 24-55). 7(18.42%) and 5 (13.16%) of the patients of melasma were positive and borderline positive for IgM antibodies respectively. None of the healthy controls were positive. The difference was statistically significant.

Conclusion

Melasma in women is most likely due to photosensitivity to C.trachomatis in cases of chronic pelvic inflammatory disease.Key Words: Melasma, Chlamydia trachomatis infection     

转录因子Kaiso真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定转录因子Kaiso的表达质粒pEGFP-Kaiso.方法 采用PCR的方法扩增pCS2-Kaiso中人Kaiso的全长序列,克隆至载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-Kaiso,以酶切及基因测序方法鉴定重组质粒的准确性.利用LipofectamineTM 2000将重组质粒转染至肺癌细胞系A549,24h后荧光显微镜观察绿色荧光信号,48 h后Western blot鉴定Kaiso蛋白表达变化.结果 限制性双酶切及DNA测序分析结果显示插入的DNA片段长度约为2 022 bp,与预期Kaiso基因片段大小相同.转染pEGFP-Kaiso重组质粒后,荧光显微镜观察到明确的绿色荧光蛋白(GFP)的绿色荧光信号,Western blot证实转染pEGFP-Kaiso质粒后的Kaiso蛋白表达量显著上调(P＜0.05).结论 成功构建了人Kaiso基因真核表达载体,为深入研究Kaiso的生物学功能提供了有力的实验工具.     

3月龄以下小婴儿沙眼衣原体肺炎64例临床分析

目的通过对3月龄以下小婴儿沙眼衣原体肺炎临床分析,提高对该病的认识,减少误治和过治。方法对2003年1月～2005年1月我科收治3月龄以下血清衣原体抗体IgM阳性肺炎患儿进行回顾性分析,探讨小婴儿衣原体肺炎的临床特点。结果该组患儿围生期衣原体感染史不明确;平均发病日龄在32.77±19.03天;以冬春季多发。临床以特征性咳嗽为主要表现,少数伴有发热、喘憋,肺部可有细湿啰音或无体征?喜⒑粑啦《靖腥静⒉谎映ぷ≡菏奔洹M庵苎紫赴咴颊?43.8%,中性粒升高不到20%,CRP少数升高,X线胸片以双肺受累为主。阿奇霉素在缓解咳嗽和减少肺部啰音方面优于头孢类抗生素,早期应用大环内酯类抗生素可明显缓解症状和体征并缩短住院时间。结论小婴儿单纯衣原体感染肺炎临床症状轻,一般不会造成脏器功能受损、衰竭甚至威胁生命。正确认识该病临床过程有助于对复杂临床情况进行准确的判断分析。     

解脲支原体沙眼衣原体与妊娠结局的关系

目的:探讨解脲支原体、沙眼衣原体感染与妊娠结局的关系.方法:采用聚合酶链反应(PCR)技术对200例孕妇的宫颈分泌物进行UU-DNA及CT-DNA检测.结果:200例孕妇中UU阳性率为32.5%,CT阳性率为25%,CT及UU双重感染率为10%.孕妇UU阳性和(或)CT阳性组与阴性组比较,其早产、胎膜早破、产褥病、低出生体重、新生儿肺炎的发病率高,差异有显著性.结论:解脲支原体、沙眼衣原体感染可引起不良的妊娠结局.     

沙眼衣原体感染实验室研究

沙眼衣原体是世界上最流行的性传播性疾病的病原体,它不仅是沙眼,也是非淋菌性尿道炎、宫颈炎、子宫内膜炎、盆腔炎、新生儿包涵体结膜炎、婴儿肺炎等的病原体。沙眼衣原体感染的诊断主要取决病原学检查,实验室诊断方法主要有涂片镜检法、接种培养法、抗原抗体检测法、核酸检测法等。综述沙眼衣原体的实验室研究现状,为临床检验和实验研究提供参考。     

女性不孕与生殖道沙眼衣原体感染的关系初探

为探讨女性不孕与其生殖道沙眼衣原体感染的关系，从１４７例不孕妇女输卵管及宫颈内取样，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测，并以６０例正常妊娠妇女输卵管内取样作为对照组。结果显示：不孕组输卵管和宫颈的沙眼衣原体感率分别为１５．６６％和２２．４５％，对照组输卵管沙眼衣原体感染率仅为３．３３％，两组比较差异显著（Ｐ＜０．０５）；同时显示年轻妇女与工人是感染的高危人群。由此表明不孕妇女生殖道沙衣原体感染是引起不孕的重要因素，特别是输卵管的感染尤为重要。其结果是引起输卵管粘连及阻塞，内膜及平滑肌损害，导致输卵管拾卵、授精及运输功能丧失而不孕。     

沙眼衣原体和解脲支原体感染对早期先兆流产的影响

目的 探讨沙眼衣原体和解脲支原体感染对早期先兆流产的预测价值.方法 选取深圳龙华新区人民医院2012年6月至2013年1月收治、因早期先兆流产主动要求人工流产的46例孕妇为观察组,并以同期入院行人工流产的47例健康孕妇为对照组.取两组患者的宫颈分泌物和蜕膜组织,分别进行沙眼衣原体及解脲支原体培养,并取流产后蜕膜组织做病理切片,显微镜下观察其形态学变化.结果 观察组患者宫颈分泌物的沙眼衣原体、解脲支原体及共感染阳性率分别为47.8%（22/46）、43.5%（20/46）、23.9%（11/46）,对照组相应阳性率分别为14.9%（7/47）、12.8%（6/47）、6.38%（3/47）,两组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）;观察组患者蜕膜组织沙眼衣原体、解脲支原体及共感染阳性率分别为43.5%（20/46）、41.3%（19/46）、15.2%（7/46）,对照组相应阳性率分别为6.38%（3/47）、8.51%（4/47）、4.26%（2/47）,两组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）;光镜观察可见,阳性患者蜕膜组织出现细胞肿胀、破裂,细胞核固缩和细胞液外溢,细胞间隙明显大于阴性患者.结论 生殖道沙眼衣原体和解脲支原体可逆行感染,损伤蜕膜组织,为早期先兆流产的重要原因之一.