腺病毒携带的人血管抑素基因抑制裸鼠卵巢癌生长的研究

目的研究腺病毒介导的人血管抑素基因对卵巢癌的治疗作用。方法建立人卵巢癌裸鼠动物模型,检测腺病毒介导的人血管抑素基因对肿瘤生长的抑制作用。结果人血管抑素基因可明显的抑制卵巢癌裸鼠移植瘤生长。结论腺病毒介导的人血管抑素基因在体内高效表达,并明显抑制人卵巢癌裸鼠移植瘤的肿瘤血管生成和肿瘤生长,为抗血管生成方法治疗卵巢癌的临床应用奠定了基础。     

腺病毒介导的反义血管内皮生长因子基因转染治疗胰腺癌的实验研究

目的：构建并鉴定反向插入VEGF165cDNA的重组腺病毒,探讨腺病毒介导的VEGF165反义核酸治疗胰腺癌的可行性。方法：应用基因重组技术，将513bp的人VEGF165cDNA反向克隆入腺病毒粘粒载体pAxCAwt。重组粘粒与腺病毒DNA－TPC混合后以磷酸钙共沉淀法转染293细胞制备重组腺病毒。建立胰腺癌裸鼠皮下种植瘤模型，瘤体内直接注射重组腺病毒，观察肿瘤的生长及血管生长情况。结果：成功构建了反向插入VEGF165cDNA的腺病毒粘粒载体pAxCAwt-αVEGF并制备出高滴度的重组腺病毒。实验第5周时肿瘤生长速度Ad-αVEGF治疗组比PBS和Ad-LacZ对照组均明显减慢（P＜0．01）；肿瘤微血管密度Pd-αVEGF治疗组比两个对照组均明显减少（P＜0．01）。结论：腺病毒介导的VEGF165反义核酸可以抑制胰腺癌的血管生成和肿瘤的生长，为抗血管生成的基因治疗提供了实验依据。     

基因转染肺癌细胞表达之血管内皮抑素对血管内皮细胞的影响

目的:研究肺癌A549细胞体外转染重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因后,其产物对血管内皮细胞增殖的抑制作用。方法:体外培养肺癌A549细胞,分为3组:实验组、缺陷型腺病毒组、PBS组。以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将血管内皮抑素基因导入体外培养的肺癌A549细胞,ELISA检测外源基因内皮抑素,在体外培养的肺癌A549细胞中的表达。体外培养血管内皮细胞,以MTT法评价重组血管内皮抑素基因腺病毒(Ad.Endostatin)转染肺癌细胞后含内皮抑素的上清液对内皮细胞增殖的抑制作用。结果:ELISA检测结果:重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因在转染的肺癌A549细胞中高效表达,在转染肺癌细胞后第1天即有内皮抑素的表达,在第3天达到高峰,5～7天后逐渐减弱。缺陷型腺病毒组及PBS组未见有表达。MTT检测结果:Ad.Endostatin转染肺癌A549细胞后表达的内皮抑素可抑制体外培养的血管内皮细胞的增殖,而缺陷型腺病毒组及PBS组对血管内皮细胞的增殖未见有抑制作用。结论:腺病毒介导的血管内皮抑素基因转染肺癌细胞表达之血管内皮抑素,能很好抑制血管内皮细胞的生长和增殖,为进一步开展肺癌基因治疗打下基础。     

rAAV-LyoVec载体介导血管抑素及野生型P53治疗C6胶质瘤

目的探讨重组腺病毒相关病毒(recombinant adenovirus-associated virus,rAAV)-阳离子脂质体(LyoVec)载体介导血管抑素(Angiastain)及野生型P53(wild typeP53)联合基因治疗C6胶质瘤。方法构建新型载体rAAV-LyoVec,建立裸鼠C6胶质瘤模型,观察各组不同时间肿瘤体积变化,免疫组织化学分析血管抑素、野生型P53及相关蛋白产物的表达情况,RT-PCR确认血管抑素基因在分子水平表达,电镜观察C6细胞凋亡、病毒转染、组织坏死等,从组织,细胞,蛋白,分子水平研究rAAV-LyoVec载体介导血管抑素及野生型P53联合治疗C6胶质瘤的有效性。结果rAAV-LyoVec载体介导血管抑素及野生型P53基因联合治疗C6胶质瘤,对比血管抑素及野生型P53单基因治疗效果显著(P<0.05),免疫组织化学检测各组细胞P53、VEGF及CD34蛋白均有不同程度的表达。RT-PCR法检测血管抑素在rAAV-angiastain-LyoVec组及rAAV-P53-LyoVec+rAAV-angiastain-LyoVec组表达。结论联合基因治疗是治疗脑胶质瘤的有效...     

canstatin基因治疗对小鼠人卵巢癌移植瘤生长及Caspase-3、Flk-1蛋白表达的影响

目的:探讨canstatin基因治疗对人卵巢癌移植瘤的影响.方法:18只裸鼠皮下接种人卵巢癌H08910PM细胞制备人卵巢癌移植瘤模型,当移植瘤体积达到50 mm3时,随机分3组治疗,分别注射腺病毒介导的canstatin基因(Ad-can)、Ad-GFP和PBS,2次瘤内多点注射,间隔72 h,每次4 × 1010 pfu.治疗期间每周2次用游标卡尺测量皮下移植瘤的长径和短径并计算移植瘤体积;治疗30 d后处死裸鼠,切取肿瘤检测肿瘤组织中Caspase-3、Flk-1蛋白的表达.结果:Ad-can治疗组肿瘤体积小于其余2组(P<0.05).3组肿瘤组织中均有坏死,Ad-can治疗组坏死明显.Ad-can治疗组Caspase-3蛋白表达高于Ad-GFP组和PBS组(P<0.05).Flk-1蛋白的表达低于其他2组(P<0.05).结论:人canstatin基因可能通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤的血管生成,从而抑制人卵巢癌细胞的生长.     

重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达及其影响

目的观察重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因(AdVEGF165)转染后大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中血管内皮生长因子的表达情况以及腺病毒载体对大鼠骨髓间充质干细胞的生长影响情况。方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,用腺病毒载体转染BMSCs。采用ELISA法检测血管内皮生长子因子(VEGF)的表达和分泌。转染后用胰酶消化传代培养,MTT法绘制细胞生长曲线。结果AdVEGF165转染组上清液中VEGF蛋白表达量极显著高于空白对照组(P<0.01)。且AdVEGF165转染BMSCs后,生长曲线与正常培养细胞无显著差异(P>0.05)。结论重组腺病毒载体能够在BMSCs中介导VEGF的表达,且对BMSCs生长无影响。     

X连锁凋亡抑制蛋白相关因子-1抑制肝癌裸鼠移植瘤生长的研究

目的 研究X连锁凋亡抑制蛋白相关因子-1(XAF1)基因对人肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法 建立人肝癌细胞株SMMC7721裸鼠荷瘤模型,每组5只裸鼠分别在瘤内分3点注射相同感染滴度的重组腺病毒Ad5/F35-XAF1、Ad5/F35-Null对照空病毒及等体积的磷酸缓冲液(PBS),隔天注射1次,疗程2周.每3天测量各组裸鼠移植瘤的体积,观察Ad5/F35-XAF1组移植瘤的生长与其他两组的差异.原位末端标记TUNEL法检测移植瘤细胞的凋亡,免疫组织化学法检测移植瘤中XAF1蛋白表达和微血管密度(MVD).结果 与PBS组和Ad5/F35-Null组比较,瘤内注射Ad5/F35-XAF1组裸鼠移植瘤体积、质量和MVD显著减小(P<0.05或P<0.01),而移植瘤细胞的凋亡指数和XAF1蛋白的表达率均明显增高(P<0.01).结论 腺病毒介导XAF1基因可抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生长,可能与该基因诱导肝癌细胞凋亡和抑制肿瘤血管形成有关.     

Ad-p53对人头颈部癌裸鼠移植瘤VEGF,MMP-2表达的抑制作用的研究

目的本实验旨在观察腺病毒载体介导的野生型p53基因(adenovirus-m ed iated w ild-type p53 gene,Ad-wp53)对人头颈部癌细胞裸鼠移植瘤血管生成的抑制效应,并对其抑制机制进行分析,为头颈部癌基因治疗的临床试验提供科学依据。方法利用免疫组化方法对人头颈部癌裸鼠移植瘤的肿瘤组织切片中血管内皮生长因子(vasocu lar endothelialgrowth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶-2(M atrix m etalloprote inase 2,MMP-2)的表达进行检测。其中A、B组为Ad-wp53基因治疗组:A组,Ad-wp53 1×109PFU/100μl;B组,Ad-wp53 1×108PFU/100μl。C、D组为单独腺病毒组:C组,DL312 1×109PFU/100μl;D组,DL312 1×108PFU/100μl;E组为空白对照组仅注射PBS缓冲液。结果A、B组的VEGF的表达明显低于C、D、E组,A组的MMP-2的表达与E组亦有明显的差异。结论有效的外源的野生型p53基因的转染可以显著抑制肿瘤组织VEGF以及MMP-2的表达,进而抑制肿瘤组织的血管生成。     

腺病毒介导RNA干扰抑制血管内皮生长因子的表达治疗人肺腺癌的实验研究

目的:构建针对人血管内皮生长因子(VEGF)的腺病毒载体pAd-Easy/VEGF,应用RNA干扰的方法,观察其在体内和体外对人肺腺癌细胞株A549生长的抑制作用.方法:应用PCR构建RNA干扰pAd-Easy/VEGF腺病毒载体,并利用该线性化质粒用Lipofectamine 2000转染293细胞,制备携带人VEGF的腺病毒转染A549细胞.荧光显微镜和流式细胞仪观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的转染效率,RT-PCR和蛋白质印迹法检测VEGF mRNA的表达,MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线.同时制备裸鼠A549细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况.结果:pAd-Easy/VEGF重组质粒经测序证实已把预设人VEGF基因RNA干扰的siRNA模板序列插入载体.转染重组腺病毒及空病毒24 h后流式细胞术测得转染效率分别为100%、99.7%.pAd-Easy/VEGF组VEGF表达水平较生理盐水对照组明显降低.pAd-Easy/VEGF组细胞生长明显减缓.pAd-Easy/VEGF治疗组肿瘤体积和质量明显小于对照组(P＜0.01).结论: pAd-Easy/VEGF介导的VEGF shRNA能有效抑制A549细胞中VEGF的表达,并在体内抑制肿瘤生长.     

腺病毒介导血管内皮抑素基因转染肺癌细胞后的表达

目的:观察重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因在体外转染A549细胞后的表达。方法:以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将血管内皮抑素基因导入肺癌A549细胞,以免疫组织化学法、Western印迹法和ELISA法检测内皮抑素在A549细胞中的表达。结果:免疫组化染色、ELISA法和Western印迹法检测:A549细胞中内皮抑素蛋白表达阳性,Ad.Null组及PBS组内皮抑素蛋白未见有表达。结论:Ad.Endostatin转染A549细胞可表达具有生物学活性的内皮抑素。     

转SLC基因转染胰腺癌疫苗对裸鼠成瘤性及淋巴转移的影响

目的 评价重组腺病毒介导的转次级淋巴组织趋花因子（secondarylymphoid tissue chemokine,SLC）基因自体肿瘤疫苗对活体胰腺癌的抑制作用,并探讨SLC的作用机制。方法 将人胰腺癌细胞株ASPCI,转染SLC基因。用MTT法评估ASPCI细胞的增生情况,用绒毛膜尿囊膜法评估其在活体和试管中的血管发生,并将转SLC基因的胰腺癌细胞灭活后种植于裸鼠胰腺癌模型观察其肿瘤生长抑制情况,用CD34免疫组化染色法测量微血管密度,用CD4、CD8免疫组化染色测量肿瘤浸润淋巴细胞。结果 转染SLC基因的ASPCI细胞的生长和管道生成与未转染SLC和生理盐水处理相比被明显抑制,绒毛膜尿囊膜法结果显示转SLC基因组的新血管生成少于未转染SLC组和生理盐水组。转染SLC基因组的肿瘤体积少于未转染SLC组和生理盐水组,转染SLC基因组的微血管密度亦少于未转染组和生理盐水组,而肿瘤内浸润淋巴细胞转SLC基因组显著增多。结论 腺病毒介导的转SLC基因自体肿瘤疫苗对治疗胰腺肿瘤有效。其作用机制可能与SLC抑制血管内皮细胞的生长和血管发生以及吸引免疫效应细胞有关。     

hAG(K1～3)联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因真核表达质粒对裸胃癌皮下移植瘤的作用

目的 探讨hAG(K1-3)联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因在体内对裸鼠胃癌皮下移植瘤的生长抑制作用.方法 通过亚克隆法构建重组质粒pBud-hAG及pBud-hAC-TRAIL,将人胃癌细胞SGC-7901注射裸鼠皮下形成移植瘤,并将移植瘤小鼠随机分为实验组和对照组.实验组包括pBud-hAG组和pBud-hAG-TRAIL组,各5只;对照组包括空质粒(pBud)组和生理盐水组,各5只.然后分别将2种重组质粒分次多点注入实验组移植瘤体内,并与对照组比较,通过检测移植瘤的体积和肿瘤微血管密度(MVD)研究其对肿瘤生长抑制情况及对肿瘤血管密度的影响.结果 pBud-hAG组和pBud-hAG-TRAIL组移植瘤的MVD分别是(4.6±1.2)个/高倍视野(HP)和(4.8±0.9)个/HP(P>0.05),而pBud组和生理盐水组分别是(17.4 ±2.4)个/HP和(18.2±2.7)个/HP,实验组和对照组之间差异有统计学意义(P<0.05).pBud-hAG组和pBud-hAG-TRAIL组的sTRAIL和hAG mRNA及蛋白表达均为阳性,其移植瘤体积分别是(1.862 ±0.017)cm3和(1.325±0.012)cm3(P<0.05),而pBud组和生理盐水组分别是(3.637±0.032)cm3和(3.521 ±0.028)cm3,实验组与对照组差异有统计学意义(P<0.05).结论 hAG(K1-3)通过抑制血管内皮细胞的生长而抑制肿瘤血管的生成,而TRAIL则通过诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤细胞生长,因此hAG(K1-3)联合TRAIL具有更强的抗肿瘤作用.     

局部分泌的血管抑素K（1—3）蛋白抑制人脑胶质瘤生长的实验研究

目的 探讨局部分泌血管抑素Ｋ（１￣３）蛋白〔ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ Ｋ（１￣３）,ＡＫ（１￣３）〕治疗人脑胶质瘤的可行性。方法 构建ＡＫ（１￣３０基因的真核表达载体ｐｃＤＮＡ－ＳＡＫ（１￣３）,经脂质体法将该载体转染入人脑胶质瘤细胞ＳＨＧ４４、行Ｇ４１８筛选。用电镜和流式细胞仪测定转染细胞的生物学性状,以内皮细胞抑制实验和免疫荧光实验检测该细胞表达的ＡＫ（１￣３）蛋白。应用裸鼠皮下致瘤性实验,结合     

携带人内皮抑素基因的肿瘤特异性增殖型腺病毒对卵巢癌的体内治疗作用

目的:探讨携带人内皮抑素基因的肿瘤特异性增殖型腺病毒CX-hE对卵巢癌裸鼠瘤株OV-90的抑制作用.方法:BALB/c裸鼠右背部皮下接种OV-90细胞成瘤.(1)18只荷瘤裸鼠随机分为PBS对照组、CX-hE治疗组和Ad-hE治疗组,皮下种植瘤内直接注射.各药物隔日注射1次,共注射5次.取肝脏组织行常规病理检查.(2)另15只荷瘤裸鼠随机分3组,分别瘤内单次注射CX-hE、Ad-hE和ONYX-015病毒纯化液.注射后第1、3、7天球后静脉取血ELISA检测人内皮抑素浓度,肿瘤组织行Hexon单克隆抗体免疫组化染色及微血管免疫组化染色.结果:(1)CX-hE组肿瘤生长速度较缓慢,开始治疗后2周肿瘤体积已明显小于Ad-hE组(P＜0.05)和PBS组(P＜0.01).常规H-E染色显示CX-hE组肿瘤组织内见散在坏死灶;肝脏无明显病理变化.(2)瘤内单次注射各药物后,裸鼠血清中均可检测到内皮抑素蛋白表达,随时间延长表达量逐渐升高.CX-hE组人内皮抑素浓度始终高于Ad-hE组(P＜0.01),增长速度较快.CX-hE单次瘤内注射2周,肿瘤Hexon免疫组化染色可见大量密集分布的阳性肿瘤细胞.CX-hE组肿瘤微血管免疫组化可见残余的癌巢内尚有散在分布的阳性血管内皮细胞.结论:瘤内直接注射的治疗方法可使瘤生长速度减慢,CX-hE治疗效果优于Ad-hE,未观察到各治疗组肿瘤生长停止或完全消退的理想治疗效果.     

Angiostatin K(1-3) gene for treatment of human gliomas: an experimental study

Objective To discuss the feasibility of gene therapy of human glioma by antiangiogenesis method.
Methods Angiostatin K(1-3) cDNA with secretive signal was inserted into the polylinker s ites of eukaryotic expression vector pcDNA3 to construct pcDNA-SAK(1-3).The vector was transfected into human SHG44 glioma cells by lipofectamine and the po sitive clone was screened by G418.The biological characteristics of glioma cel ls were examined by electronmicroscope and flow cytometry.The activity of angi ostatin K(1-3) protein expressed by SHG44 cells was examined by the bovine micr a ngium endotheliocyte inhibition assay and immunofluorescence assay.When SHG44 cells were implanted into the strata subcutaneum of nude mice, tumor necrosis an d micrangium were calculated immunohistochemically and electronmicroscopically f or determining their charac-teristics and validity in gene therapy of human glio ma by antiangiogenesis method.
Results The eukaryotic expression vector pcDNA-SAK(1-3) was successfully constructed and transfected into glioma cells.The cells expressed angiostatin K(1-3) prote i n, and their tumorigenesis and angiogenesis in nude mice were greatly reduced.
Conclusion Angiostatin K(1-3) gene is feasible to treat human glioma.This experiment lay s a foundation for gene therapy of the other solid tumors by antiangiogenesis method.     

Cloning and sequencing of the fragment of angiostatin K (1-3) gene

OBJECTIVE To secure anti-endotheliocyte hyperplasia functional fragment of human angiostatin K (1-3) gene.

METHODS As the template of leukocytotic cDNA, functional fragment of human angiostatin K (1-3) cDNA was amplified by PCR, cloned into the vector pGEM-3Zf, and sequenced according to Dye primer sequencing kit.

RESULTS The functional fragment of angiostatin K (1-3) cDNA (859 bp) was obtained by PCR and determined by sequencing.

CONCLUSIONS The angiostatin K (1-3) gene has been cloned. The gene is of great significance in tumor-antiangiogenesis therapy.

     

腺病毒介导的P16／CDKN2基因对TJ899细胞系活性的影响

（1）目的 研究5型腺病毒载体（Ad5)携带P16基因对恶性脑胶质瘤细胞系TJ899生长状态的影响。（2）方法 免疫组化（SP法）测定P16蛋白表达，MTT（methly thiazolyl tetrazolium,MTT)法测定恶性脑胶质瘤细胞系生长状态，克隆形成实验。（3）结果 重组体腺病毒能介导P16外源基因在恶性脑胶质瘤细胞系TJ899细胞中阳性表达，6d时肿瘤细胞生长抑制率为93%，并且能显地抑制肿瘤细胞的克隆形成能力。（4）结论 腺病毒介导P16基因能在肿瘤细胞中表达。并能明显抑制肿瘤细胞生长的状态。     

重组腺相关病毒介导TRAIL对卵巢癌裸鼠肝转移的抑制作用的实验研究

目的探讨重组腺相关病毒介导TRAIL对卵巢癌裸鼠肝转移的抑制作用。方法构建卵巢癌裸鼠肝转移模型。选择重组腺相关病毒rAAV—PEG—sTRAIL治疗，将裸鼠分为TRAIL治疗组和对照组，治疗6w后，观察肝转移率和肝转移结节数；Tunnel法分析TRAIL对肿瘤细胞的凋亡诱导情况。结果全身系统性给予重组腺相关病毒介导TRAIL后，治疗组和对照组相比转移率低，肝转移结节数目少，差异有统计学意义（p〈0．05）；Tunnel法分析TRAIL可诱导肿瘤细胞凋亡。结论重组腺相关病毒介导TRAIL可抑制卵巢癌裸鼠肝的转移生长，TRAIL用于卵巢癌肝转移的基因治疗中具有较好的应用前景。     

基于黑猩猩腺病毒6型的新型溶瘤病毒抑瘤研究

目的 以6型黑猩猩腺病毒(AdC6)为载体,构建一组新型溶瘤腺病毒,使之获得瘤内特异性复制能力.在体内外检测其抑瘤效果,并探讨其溶瘤机制.方法 以AdC6载体为基础,以人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动该腺病毒的复制相关基因E1A表达,获得重组溶瘤病毒AdC6-htertE1A-ΔE3,同源构建表达粒细胞-巨噬细...