人乳头瘤病毒PCR产物酶标-微孔板杂交分型

目的建立聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物直接酶标记微孔板反向分子杂交法用于人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）型别鉴定。方法利用ＨＰＶ通用引物介导ＰＣＲ（ＧＰＰＣＲ）扩增靶ＤＮＡ，然后对产物直接标记辣根过氧化物酶复合物（ＨＲＰＰＥＩＱＩ），与预先包被在微孔板上的ＨＰＶ寡核苷酸探针杂交后酶显色法检测。结果ＨＰＶ各型之间无交叉杂交；杂交灵敏度可达１３～７６个病毒ＤＮＡ拷贝，比ＰＣＲ琼脂糖凝胶电泳检测高１０倍；该法重复性好，阳性孔批内ＣＶ为６．３４％，批间ＣＶ为１０．５３％，阴性孔批内ＣＶ为１％，批间ＣＶ为５．７９％；而且杂交影响因素较少。结论该法特异性强、灵敏度高、操作简便，无放射性和ＥＢ染料污染，杂交时间短、仪器读取结果，便于大量常规临床样本定性或定量检测。     

聚合酶链反应-微孔板杂交作人乳头瘤病毒新亚型分子流行病学研究

目的 了解人乳头瘤病毒(HPV)新亚型(注册号：AF276910)的分子流行病学特点。方法 PCR-微孔板杂交检测泌尿生殖道标本、宫颈癌石蜡包埋组织、胃癌组织中HPV新亚型，结合临床特征了解其致病特点。结果 202例经HPV通用引物筛查阳性的泌尿生殖道标本中，2例HPV新亚型阳性，占0．1％；51例宫颈癌石蜡包埋组织中，3例HPV新亚型阳性，占5．9％；15例胃癌组织，未测到HPV新亚型。结论 早在5年前本地区HPV新亚型就已存在；HPV新亚型在宫颈癌组织中被测到．可能提示其有致癌作用．值得进一步研究。     

反向杂交法检测23种人乳头瘤病毒型别的研究

目的建立一种同时检测人乳头瘤病毒（HPV）5种低危型和18种高危型的反向杂交方法。方法将23种HPV型别（低危型：HPV6、11、42、43和44型，高危型：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83和MM4型）特异性探针固定于尼龙膜条上，生物素标记的通用引物介导PCR（GP-PCR）扩增HPVDNA，扩增产物与膜条经反向杂交检测HPV型别，并与HC-Ⅱ法及扩增和测序法平行检测136例临床标本，对检测结果进行对比。结果3种方法HPV阳性检出率分别为41．9％、42．6％和加．4％；反向杂交法与后二者检测结果之间均具有良好一致性（Kappa值分别为0．8644和0．9089）；以扩增和测序法为金标准，反向杂交法检测敏感度、特异度和准确性分别为96．36％、95．06％、95．59％。结论本法能一次性检测23种HPV具体型别，敏感度、特异度高，操作简便，结果易于判读，适合临床应用。     

聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针反向杂交法在HLA-DRB1分型中的应用

目的:探讨聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针(polymerasechainreaction-sequencespe-cificoligonucleotideprobes,PCR-SSOP)反向杂交法应用于人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)-DRB1配型的可行性。方法:随机选取25例已行聚合酶链反应顺序特异性引物(polymerasechainreac-tion-sequencespecificprimers,PCR-SSP)法HLA-DRB1配型的肾移植受者的血标本,采用PCR-SSOP反向杂交法再次配型,并与PCR-SSP法的结果比较。结果:两法的一致性达92%。2例不一致的患者经再次PCR-SSOP反向杂交法配型后,其中1例与PCR-SSP结果一致,PCR-SSOP反向杂交法的平均操作时间为4小时30分。结论:PCR-SSOP反向杂交法是一种能以中等分辨度进行等位基因分型的方法,操作较简单,结果解读客观,适用于临床肾移植配型。     

PCR和探针杂交技术检测口腔粘膜疾病中人乳头瘤病毒的核酸

联合应用ＰＣＲ和核酸杂交的方法对１５份口腔粘膜疾病患者样品进行了分析。用ＰＣＲ技术测ＨＰＶ－１６为３份阳性，ＨＰＶ－１８为７份阳性；然后用探针杂交检测ＰＣＲ产物其ＨＰＶ－１６，３份阳性，ＨＰＶ－１８，１０份阳性。以上结果表明ＨＰＶ与口腔粘膜疾病有一定的关系；用ＰＣＲ扩增法和探针杂交法联合检测可提高检测率。     

第二代杂交捕获法与多重荧光PCR在检测高危型人乳头瘤病毒中的应用比较

目的探讨第2代杂交捕获法（HC2）和多重荧光聚合酶链反应（PCR）在女性生殖道高危型人乳头瘤病毒（HPV）中的检测性能。方法随机选择267例宫颈疾病患者，采集宫颈部位分泌物，运用美国食品药品监督管理局（FDA）认证的HC2和多重荧光PCR分别检测标本中的HPV，并将2种方法检测结果不一致的标本进行测序分析。结果HC2和多重荧光PCR检测高危型HPV的阳性率分别为33．33％和31．46％；HC2和多重荧光PCR对高危型HPV感染的诊断敏感性分别为85．88％和90．32％，特异性分别为91．21％和99．43％。结论与HC2相比，多重荧光PCR检测高危型HPV的敏感性和特异性均有提高。     

粤东地区尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒检测及型别分析

目的探讨粤东地区尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒（HPV）的检测与分型。方法采用聚合酶链反应（PCR）检测粤东地区101例尖锐湿疣患者病损组织中的HPV。结果HPV的检出率为70．3％（71／101）,其中HPV6、11型的检出率为51．5％（52／101）,HPV42型的检出率为3．0％（3／101）,HPV43型的检出率为2．0％（2／101）,其他型的检出率为13．8％（15／101）。结论粤东地区尖锐湿疣患者HPV感染以HPV11型和HPV6型为主,感染高峰年龄为20～40岁。     

应用实时荧光聚合酶链反应技术与第二代杂交捕获法检测高危亚型人乳头瘤病毒

目的比较实时荧光聚合酶链反应（PCR）与第2代杂交捕获法（HC-Ⅱ）2种人乳头瘤病毒（HPV）检测方法。方法采用实时PCR与HC-Ⅱ分别检测223例宫颈脱落细胞标本中的高危亚型HPV,对结果不一致的标本进行测序分析。结果实时PCR和HC-Ⅱ2种方法检测高危亚型HPV的一致性较好,总符合率为77％,总一致性指数（Kappa指数）为0．538。其中,高度鳞状上皮细胞内病变（HSIL）组二者的符合率为82％,Kappa指数为0．410,一致性比其他组好。结论实时PCR与HC-Ⅱ检测结果一致性较好,尤其对于HSIL患者,可作为临床上HPV高危亚型检测的有效手段。     

用实时荧光定量PCR检测NAT2基因型及其意义

目的 探讨深圳地区汉族人中NAT2基因分布特征,为开展NAT2基因与肿瘤相关性研究和药物代谢性疾病诊治提供依据。方法将DNA浓度为40 ng/μl的标本进行1×100、1×101、1×102、1 ×103、1 ×104倍比梯度稀释,以验证实时荧光定量PCR检测NAT2基因的灵敏度。采用实时荧光定量PCR结合TaqMan探针技术检测554名深圳汉族健康人NAT2基因282、341、481、590和857突变位点,并进行基因分型。同时用直接测序法对47名健康人标本进行平行检测,以验证和评价荧光定量PCR检测NAT2基因的敏感度、特异度和准确性。结果 经倍比梯度稀释试验验证实时荧光定量PCR检测NAT2基因的灵敏度可精确至10-4ng/μl。采用实时荧光定量PCR从554名深圳汉族人中检出NAT2*4、*5、*6、*7、*11等位基因频率分别为64.6％( 358/554)、6.3％( 35/554)、25.3％ (140/554)、30.0％( 166/554)、0.6％( 3/554)。主要基因型NAT2* 4/*6、*6/*7、*13/*13或*12/*12或*4/*4、*4/*7、*7/*13、*12、*6/*13(*12)频率依次为12.3％(68/554)、8.3％ (46/554)、7.6％(42/554)、40.5％(224/554)、8.1％ (45/554)、7.2％ (40/554)、5.6％(31/554),7种基因型约占总基因型的89.6％ (496/554)。深圳地区汉族人中NAT2基因主要等位基因为*4、*6、*7、*13,表型以快乙酰化型和中间型为主,分别占40.5％( 224/554)、46.7％(259/554),慢乙酰化型仅占12.8％(71/554)。用荧光定量PCR和直接测序法平行检测47名健康人NAT2基因,与直接测序法比较,检测282、341、481、590、857位点的敏感度分别为88.2％ (30/34)、87.5％( 7/8)、80.0％ (4/5)、100.0％ (22/22)、93.8％ (15/16),特异度分别为100.0％ (13/13)、94.9％ (37/39)、100.0％ (42/42)、96.0％( 24/25)、96.8％( 30/31),准确性分别为91.5％(43/47)、93.6％( 44/47)、97.6％( 46/47)、97.9％ (46/47)、95.7％ (45/47)。结论实时荧光定量PCR检测NAT2基因的灵敏度、敏感度、特异度高,适用于临床及科学研究,深圳地区汉族人主要NAT2等位基因是*4、*6、*7,最常见慢乙酰化表型为*6/*7,这为与NAT2基因相关的代谢性疾病及肿瘤研究提供了数据。     

聚合酶链反应微孔板杂交法检测解脲脲原体及药敏分析

目的 建立敏感、特异的聚合酶链反应－微孔板杂交法（ＰＣＲ－ＭＰＨ）检测解脲脲原体（Ｕｕ）的感染,并分析药敏情况。方法 将带有生物素标记的Ｕｕ的聚合酶链反应产物结合在链霉亲和素包被的微孔板上,与标记地高辛的探针进行杂交后,通过标记碱性磷酸酶的抗地高辛抗体（ａｎｔｉ－ＤＩＧ－ＡＰ）与杂交分子进行反应,最终经底物显色后读数;同时应用生物梅里埃公司支原体培养试剂盒（ＩＳＴ）进行了Ｕｕ的培养及药敏试验。结果 通过优化多种试验条件建立了ＰＣＲ－ＭＰＨ法检测Ｕｕ,并分析了不同人群１５８份标本,其中微孔板杂交法阳性６５份,培养法阳性５６份;药敏结果显示,敏感率原始霉素１００％、交沙霉素９６．６％、强力霉素８９．７％、四环素７９．３％、氧氟沙星３４．５％、红霉素６．９％。结论 ＰＣＲ－ＭＰＨ法采用非放射性标记,具有无污染、经济、     

HPV分型及高危八型定量检测在宫颈病变中的意义

目的分析宫颈病变中的人乳头瘤病毒的亚型分布及病毒载量的情况,以及其与宫颈疾病进展的关系。方法潮州中心医院就诊的220例液基细胞学检查异常的患者行阴道镜检查及组织病理学检查。收集宫颈脱落细胞标本,运用HybriMax导流杂交技术检测HPV的21个亚型,运用实时荧光PCR定量检测八个高危亚型的病毒载量。结果220例样本中,HPV感染率为87.3％,其中HPV16是最主要的基因型（50．91％）,随着宫颈病变程度的增高,总HPV感染率和HPV16感染率逐渐升高。HPV58,HPV33,HPV52,HPV31和HPV18是仅次于HPV16的五种基因亚型,其检出率分别为22．73％,11．82％,11．36％,5．9％和4．54％。高危HPV亚型的病毒载量与宫颈病变的严重程度呈正相关（1=0．373,P〈0．001）。结论尽管HPV52和HPV58是该地区HPV感染的主导亚型,但在宫颈病变患者中HPV感染以HPV16为主,而与宫颈癌最相关的是HPV16和HPV18。病毒载量是一个潜在的确定子宫颈癌及癌前病变的辅助指标。     

Development of a quadriplex polymerase chain reaction for human cytomegalovirus detection

The development of a quadriplex PCR method with amplification of HCMV in a single‐step procedure using primers taken from four different regions of the viral genome is described. Different concentrations of dNTPs and MgCl₂ were assayed in order to optimize the constitution of the buffer for the multiplex PCR. The specificity of the PCR was tested with 100ng, 10ng, and 1ng of genomic MRC‐5 cell DNA infected with CMV in the presence of 10μg of uninfected MRC‐5 cell DNA. The sensitivity of the PCR was evaluated by the amplification of various amounts (100ng, 10ng, 1ng, and 0.1ng) of genomic MRC‐5 cell DNA infected with CMV. The specificity and sensitivity assays were performed for each pair of primers and for the combined four primer pairs in the multiplex PCR. CMV was consistently detected from 10ng of genomic MRC‐5 cell DNA with each primer pair. When all four sets of primers were combined in a single reaction tube, the sensitivity of the assay was equivalent to 10ng of genomic MRC‐5 cell DNA, whereas amplification from 1ng genomic MRC‐5 cell DNA produced only a subset of the amplimers. By amplifying four target‐sequences of HCMV simultaneously with minimum incubation time at each temperature, a quadriplex, highly sensitive PCR assay was performed. The use of four primer sets designed in different genomic regions of HCMV allowed the detection of variants and achieved maximal sensitivity and specificity which are essential for a diagnostic utilization. J. Clin. Lab. Anal. 13:99–105, 1999. © 1999 Wiley‐Liss, Inc.     

Detection and typing of human papillomaviruses in cervical smears by an original application of the polymerase chain reaction

The detection and typing of human papillomaviruses on cervical smears were performed by means of a new application of the polymerase chain reaction allowing easier and faster detection of the amplification product. This application consisted of a combination of two series of amplifications and the use of primers labelled with biotin and with 125 iodine on a reporter group for the second amplification. The final amplification product was detected by counting the radioactivity after incubation of the media in avidin-coated tubes. This test was compared with conventional methods of detection by electrophoresis and Southern blot and its specificity was confirmed. The study of a series of 52 patients demonstrated a higher prevalence of type 16 in relation to type 6/11 and 18 and a correlation between the degree of dysplasia and the frequency of oncogenic types 16 and 18. This new application could facilitate studies of the prevalence of HPV in large series of cervical smears.     

PCR-反向点杂交技术在女性下生殖道人乳头瘤病毒感染分型检测的应用研究

目的 探讨PCR-反向点杂交分型技术在临床人乳头瘤病毒(HPV)感染基因分型中的应用.方法 采用PCR-反向点杂交分型技术,对1 702例女性进行下生殖道23种HPV亚型感染筛查.结果 HPV总感染率为17.6%(300/1 702),有21种型别被检出,感染率最高的为低危HPV43型(3.82%),其他型别分别为HPV16(3.70%)、52(2.70%)、6(2.47%)、58(1.88%)、18(1.76%)、56(1.53%)、68(1.29%)、11(0.88%)、33(0.82%)、66(0.71%)、59(0.59%)、53(0.53%)、42(0.53%)、31(0.35%)、73(0.24%)、51(0.18%)、35(0.18%)、83(0.12%)、45(0.06%)和39(0.06%),高危型感染13.9%(237/1 702),低危型感染6.4%(109/1 702),多型感染3.5%(59/1 702);1 702例HPV感染高峰年龄为大于或等于50岁(29.41%),各年龄段HPV感染检出率差异有统计学意义(P<0.05).结论 PCR-反向杂交分型技术能够同时检测高危和低危HPV,可判断多型感染,在临床诊断和普查方面均有重要意义.     

Development and clinical application of a polymerase chain reaction-based assay for detectingBacteroides ureolyticus

We developed a polymerase chain reaction (PCR)-based assay for detectingBacteroides ureolyticus. No DNA fragments hybridizing the internal probe specific forB. ureolyticus were amplified from the DNAs of other bacterial species tested. This assay can detect the amount of DNA corresponding to 18 cells ofB. ureolyticus. Using this assay, we examined urethral swab specimens from men with nongonococcal urethritis (NGU) and asymptomatic men for the presence ofB. ureolyticus. WhileB. ureolyticus was detected in 6 (12.0%) of 50 asymptomatic men, this was not significantly different from the detection rate of 19.3% (22 of 114 specimens) in men with NGU. This study demonstrates that the PCR-based assay can be applied for detectingB. ureolyticus in clinical specimens and suggests that this assay might develop into a useful tool for analyzing the pathogenicity of this organism in various organs.     

应用导流杂交基因芯片技术对HPV感染基因分型检测的研究

目的探讨核酸分子快速导流杂交基因芯片技术（flow-through hybridization and gene chip,Hybri Max）对人乳头状瘤病毒（human papillomavirus,HPV）感染分型检测中的应用。方法对558例临床患者进行液基细胞学检测（LPT）,异常者做组织病理学诊断,同时采用Hybri Max技术,对558例患者的宫颈细胞进行HPV DNA检测和分型。结果558例患者中,细胞学异常的370例,并对异常者做病理学诊断,结果为：慢性炎症80例,CINI70例,CINII76例、CINIII82例、宫颈癌62例。②全部患者均进行HPVDNA的检测与分型,其HPVDNA阳性的是：细胞学正常的188例中有40例（21.3%）,慢性炎症有48例（60.0%）,CINI有52例（74.3%）,CINII有68例（89.5%）,CINIII有76例（92.7%）,宫颈癌有62例（100%）。结论对HPV感染的检查以及通过Hybri Max技术对HPVDNA基因分型检测的研究,对宫颈癌早期发现,判断预后及指导治疗有重要价值。     

荧光定量PCR检测急性髓细胞白血病患者BAALC基因及临床意义

目的研究急性髓细胞白血病（AML）患者BAALC（brain and acute leukemia cytoplasmic）基因的表达水平及其临床意义。方法构建实时定量PCR检测BAALC基因表达的技术，并定量检测63例初治AML患者BAALC基因的表达水平及分析其与临床疗效的关系。结果建立的实时定量PCR方法的标准曲线相关系数大于0．99。49例（78％）初治AML患者存在BAALC基因表达；BAALC基因高表达患者发病时外周血WBC计数、Hb浓度、PLT计数及骨髓白血病细胞比例分别为：（26．3±18．1）×10^9／L、（78．3±21．8）g／L、（76．9±64．5）×10^9／L和（61．2±22．3）％，低表达患者发病时外周血WBC计数、Hb浓度、PLT计数及骨髓自血病细胞比例分别为：（30．2±21．7）×10^9／L、（81．6±30．9）g／L、（73．9±57．2）×10^9／L和（54．3±16．3）％，两组间差异无统计学意义（P〉0．05）；正常核型初治AML患者中BAALC高表达率为68％（25／37），高于非正常核型AML患者[23％（6／26）]，差异有统计学意义（Х^2=12．093，P=0．001）；正常核型初治AML患者中BAALC基因高表达患者化疗的完全缓解率（CR）为65％（20／31），低于低表达患者[84％（27／32）]，差异有统计学意义（Х^2=6．573，P=0．013）。结论BAALC基因高表达是正常核型AML患者一个重要不良预后因素。     

实时荧光定量PCR检测VAD1 mRNA评估新型隐球菌性脑膜炎的疗效

目的 建立RT-FQ-PCR检测新型隐球菌VAD1 mRNA的方法 ,探讨定量测定VAD1 mRNA用于CNM疗效评估的可行性.方法 依据GenBank收录的新型隐球菌VAD1 mRNA全序列,设计引物和TaqMan探针,建立RT-FQ-PCR检测VAD1 mRNA的方法 .检测25例CNM患者和30例其他神经系统疾病对照组患者脑脊液,评价方法 的敏感度及特异度;检测25例CNM患者急性期与恢复期脑脊液中VAD1 mRNA的表达量,分析VAD1 mRNA与CNM治疗效果的关系.结果 建立的标准曲线相关系数为-0.997 9,检测下限为101 拷贝数/μl,高、中、低浓度质粒标准品批内CV值分别为0.65%、0.89%和1.23%;RT-FQ-PCR法检测新型隐球菌的敏感度为96%(24/25),特异度为100%(30/30);急性期VAD1 mRNA表达量为3.042±0.906,明显高于恢复期的2.187±0.665,差异有统计学意义(t=4.583,P＜0.01).结论 本研究建立的RT-FQ-PCR方法 具有较高的敏感度、特异度和重复性,适合于新型隐球菌的VAD1 mRNA检测;VAD1 mRNA表达水平与CNM的治疗效果有关.