新基因ZNFD的克隆及其多克隆抗体的制备

目的:PCR扩增得到新基因ZNFD(Znf domain containing protein),构建pET32a-ZNFD原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法:通过PCR的方法克隆新基因ZNFD,选取部分抗原免疫原性较高的部分ORF序列,克隆到原核表达载体pET32a上,利用大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)表达系统表达ZNFD融合蛋白。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过琼脂糖双向扩散实验和Western blot鉴定其效价和特异性。结果:经测序鉴定已成功克隆ZNFD基因。通过构建原核表达载体pET32a-ZNFD,在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中使用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约为45 kD的融合蛋白。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强的免疫特异性。结论:得到纯化的ZNFD蛋白,制备的多克隆抗体达到了一定的效价,且具有高特异性,为进一步研究ZNFD的功能奠定了实验基础。     

人巨细胞病毒US31蛋白特异性抗体的制备及鉴定

目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）US31蛋白及其多克隆抗体的制备及鉴定方法。方法：HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至pET21a（+）原核表达载体,构建pET21a（+）/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导目的蛋白表达,Ni-NTA亲和层析法纯化US31蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot及免疫荧光方法检测抗体效价和特异性。结果：在大肠杆菌中诱导出高表达的HCMV US31融合蛋白,经Ni-NTA亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的IgG抗体,效价为1:49 600;经ELISA、Western blot以及免疫荧光均证实制备的特异性抗体可识别细胞中表达的US31蛋白。结论：成功制备了HCMV US31蛋白及特异性抗体,为进一步研究US31蛋白的生物学功能奠定了基础。     

HIV-1 p15（Gag）基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的:构建HIV-1p15(Gag)原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法:用PCR的方法扩增编码p15(Gag)基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a( )中,利用大肠杆菌表达系统表达HIV-1p15蛋白,分别用His抗体和HIV阳性血清做western blot鉴定目的蛋白的免疫原性。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),细胞免疫组织化学法检测抗体滴度及其特异性。结果:原核表达载体pET28a( )-p15(Gag)成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约20KD的p15(Gag)蛋白,经western blot鉴定正确。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论:得到纯化的HIV-1p15蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白p15(Gag),为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。     

人胱抑素C的原核表达纯化鉴定及抗血清的制备

目的 构建人胱抑素C(cystatin C, Cys C)的原核表达载体,并用纯化的Cys C重组蛋白免疫家兔,制备Cys C抗血清. 方法 从HL-60细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增Cys C基因,将测序正确的目的基因克隆至pET32 (a)表达载体中,并诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化、透析复性、Western blot鉴定后,免疫家兔制备抗血清,抗体效价和特异性分别采用ELISA、Western blot进行检测.结果 测序证实克隆的基因序列与GeneBank中的Cys C序列相符;SDS-PAGE、Western blot结果证实获得相对分子质量为35×103的Cys C 融合蛋白,其表达形式为不溶性包涵体;此包涵体蛋白经Ni2 亲和层析能有效纯化,以该蛋白免疫家兔制备抗血清,抗体效价为1∶8 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合. 结论 获得了Cys C重组蛋白及特异性多克隆抗体.     

人YB-1蛋白的高效原核表达、纯化及其多抗的制备

目的 构建YB-1原核表达系统,诱导表达后纯化YB-1融合蛋白并制备其多抗.方法 采用RT-PCR扩增YB-1编码序列,将该序列克隆至载体pET-32a(+);转化BL21(DE3),确定最佳表达条件;采用亲和层析与超滤纯化目的 蛋白,经Western blot鉴定后免疫家兔,制备其抗体.结果 成功扩增YB-1编码序列并构建了其表达载体;SDS-PAGE结果显示,表达条件经优化后(28 ℃, 5 h, 0.5 mmol/L IPTG),YB-1融合蛋白在BL21中得到高效可溶性表达;Western blot结果证实,表达产物经纯化后获得了纯度较高的YB-1融合蛋白,将该蛋白免疫家兔后获得了效价与特异性较高的抗体.结论 成功建立了YB-1蛋白的原核表达系统及蛋白纯化方法,并制备了其抗体.     

人Tau基因多表位肽段原核表达载体的构建与表达

摘要：目的构建含人Tau多表位肽段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化目的蛋白,检测Tau多表位DNA疫苗
免疫小鼠后特异性抗体产生情况。方法以质粒pVAX1-Tau 为模板,用PCR 扩增人Tau 多表位肽段基因,插入表达载体
pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-TauP1/P2。将鉴定后的阳性重组质粒转入E.coli BL21（DE3）中,经异丙基-β-D-
硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,并采用GST法纯化、SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达。以TauP1/P2 DNA疫苗免疫小鼠获
取血清,Dot-blot检测TauP1/P2特异性抗体产生情况。结果PCR扩增出约300 bp的基因片段,克隆至表达载体后,经酶切和测
序验证正确;获得了纯化的目的蛋白,并证实了GST-TauP1/P2融合蛋白的表达。Dot-blot检测到特异性TauP1/P2抗体的产生。
结论成功构建和表达人Tau多表位肽段基因的目的蛋白GST-TauP1/P2,能够识别Tau多表位DNA疫苗免疫后小鼠产生的特
异性TauP1/P2抗体。
     

人可溶性DC-SIGN的原核表达及鉴定

目的 构建可溶性DC-SIGN(sDC-SIGN)原核表达载体,获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白.方法 采用PCR方法,从含人DC-SIGN cDNA的重组质粒pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN胞外区基因片段,插入原核表达载体pET17b,构建重组表达载体pET17b-sDC-SIGN,经酶切图谱和测序鉴定,转入E.coli BL21 (DE3)诱导表达蛋白,用抗人DC-SIGN抗体-Sepharose 4B亲和层系纯化表达产物,以SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 从重组质粒pGM-DC-SIGN扩增获得1 300 bp目的基因片段,构建重组表达质粒pET17b-sDC-SIGN,其酶切图谱和序列与预期相符.纯化表达产物sDC-SIGN,鉴定其分子质量为38 000,Western bolt证明其可与抗人DC-SIGN抗体特异性结合.结论 获得了能高效表达重组人sDC-SIGN的大肠杆菌菌株和不带任何标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的功能奠定了基础.     

BLCAP蛋白多克隆抗体制备及其免疫学特性鉴定

目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达BLCAP融合蛋白并制备和鉴定其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a(+)-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,诱导表达带有His标签的目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收后免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性和亲和性。结果:成功获得分子质量约为28 kU纯化的融合蛋白,免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP的多克隆抗体。ELISA测定显示抗体效价可达到1∶10 000。通过Western blot检测证明该抗体有较好的针对BLCAP蛋白的专一性。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性。制备的特异性和效价良好的抗BLCAP的多克隆抗体,能够满足针对BLCAP免疫印迹和细胞免疫组化检测等实验要求,为今后深入研究BLCAP蛋白性质与功能提供了有用的实验工具。     

鲍曼不动杆菌外膜蛋白CarO的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的鲍曼不动杆菌杆菌外膜蛋白Caro(-binding protein)融合蛋白并制备抗Caro多克隆抗体,为研究临床鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制奠定基础.方法 构建pET23d-CarO重组表达质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His-CarO融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western印迹检测多克隆抗体的特异性.结果 在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-CarO融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫新西兰大白兔,获得了高特异性的抗CarO抗血清.结论 成功构建pET23d-CarO原核表达质粒,表达并纯化出目标蛋白,制备出高特异性的多克隆抗体.     

BTBD10基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的 克隆和表达BTBD10基因,为进一步研究BTBD 10与胰岛细胞增殖功能提供工具.方法 制备兔抗BTBD10多克隆抗体,利用PCR方法扩增BTBD10全长,经Bam H I和Sal I酶切后连接入pET32a原核表达载体,将重组表达质粒pET32a-BTBD 10转化大肠杆菌ROSSET,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化,以纯化的BTBD10蛋白免疫新两兰大白兔,制备兔抗BTBD10的多克隆抗体,利用Western blot方法分析鉴定.结果 经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框.SDS-PAGE电泳分析显示IPTG诱导后表达约85kU的融合蛋白,与预期结果相符.将纯化的融合蛋白免疫家兔,获得兔抗BTBD10多克隆抗体血清,Western blot结果显示该抗体特异性好,效价高,目的条带位于56kU处.结论 成功构建人BTBD10原核表达载体,并获得了高纯度BTBD10重组蛋白及兔抗BTBD10多克隆抗体.     

HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定

目的研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切后插入相同酶切pET32a（＋）载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS—PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32／E7,HPV16E7-TRX融合蛋白在BL21（DE3）菌株中高效表达,在1mmol／L IPTG、30℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30％左右。结论pET32／E7原核表达质粒的构建、HPV16E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。     

小鼠白介素17受体A胞外段的表达、纯化及鉴定

目的:分别克隆小鼠白介素17受体A胞外段(mIL-17RAaa32-322)及小鼠IgG2AFc(mIgG2AFc)基因,构建mIL-17RAaa32-322-mIgG2AFc融合蛋白原核表达载体,并在体外表达、纯化及鉴定。方法:利用基因重组技术构建pET32a(+)-mIL-17RAaa32-322-mIgG2AFc原核表达载体,并在E.coli Rosetta中表达mIL-17RAaa32-322-mIgG2AFc融合蛋白,经镍离子螯合层析分离纯化后,用SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹法进行鉴定。结果:成功构建pET32a(+)-mIL-17RAaa32-322-mIgG2AFc原核表达载体,获得高效表达的融合蛋白,且蛋白质印迹证实为目的蛋白。结论:获得mIL-17RAaa32-322-mIgG2AFc融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定基础。     

M istic融合蛋白促进ω-3脂肪酸去饱和酶 Fat-1在大肠埃希菌中高效表达

目的：构建真核膜蛋白ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1基因在大肠埃希菌中的高效表达质粒。方法利用分子克隆技术构建携带Fat‐1基因的重组原核表达质粒pET32a‐Fat‐1和插入膜蛋白表达分子伴侣Mistic基因的pET32a‐Mistic‐Fat‐1;将两种重组质粒转化大肠埃希菌株BL21（DE3）,IPTG诱导表达Fat‐1蛋白和M110‐Fat‐1蛋白,通过十二烷基‐聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS‐PAGE）灰度分析其表达量,蛋白免疫印迹法（Western blot）进一步鉴定蛋白表达。结果经酶切鉴定和测序证实成功构建了pET32a‐Fat‐1和pET32a‐Mistic‐Fat‐1原核表达载体;SDS‐PAGE和Western blot证实ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1在原核表达系统中没有明显诱导表达,而M 110‐Fat‐1融合蛋白在大肠埃希菌中获得了高效表达,占全细胞蛋白总量的15％。结论ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1基因与Mistic基因融合表达,实现了在原核宿主中高效表达真核膜整合蛋白ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1。     

HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选

目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPVl6感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经BamHⅠ和HindIⅡ双酶切后插入相同酶切的pET32a（＋）载体,转染JMl09感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Wlescem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET32（＋）,E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3．1（＋）空质粒,构建pcDNA3．1（＋）m5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染,最后用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT．PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5,在1mmol／LPTG、28℃诱导条件下BL21（DE3）菌体中HPVl6E5．TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/mlG418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株,RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32／E5原核和pcDNA3．1（＋）／E5真核表达质粒,HPV16 E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达．这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。     

mFSHR基因N端片段的序列分析、原核表达载体构建及其表达

目的：克隆小鼠卵泡刺激素受体（FSHR）基因N-端部分片段（28—90aa）（mFSHRn）;预测其编码蛋白作为候选避孕疫苗的可行性;构建原核表达重组质粒,并在大肠杆菌中表达。方法：提取小鼠睾丸组织总RNA,利用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）技术反转录成cDNA,按照GeneBank中小鼠FSHRN．端序列设计引物,扩增基因片段并插入pET32a载体,测序鉴定后做生物信息学分析;质粒转化E．coli BL21（DE3）感受态菌株诱导表达蛋白。结果：扩增片段长度为186bp,测序结果与预期结果完全一致,生物信息学分析其编码蛋白具有良好的抗原性;重组原核表达质粒经鉴定获得正确重组子并诱导表达。结论：mFSHRn蛋白可作为良好的候选避孕疫苗,成功构建了pET32a—mFHSRn原核表达重组质粒,获得可表达mFHSRn的大肠杆菌菌株,为后续的相关研究奠定了基础。     

TAT-Smad7-HA融合蛋白的表达及其转导活性验证

目的构建、表达、纯化、鉴定并标记TAT-Smad7-HA融合蛋白,验证其在体外培养的人原代瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid fibroblast cell,KFB）中的转导活性。方法分别将TAT-PTD、Smad7基因和HA片段依次连接入pET32a（＋）质粒构建成pTAT-Smad7-HA重组原核表达载体,IPTG诱导表达后经亲和纯化、Western blot验证、肠激酶切割、目的片段回收和FITC标记后,将FITC-TAT-Smad7-HA融合蛋白作用于体外培养的人原代KFB以观察其转导活性。结果成功构建了TAT-Smad7-HA融合蛋白的原核表达载体pTAT-Smad7-HA,目的蛋白在诱导后获得了高效表达（占菌体总蛋白的25%以上）,并成功进行了纯化（纯度达95%以上）、脱盐柱脱盐、Western blot验证、硫氧环蛋白切除及FITC标记,得到相对分子质量约为50×103的FITC-TAT-Smad7-HA融合蛋白,并进一步在体外培养的人KFB细胞中证实了其高转导活性。结论本实验获得了高纯度的FITC-TAT-Smad7-HA融合蛋白,并验证了其在KFB中的高转导活性。     

肺炎链球菌自溶素基因的克隆、表达及蛋白纯化

 目的 克隆肺炎链球菌自溶素（LytA）基因并在大肠埃希菌中表达及蛋白纯化。方法 用PCR方法从肺炎链球菌基因组中克隆肺炎链球菌自溶素基因,然后将其插入原核表达载体pET32a（+）,构建pET32a(+) - LytA重组质粒,经IPTG诱导使该基因在大肠埃希菌BL21 (DE3)中表达,亲和层析法纯化目的蛋白,将获得的蛋白用Western blot鉴定门结果扩增出的DNA序列与GenBank中的LytA基因序列一致,成功构建了pET32a(+) - LytA重组质粒并在大肠埃希菌中高效表达,所表达的蛋白经Western blot证实为肺炎链球菌自溶素融合蛋白。结论 成功克隆了肺炎链球菌自溶素基因,并将其在大肠埃希菌中表达、纯化,为新型肺炎链球菌疫苗的研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌esat6基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTb)esat6基因原核表达载体并进行表达。方法：PCR扩增MTbeast6基因，克隆入pQE30质粒，测序正确后，再亚克隆入pET32a( )质粒，构建PQE30—ESAT6和PET32a( )—ESAT6重组体。结果：重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌后，经IPTG诱导，pQE30—ESAT6未表达目的蛋白，而PET32α( )—ESAT6表达出19kDA左右重组蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的42％，用Westermblotting证实其有良好的抗原性；经过Ni—NTA柱纯化，获得纯度为92％的重组蛋白。结论：成功构建原核表达载体pET32a( )—ESAT6，并获得重组ESAT6蛋白，为MTb重组抗原的应用奠定基础。     

婴儿利什曼原虫Pepck和Gp63优势表位的真核与原核重组载体的构建与表达

目的 选取婴儿利什曼原虫的Pepck和Gp63的优势表位基因,构建Pepck-Gp63二联优势表位的原核与真核重组表达载体并表达蛋白.方法 用计算机分析预测磷酸烯醇丙酮酸羧基酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPCK)的二级结构及HLA表位,筛选出优势表位.根据本实验室之前对表面蛋白...     

人CD81细胞外区大环原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达和纯化

目的:构建人CD81-LEL基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达. 方法:通过PCR扩增得到CD81-LEL基因编码区片段,与pMD18-T载体连接,经序列测定后,再将该扩增片段亚克隆入原核表达载体pET32a( )中.酶切鉴定正确的表达载体pET32a-CD81-LEL转化表达菌BL21(DE3)进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白. 结果:成功构建了原核表达载体pET32a-CD81-LEL;SDS-PAGE显示目的蛋白大量表达且呈可溶性状态,Western-blot显示目的蛋白正确表达,并用镍离子亲和层析法获得纯化的重组蛋白. 结论:CD81-LEL可以在大肠杆菌中表达,为进一步研究CD81与丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白E2的结合提供了有用的研究资料.