结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的高效表达及免疫原性研究

目的高效表达结核分枝杆菌6kDa早期分泌性抗原靶（6kDa early secretory antigenic target,ESAT6）和培养滤液蛋白10（culture filtrate protein 10,CFP10）的融合蛋白,通过免疫动物,获得CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,扩增cfp10-esat6融合基因,将其与表达质粒pET32a（＋）构建成重组质粒pET—cfp10-esat6。在大肠杆菌BL21（DE3）中表达带组氨酸标签的融合蛋白,经亲和层析得到纯化CFP10-ESAT6蛋白。用该蛋白免疫成年家兔,获得的抗CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体,作Western—blot和ELISA分析。结果重组质粒pET—cfp10-esat6构建成功,融合蛋白CFP10-ESAT6大量表达,多克隆抗体制备成功（1：10^4）。结论成功构建并表达了CFP10-ESAT6融合蛋白,制备了大量的CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体,为发展新型结核病疫苗和临床血清学检测奠定了实验基础。     

结核分枝杆菌重组蛋白CFP-10-ESAT-6-PPE68的表达、纯化与多克隆抗体的制备

目的构建重组质粒pET32a(+)-cfp-10-esat-6-ppe68,得到重组结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白及兔抗结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白的多克隆抗体,为下一步应用于临床结核病的检测奠定基础。方法将结核分枝杆菌cfp-10-esat-6-ppe68基因转入质粒pET32a,将经PCR、酶切、序列测定鉴定为阳性的质粒转入大肠杆菌DE3,IPTG诱导表达重组蛋白,经亲和层析法纯化重组蛋白后用凝血酶切除载体蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体并进行纯化。结果成功构建重组质粒表达体系pET32a(+)-cfp-10-esat-6-ppe68,制得去除载体蛋白的高纯度重组蛋白CFP-10-ESAT-6-PPE68,并成功得到高纯度抗结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白的抗体。结论成功表达结核重组蛋白并制得高纯度多克隆抗体。     

结核分枝杆菌CFP10和ESAT6优势肽段融合蛋白的表达及其免疫学研究

目的：构建结核分枝杆菌分泌蛋白的重组质粒及工程菌,获得纯化的CFP10-ESAT6P蛋白抗原,制备初步用于检测结核病患者的特异性抗体。方法：根据编码结核分枝杆菌基因序列设计引物,克隆表达结核CFP10-ESAT6重组蛋白,表达产物免疫新西兰大白兔,其中80％可产生高价的抗体。利用产物建立IgG间接ELISA方法鉴定其抗原性及实用性。结果：应用ELISA法,通过检测113例结核病患者、82例非结核病患者及健康献血员,CFP10-ESAT6P和对照PPD对结核病患者血清检测的敏感性分别为89．4％和79．6％,特异性分别为96．3％和93．9％。结论：高效表达纯化的CFP10-ESAT6蛋白抗原性强,可用于结核病患者抗体的检测,用于结核病的辅助诊断。     

SA/hIL-15融合蛋白的制备及生物学活性鉴定

目的 制备链亲和素(SA)/人白细胞介素-15 (hIL-15)融合蛋白SA-hIL15和hIL-15-SA,并鉴定其生物学活性.方法 构建原核表达质粒pET24a-6His-SA-hIL-15和pET32a-hIL-15-SA-6His,转化大肠杆菌BL21(DE3),用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,并对其进行复性.CCK-8检测融合蛋白PHA刺激的人外周血淋巴细胞增殖的活性,流式细胞仪分析融合蛋白对生物素化的B16.F10细胞锚定修饰率.结果 成功构建了两种重组融合蛋白的表达质粒并在大肠杆菌实现了高效表达,目标蛋白的表达约占细菌总蛋白的20%.经纯化、复性的SA/hIL-15融合蛋白具有双重活性,即:能促进PHA激活的人外周血淋巴细胞增殖的hIL-15活性,和SA介导的高效结合至表面已生物素化的B16.F10肿瘤细胞的功能(表面锚定修饰效率大于95%).SA-hIL-15双功能融合蛋白促进PHA激活的人外周血淋巴细胞增殖活性高于hIL-15-SA双功能融合蛋白.结论 SA/hIL-15双功能融合蛋白的制备为hIL-15表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研制打下了基础.     

结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达

目的 :构建结核分枝杆菌 (MTb) 1hp -esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法 :用GeneSOEing法 ,将1hp基因和esat6基因体外重组 ,构建融合基因 ,克隆入pQE30质粒中进行表达。 结果 :构建的融合基因经测序证实完全正确 ,重组体转化表达菌DH5α后 ,经过IPTG诱导 ,表达出 2 6kDa左右的CFP10 -ESAT6融合蛋白。SDS -PAGE分析显示 ,IPTG诱导 4h表达量最高 ,表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中 ,表达量占全菌蛋白质的 4 0 % ,Westernblotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni-NTA柱纯化后 ,获得了纯度为 98%的重组蛋白。结论 :成功构建MTblhp -esat6融合基因 ,成功构建原核表达载体pQE30 -CFP10 -ESAT6 ,并获得重组CFP10 -ESAT6融合蛋白 ,为MTb重组抗原的应用奠定了基础。     

结核抗原时间分辨荧光免疫分析的建立及其初步临床应用

目的建立时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)检测结核分枝杆菌特异性6000早期分泌性抗原靶(ESAT-6)和抗原培养滤液蛋白10(CFP10)的融合抗原,并对该方法诊断肺结核的性能进行评价。方法采用夹心法建立ESAT-6-CFP10的TRFIA法。并对其灵敏度、批内、批间差异和准确性等各项指标进行考核。试验组选取24例活动性、32例可疑活动性、65例非活动性结核病患者及419例非结核性肺部疾病患者;30名健康体检者作为对照组,比较TRFIA法与酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测结果。进行临床检测并与临床诊断进行一致性检验分析。结果 ESAT-6/CFP10的TRIFA法稳定性好,线性宽,其检测灵敏度为2.5 ng/mL,批内和批间变异系数分别平均为3.37%和5.23%,平均回收率为97.5%。与商业ELISA试剂盒一致性较好(Kappa=0.914,P=0.01)。TRFIA法的剂量-反应曲线拟合相关系数(R2)达0.996 1,可测范围为(2.5¹ 600)ng/mL;该方法与临床诊断有较好的一致性(Kappa=0.961,P=0.001)。结论 TRFIA法敏感度、精密度、重复性、线性相关性较好,有利于该结核抗原用于临床结核病的诊断。     

结核分枝杆菌耐药性相关膜蛋白MmpL6的表达与纯化

目的 构建结核分枝杆菌外排泵蛋白MmpL6(Rv1557)表达载体,在大肠杆菌E. coli中诱导MmpL6蛋白高表达并进行纯化.方法 以结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段,构建pET21b-MmpL6表达载体将表达载体转化至大肠杆菌中,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,并针对不同表达菌株、温度进行优化,获取最优表达条件.采用Ni-NTA亲和层析以及凝胶过滤色谱纯化目标蛋白.结果 成功构建pET21b-MmpL6重组表达质粒,经 IPTG诱导后,在Rosetta菌株中25 ℃条件下获得最高表达量.结论 成功表达并纯化了 MmpL6蛋白,为该蛋白后续的结构与功能研究奠定了基础.     

SA/hIL21双功能融合蛋白的表达、纯化及生物学活性检测

目的 制备链亲和素(SA)标记的人白细胞介素21融合蛋白(SA-hIL-21),检测其生物学活性.方法 构建hIL21-SA-pET21及pET24a-SA-hIL21质粒,利用大肠杆菌BL21(DE3)表达两种双功能融合蛋白,并利用镍金属螯合层析柱(Ni-NTA)纯化,之后透析复性,Western blotting进行鉴定,最后利用MTT法检测hIL21-SA及SA-hIL21融合蛋白与抗CD3单克隆抗体(anti-CD3)共刺激人外周血淋巴细胞的增殖活性,流式细胞仪分析两种融合蛋白对生物素化的MB49肿瘤细胞的锚定修饰效率.结果 hIL21-SA及SA-hIL21重组融合蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达,约占菌体蛋白的30%,经复性后hIL21-SA及SA-hlL21具有了双重活性,即不仅可以与抗CD3单抗共刺激淋巴细胞的增殖,而且具有了SA介导的高效结合已生物素化的MB49肿瘤细胞表面的功能(表面修饰效率95.18%,96.91%).结论 本实验成功研制了具有双重活性的hIL21-SA及SA-hlL21融合蛋白,两种融合蛋白的双功能活性无显著性差异,该项研究为SA/hIL21双功能融合蛋白应用于肿瘤疫苗以及肿瘤局部治疗奠定了基础.     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64表达纯化

目的表达并纯化结核分枝杆菌重组蛋白pET32a-MPB64。方法将构建好的表达载体pET32a-MPB64测序后,转化到大肠杆菌BL21（DE3）内。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL-21中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。结果质粒pET32a-MPB64经测序,结果与Geneback中的结核分枝杆菌标准菌株H37RV核苷酸序列基本一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以可溶性的形式表达,其分子质量约为24 kDa,蛋白表达量约占菌体总蛋白的20%;该蛋白经MagExtractor-His-tag-磁珠纯化试剂盒纯化后浓度达2.49mg·mL^-1;Western-blot结果显示融合蛋白可与抗His-Tag标签的单克隆抗体结合。结论成功得到高纯度的重组目的蛋白pET32a-MPB64,为进一步制备其单克隆抗体奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化

目的　构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT -6蛋白的重组表达质粒 ,并对其表达产物进行纯化。　方法　用PCR方法从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组中扩增出ESAT -6基因片段 ,克隆至pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序 ;用限制性内切酶消化后 ,目的片段亚克隆至表达载体pET -2 3a( ) ,构建pET -ESAT -6重组质粒 ,将其转化入大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达 ;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白。　结果　从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组DNA中扩增出ESAT -6基因片段 ,成功构建重组表达质粒pET -ESAT -6,SDS -PAGE显示表达产物分子量约为 6kD ,经亲和纯化后的ESAT -6重组蛋白纯度高 ,且能被结核病人血清所识别。　结论　利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT -6重组蛋白 ,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。     

结核杆菌特异性抗原对结核病诊断价值研究

目的从人血清提取结核杆菌早期分泌性抗原靶6、培养滤液蛋白、结核杆菌分泌蛋白38KD进行标测,探讨结核病诊断新方法。方法选择我院2007年1月～2008年1月间住院肺结核病人和健康查体者,应用结核分枝杆菌相关性抗原ESAT-6、CFP10、38KD检测试剂盒测定血清结核菌抗原水平,同时对所有入选者均行结核菌培养。结果活动性肺结核患者血清中检测到结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6、CFP10、38KD的阳性率高,与健康对照组有统计学差异（P〈0．005）;结核分枝杆菌抗原可区分结核感染和非感染,与结核菌素试验比较有显著的统计学差异（P〈0．001）。结论血清结核杆菌特异性抗原能够作为诊断结核病的依据,对鉴别活动性肺结核、非活动性肺结核、非结核病具有重要的价值。     

结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因的克隆与序列分析

目的：克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10（CFP10）基因,并对其进行序列分析。方法：自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFPIO基因设计引物。通过聚合酶链反应（PCR）技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,将其克隆至pTG19-T载体后,经PCR和双酶切鉴定后进行DNA序列测定,并以BLAST在线软件进行序列比对分析。结果：PCR产物电泳显示扩增片段约为300bp,测序获得的片段开放编码框由303bp组成,与H37Rv株CFP10基因同源性为100％,推导出编码氨基酸序列同源性为100％。结论：成功克隆结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,其基因序列与H37Rv株CFPIO基因序列无差异。     

结核分枝杆菌CFP-10蛋白的克隆及表达

目的通过构建结核分枝杆菌CFP-10蛋白表达载体,在大肠杆菌表达,为探索重组多肽在结核病血清学诊断的应用奠定前期实验基础。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出CFP-10基因片段,连接到表达载体PET30a上,在大肠杆菌中表达;组氨酸标签（His-Tag）镍柱层析纯化重组蛋白。结果构建了含CFP-10重组质粒的大肠杆菌工程菌,发现目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。结论 CFP-10蛋白基因克隆入宿主菌中并表达成功。     

分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6重组卡介苗构建研究

目的构建分泌表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗。方法采用基因拼接（Gene SOEing）法，体外扩增结核杆菌CFP10-ESAT6融合基因，插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000，构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6，用电穿孔法将pBCG3000-CFPIO-ESAT6质粒转化BCG细胞，得到重组卡介苗，热诱导表达CFPIO—ESAT6融合蛋白，SDS—PAGE电泳观察CFP10-ESAT6融合蛋白的表达，Western blot鉴定其生物活性。结果经PCR、酶切及测序鉴定，证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6，经热诱导表达出约22kDa的CFP10-ESAT6蛋白，可分别被鼠抗ESAT6血清、鼠抗CFP10血清识别。结论分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗构建成功。     

重组结核分枝杆菌CFP10的克隆与表达

目的:克隆和表达结核分枝杆菌CFP10,并分析其免疫学活性。方法:自结核分枝杆菌标准株H37Rv提取基因组DNA,PCR扩增cfp10基因,克隆至T载体pMD18T,转化入大肠杆菌JM109,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的pMD18-cfp10的cfp10基因亚克隆至表达载体PQE30,构建重组质粒PQE30-cfp10,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,PCR和双酶切鉴定阳性重组体,IPTG诱导CFP10表达,亲和层析纯化,western-blot分析其免疫活性。结果:成功构建PQE30-cfp10重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约10kDa的CFP10,并能被结核病人血清识别。结论:克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌CFP10。     

结核分枝杆菌CFP10诊断抗原基因的克隆及序列特性分析

目的扩增结核分枝杆菌培养滤液蛋白10基因（CFP10）,并将其克隆至质粒pGEMT中进行核苷酸序列特性分析,为研究结核病候选诊断抗原基因奠定基础。方法以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌CFP10抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行酶切鉴定及序列测定和生物信息学分析。结果成功扩增出结核分枝杆菌CFP10抗原基因,测序表明该片段开放阅读框由303bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为100%,推导编码氨基酸序列同源性为100%。结论成功克隆CFP10基因,经DNA测序证实,该片段阅读框完整,为其原核表达及相关研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌PstS1-U1融合抗原的表达、纯化及其免疫活性测定

目的 为获得一种适于本地结核病临床诊断用抗原,将结核分枝杆菌38×103抗原--即磷酸盐传送蛋白1(phosphate transport system protein l,PstS1)和尿蛋白1(urine protein 1,U1)进行融合表达、纯化并测定其抗原活性.方法 用基因拼接法将结核分枝杆菌编码PstS1和U1蛋白的基因拼接在一起,克隆到原核表达载体pET28a中,通过IPTG诱导实现其高效表达,采用亲和层析纯化表达产物.用纯化的融合抗原免疫家兔获得抗血清,用该血清以及活动性肺结核患者血清对纯化产物的抗原活性进行测定.结果 成功构建了原核表达质粒,对表达产物进行亲和层析纯化,获得相对分子质量为57×103的目的蛋白.经Western blot检测融合抗原能够与活动性肺结核患者血清中的抗体发生结合.结论 本研究表达并纯化出PstS1-U1融合抗原,为进一步的应用奠定基础.