热休克蛋白参与PI3K/Akt 介导H2O2 预处理的抗凋亡作用

目的: 探讨热休克蛋白(HSP)是否参与PI3K/Akt信号通路介导的H₂O₂预处理的抗细胞凋亡作用。方法: 利用PC12细胞建立H₂O₂预处理对抗高浓度H₂O₂诱导细胞凋亡的实验模型,分组如下:(1)空白对照组;(2) 损伤组;(3)预处理＋损伤组; (4)LY294002＋预处理＋损伤组;(5) LY294002组;(6) quercetin＋预处理＋损伤组;(7) 17-AAG＋预处理＋损伤组;(8) 溶剂对照组。应用Hoechst 33258染色观察细胞凋亡形态,碘化丙啶(PI)染色流式细胞术检测细胞凋亡率,比色法测定caspase-3的活性,免疫印迹法(Western blotting)测定HSP的表达水平。结果: 100 μmol/L H₂O₂预处理PC12细胞90 min可显著地抑制300 μmol/L H₂O₂引起的细胞凋亡,使caspase-3的活性降低,同时上调HSP70和HSP90的表达。HSP70和HSP90的抑制剂quercetin和17-AAG拮抗H₂O₂预处理的抗细胞凋亡作用。 PI3K抑制剂LY294002不仅拮抗了H₂O₂预处理抗细胞凋亡的作用,并且抑制H₂O₂预处理对HSP70和HSP90的表达上调。结论: PI3K/Akt通路、HSP70和HSP90均参与H₂O₂预处理诱导的细胞保护作用。并且HSP70和HSP90参与PI3K/Akt信号通路介导H₂O₂预处理的抗细胞凋亡作用。     

ERK1/2－STAT3通路在H2O2预处理导致的适应性细胞保护中的作用

目的：探讨ERK1/2-STAT3通路在H₂O₂预处理导致的适应性细胞保护中的作用。方法：在PC12细胞建立H₂O₂预处理对抗氧化应激（300 μmol/L H₂O₂）损伤细胞的模型。应用Hoechst33258核染色法观察细胞调亡的形态学改变；应用碘化丙啶(PI)染色流式细胞术检测细胞凋亡率；免疫印记法(Western blotting) 测定p-ERK1/2和p-STAT3的表达水平。结果：100 μmol/L H₂O₂预处理PC12细胞90 min可明显抑制300 μmol/L H₂O₂作用12 h引起的细胞凋亡，并激活ERK1/2和STAT3；ERK1/2抑制剂UO126和JAK2抑制剂AG-490（10 μmol/L）均可明显地阻断H₂O₂预处理引起的细胞保护作用；UO126（10 μmol/L）亦能明显地抑制H₂O₂预处理对STAT3的上调作用。结论：H₂O₂预处理能激活PC12细胞的ERK1/2-STAT3信号转导旁路，这可能是预处理的细胞保护机制之一。     

As2O3诱导肿瘤细胞凋亡依赖H2O2途径

目的：探讨三氧化二砷（arsenic trioxide，As₂O₃）对人乳头瘤病毒（HPV）阳性宫颈癌HeLa细胞和HPV阴性胰腺癌AsPC-1细胞的 凋亡诱导作用与细胞内H₂O₂水平的关系。方法：采用不同浓度的As 2O3处理HeLa细胞和AsPC-1细胞不同时段，显微镜下观察细胞的凋亡，噻唑蓝（MTT）法 测定细胞生长抑制情况；不同浓度的As₂O₃处理细胞2、5、8、12、24 h后，用DCFH-DA 标记检测细胞内的H₂O₂水平。结果：2 μmol/L As₂O₃处理HeLa 细胞48 h后细胞的生长受到明显抑制，表现出细胞凋亡的特征，随着As₂O₃浓度的增加 和作用时间的延长效果更加明显。而 1 μmol/L As₂O₃处理AsPC-1细胞24 h 即呈 现明显 的生长抑制和凋亡特征。As₂O₃处理HeLa细胞2 h细胞内H₂O₂的水平比对照组升高(1 0 μmol/L组达51.30%)，持续到8 h达到高峰（升高84.19%），12 h后下降，24 h水平与 对照组接近，并有明显的剂量依赖性。As₂O₃处理AsPC-1细胞2 h后，细胞内H₂O₂的 水平也明显升高（10 μmol/L组达79%），持续到5 h达到高峰（增高169%），且该细胞内H₂O₂水平升高比HeLa细胞更明显，12 h之后的变化情况与HeLa细胞类似。结论:As₂O₃诱导HeLa细胞和AsPC-1细胞凋亡与细胞内的H₂O₂水平改变有关,而与HPV的感染无明显相关性。H₂O₂积累是As₂O₃诱导细胞凋亡途径中的早期事件,H₂O₂可能在As₂O₃诱导肿瘤细胞凋亡途径中扮演类似第二信使的作用。     

JAK-STAT通路调制NF-κB介导H2O2预处理的细胞保护作用

目的：探讨核因子-кB（nuclear factor-кB, NF-кB）在H₂O₂预处理诱导的适应性细胞保护作用中的作用及JAK-STAT通路对NF-кB的调制。方法：在PC12细胞建立H₂O₂预处理对抗氧化应激（300 μmol/L H₂O₂）损伤细胞的实验模型。应用碘化丙啶（PI）染色流式细胞术检测细胞凋亡率，免疫印迹法（Western blotting）测定NF-κB和STAT3的表达水平。结果：用100 μmol/L H₂O₂预处理PC12细胞90 min可显著地抑制300 μmol/L H₂O₂作用12 h引起的细胞凋亡，并明显地上调NF-κB和STAT3的表达，NF-κB抑制剂MG-132（10 μmol/L）和JAK2抑制剂AG-490（10 μmol/L）均可抑制H₂O₂预处理引起的适应性细胞保护作用及上调NF-κB表达的作用。结论：JAK-STAT通路调节NF-кB介导的H₂O₂预处理的细胞保护作用。     

木犀草素对H2O2氧化损伤的血管内皮细胞的影响

目的： 探讨木犀草素（luteolin）对氧化损伤的血管内皮细胞（endothelial cells）的影响。方法： 体外培养内皮细胞，将细胞分为7组，即空白对照组（control）、溶剂对照组（DMSO）、氧化损伤组（H₂O₂）、氧化损伤加入槲皮素对照组(quercetin+H₂O₂)、氧化损伤加入木犀草素低、中、高浓度组(luteolin-L+H₂O₂、luteolin-M+H₂O₂、luteolin-H+H₂O₂)。将750 μmol/L H₂O₂作用于加入槲皮素及不同浓度木犀草素预培养24h的内皮细胞，继续培养18h（半胱氨酸蛋白酶表达测定时间为14h），然后观察木犀草素对细胞培养液内乳酸脱氢酶（LDH）、一氧化氮（NO）、乳酸脱氢酶（LDH）丙二醛（MDA）含量和细胞活力的影响, 并对细胞进行流式细胞和免疫组化分析，观察该药对细胞凋亡和半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）表达的影响。 结果： 木犀草素呈剂量依赖性降低H₂O₂对内皮细胞生长抑制率，降低MDA、LDH量，增加培养液中 NO^-₂/NO^-₃含量，并显著抑制半胱氨酸蛋白酶-3阳性表达，减少细胞凋亡数量，各指标差异显著（P<0.01）。结论： 木犀草素可拮抗和修复过氧化氢诱导的血管内皮细胞的损伤，其作用可能与抗氧化、促进NO释放，抑制caspase-3表达有关。     

山萘酚、芹菜素对H2O2诱导的心肌细胞凋亡过程中线粒体损伤的影响

目的：观察山萘酚和芹菜素对H₂O₂诱导的大鼠心肌细胞凋亡过程中线粒体损伤的影响。方法:采用胰蛋白酶消化法，体外分离和培养新生大鼠心肌细胞，建立H₂O₂损伤心肌细胞模型。以MTT法检测心肌细胞活力，流式细胞仪检测心肌细胞凋亡情况，JC-1荧光探针测定线粒体膜电位，estern blotting 法检测胞浆中细胞色素C（Cyt C）的表达。结果:与模型组比较，山萘酚和芹菜素能显著提高心肌细胞活力，降低心肌细胞凋亡率，抑制线粒体膜电位下降和Cyt C释放。结论:山萘酚和芹菜素对H₂O₂诱导的心肌细胞凋亡具有明显的抑制作用,山萘酚的抗氧化作用强于芹菜素，其机制可能依赖于抑制线粒体膜电位降低和Cyt C释放。     

普罗布考抑制bFGF和H2O2引起的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖

目的： 研究普罗布考抑制碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和H2O2促大鼠主动脉平滑肌细胞（RASMCs）增殖的机制。方法: 采用MTT、［³H］-TdR掺入法、流式细胞术和RT-PCR观察普罗布考对bFGF和H₂O₂刺激条件下细胞周期、细胞增殖和凋亡的影响。结果: ①普罗布考抑制bFGF和H₂O₂刺激RASMCs增殖。细胞计数、A值和［³H］-TdR掺入量分别下降了40.0%、39.1%、45.5%和46.9%、45.0%、39.5%（P<0.05，P<0.01）。②普罗布考使RASMCs生长停滞在G₀/G₁期，抑制bFGF刺激的细胞增殖，通过诱导细胞凋亡和抑制细胞生长2种方式抑制H₂O₂刺激的细胞增殖。③bFGF和H₂O₂分别使ERK1mRNA表达量增加近4倍和6倍，MKP-1mRNA表达量下降了62.4%和82.2%。普罗布考抑制ERK1mRNA表达，使H₂O₂诱导的MKP-1表达下降上调，而对bFGF诱导MKP-1表达下降无明显影响。结论: 普罗布考通过降低ERK1mRNA表达抑制细胞周期运转和诱导RASMCs凋亡，从而抑制bFGF和H₂O₂刺激引起的细胞增殖。     

管花苷B对抗H2O2诱导的PC12细胞凋亡

目的：观察肉苁蓉提取物管花苷B对H₂O₂诱导的PC12细胞损伤的影响。方法：用MTT法检测细胞存活率，以激光共聚焦显微镜荧光染色法检测细胞内活性氧的产生和线粒体膜电位的变化，DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测细胞凋亡的发生，并用荧光酶标仪测定caspase-3的活性。结果：100 μmol·L^-1 H₂O₂处理细胞24 h显著降低细胞的存活率；诱导细胞发生凋亡，凋亡率达48.0％；细胞内活性氧水平及caspase-3的活性显著升高；而线粒体膜电位却明显降低，红/绿荧光强度的比值由正常的5.97降低为0.41左右。而预先给予1、10或100 mg·L^-1浓度的管花苷B处理细胞12 h，可显著提高细胞存活率；并可有效抑制DNA ladder的发生；流式细胞仪检测凋亡率分别降低到30.9%、18.3%和6.2%；激光共聚焦显微镜结果显示管花苷B可明显降低细胞内活性氧的水平；并可逐渐恢复线粒体的高能量状态；caspase-3的活性不断降低，并呈现了一定的剂量依赖性。结论：管花苷B能显著地抑制H₂O₂诱导的PC12细胞凋亡，其神经细胞保护作用可能与其降低细胞内活性氧水平，维持线粒体膜电位的高能状态和抑制caspase-3的活性有关。     

西红花酸对H2O2诱发心肌细胞凋亡及相关调控蛋白caspase-3、Bcl-2表达改变的影响

目的：探讨西红花酸对过氧化氢（H₂O₂）诱导的培养心肌细胞凋亡及相关调控蛋白caspase-3、Bcl-2表达改变的作用。 方法： 通过光镜观察细胞形态、碘化丙啶（PI）染色法和流式细胞术相结合检测培养细胞凋亡率、免疫荧光染色法和流式细胞术相结合检测细胞中caspase-3、Bcl-2蛋白。 结果： 在本实验使用浓度范围内，各浓度H₂O₂组细胞形态明显改变、凋亡率明显高于正常对照组，1×10^-4 mol·L^-1 H₂O₂可使培养心肌细胞Bcl-2蛋白表达明显减少，而caspase-3表达明显增多；各剂量西红花酸组细胞形态学改变减少、凋亡率明显低于1×10^-4 mol·L^-1 H₂O₂组，细胞中Bcl-2蛋白减少幅度与caspase-3增加幅度均减小，且较高浓度（5×10^-5 mol·L^-1）西红花酸组比较低浓度（5×10^-7 mol·L^-1）西红花酸组作用也更明显（P<0.05）。 结论： 西红花酸能够减轻H₂O₂对培养心肌细胞的损伤性凋亡作用，可能与稳定细胞内凋亡相关调控蛋白caspase-3、Bcl-2的功能有关。     

钙网蛋白参与缺氧预处理对氧化应激损伤大鼠成心肌H9c2细胞的保护作用

目的： 观察缺氧预处理(HPC)对氧化应激诱导大鼠成心肌H9c2细胞损伤的保护作用，探讨钙网蛋白(CRT)是否参与其保护效应及p38 MAPK是否参与其信号转导过程。方法: H9c2细胞随机分为8组：氧化应激(H₂O₂)组、短暂缺氧(HPC)组、HPC+H₂O₂组、SB203580+HPC + H₂O₂组、反义干扰(AS)组、AS+H₂O₂组、AS+HPC+H₂O₂组和对照组。以细胞存活率、乳酸脱氢酶 (LDH)活性及流式细胞术检测细胞损伤情况；采用RT-PCR和Western blotting分别检测CRT表达和p38 MAPK磷酸化水平。结果: (1)HPC可减轻氧化应激损伤，与H₂O₂组比较，HPC+ H₂O₂组细胞凋亡率和LDH漏出分别降低13.4%和44.0%，存活率增高12.7%(均P<0.05)；HPC前以特异性p38 MAPK抑制剂 SB203580预孵育消除HPC的保护作用，与HPC+H₂O₂组相比，细胞凋亡率和LDH漏出分别增高5.4%和45.0%，存活率降低5.0%(均P<0.05)；(2)氧化应激明显上调CRT表达(较对照组高3.6倍)(P<0.05)；单纯短暂缺氧可诱导CRT表达(较对照组高1.4倍,P<0.05)，但上调程度较H₂O₂组低48%(P<0.05)；HPC可降低CRT过表达程度(降低26%) (P<0.05)；(3)反义寡核苷酸干扰CRT表达后HPC对氧化应激的保护作用降低，相关分析显示HPC诱导的CRT适度表达与细胞存活率正相关(r=0.8573,P<0.05)；(4) HPC前应用p38 MAPK抑制剂，抑制CRT表达上调(分别较HPC+H₂O₂组和HPC组低38%和23%) (均P<0.05)。结论: HPC可通过p38 MAPK信号途径诱导CRT表达上调，减轻大鼠成心肌H9c2细胞氧化应激损伤。     

瘦素抑制H_2O_2诱导的大鼠心肌细胞凋亡

目的:观察瘦素(leptin)对H2O2诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响并探讨其作用机制。方法:应用脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记(TUNEL)法观察瘦素对H2O2诱导的大鼠心肌细胞H9c2凋亡的影响;应用Western blotting法观察瘦素、H2O2对caspase-3、胞外信号调控激酶(ERK)活性的影响。结果:(1)瘦素对H2O2诱导的H9c2细胞凋亡具有显著的抑制作用(与对照组比较P0.01),该作用可被ERK激酶抑制剂PD98059所阻断。(2)H2O2明显抑制ERK活性;而瘦素可激活ERK并部分阻断H2O2诱导的caspase-3激活。结论:瘦素对H2O2诱导的H9c2细胞凋亡具有抑制作用,其机制可能与其激活ERK信号途径有关。     

Melissa Officinalis L. Extracts Protect Human Retinal Pigment Epithelial Cells against Oxidative Stress-Induced Apoptosis

Background: We evaluated the protective effect of ALS-L1023, an extract of Melissa officinalis L. (Labiatae; lemon balm) against oxidative stress-induced apoptosis in human retinal pigment epithelial cells (ARPE-19 cells).Methods: ARPE-19 cells were incubated with ALS-L1023 for 24 h and then treated with hydrogen peroxide (H₂O₂). Oxidative stress-induced apoptosis and intracellular generation of reactive oxygen species (ROS) were assessed by flow cytometry. Caspase-3/7 activation and cleaved poly ADP-ribose polymerase (PARP) were measured to investigate the protective role of ALS-L1023 against apoptosis. The protective effect of ALS-L1023 against oxidative stress through activation of the phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) was evaluated by Western blot analysis.Results: ALS-L1023 clearly reduced H₂O₂-induced cell apoptosis and intracellular production of ROS. H₂O₂-induced oxidative stress increased caspase-3/7 activity and apoptotic PARP cleavage, which were significantly inhibited by ALS-L1023. Activation of the PI3K/Akt pathway was associated with the protective effect of ALS-L1023 on ARPE-19 cells.Conclusions: ALS-L1023 protected human RPE cells against oxidative damage. This suggests that ALS-L1023 has therapeutic potential for the prevention of dry age-related macular degeneration.     

重组色素上皮衍生因子对人视网膜微血管内皮细胞迁移及凋亡的影响

目的: 构建rAAV2-PEDF腺相关病毒,研究色素上皮衍生因子(PEDF)基因高表达对人视网膜微血管内皮细胞的作用。方法: 将PEDF基因克隆、重组到腺相关病毒载体pSNAV,得到的pSNAV-PEDF后转染BHK细胞,用含G418的培养基进行筛选,得到稳定转染pSNAV-PEDF的生产细胞系,用重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/△UL2感染细胞进行病毒包装,纯化后得到高滴度rAAV2-PEDF 病毒颗粒。按照10⁵v.g./cell的剂量进行rAAV2-PEDF病毒转染,分别设空白和阴性对照,激光共聚焦显微镜下观察GFP阳性细胞,Western blotting检测PEDF蛋白表达。Boyden小室法观察细胞迁移情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果: 通过PCR、酶切及基因测序的方法,证实rAAV2-PEDF构建成功。转染病毒48 h后,激光共聚焦显微镜下观察可见GFP阳性细胞,Western blotting检测,实验组PEDF表达明显强于其它组。rAAV2-PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,正常对照组凋亡细胞比例为2.10%±0.53%,rAAV2-GFP组为3.40%±0.62%,rAAV2-PEDF组为1.60%±0.47%,各组间无显著差异(P＞0.05)。rAAV2-PEDF干预低氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,单纯CoCl₂组凋亡细胞比例为4.00%±0.55%,CoCl₂+rAAV2-GFP组为6.10%±0.71%,CoCl₂+rAAV2-PEDF组为40.00%±2.10%。rAAV2-PEDF组与其它2组相比,有显著差异(P<0.05)。细胞迁移计数显示,正常对照组为33.0±2.7,rAAV2-GFP组为35.0±3.6,rAAV2-PEDF组为12.0±2.1,rAAV2-PEDF组与其它2组相比,有显著差异(P<0.05)。结论: 成功构建了rAAV2-PEDF,转染人视网膜血管内皮细胞后PEDF可稳定表达。PEDF高表达可显著抑制人视网膜微血管内皮细胞迁移并可在低氧条件下诱导其凋亡。     

胆红素对大鼠急性肺损伤形成过程中氧自由基以及caspase-3表达的影响

目的： 探讨胆红素对抗急性肺损伤（ALI）形成的可能机制。方法: 健康雌性Wistar大鼠(190-210 g) 30只，随机分为生理盐水对照组、脂多糖（LPS）致ALI模型组、胆红素干预组。检测肺组织匀浆中羟自由基（OH^-）、过氧化氢(H₂O₂)和超氧阴离子自由基（O₂^·）含量以及肺组织中caspase-3表达的变化。结果: ①ALI模型组肺组织匀浆OH^-、H₂O₂、O₂^·含量及肺组织中caspase-3表达显著高于生理盐水对照组（均P<0.05）。②胆红素干预组肺组织匀浆OH^-、H₂O₂、O₂^·及肺组织中caspase-3表达明显高于ALI正常大鼠（均P<0.05），但少于ALI模型组（均P<0.05）。结论: ①胆红素能在一定程度上减少肺内凋亡细胞数量。②胆红素能减少ALI大鼠肺组织OH^-、H₂O₂、O₂^·水平。③ Caspase-3表达的变化有促脂多糖性肺损伤细胞凋亡作用。