经MHCⅡ通路的屋尘螨1类变应原T细胞表位融合肽疫苗载体的构建与表达

目的构建经MHCⅡ通路的屋尘螨1类变应原Der p 1的T细胞表位肽疫苗重组载体。方法分别合成TAT、IhC和含编码
Der p 1的3段T细胞表位的融合核苷酸序列,用特异性引物PCR扩增相应的基因片段,分别用相应的双酶切后,用T4 DNA连
接酶连接形成TAT-IhC-Der p 1-3T 融合基因,并插入至原核表达载体pET-28a(+ )中,构建重组原核表达载体pET-28a
(+)-TAT-IhC-Der p 1-3T,Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切和测序鉴定。重组载体转化大肠杆菌E. coli BL21（DE3）菌株,IPTG诱导
后,经SDS-PAGE电泳分析和Western blot验证,纯化TAT-IhC-Der p 1-3T蛋白后进行IgE结合试验。结果双酶切和测序结果表
明,成功构建了pET-28a-TAT-IhC-Der p 1-3T重组原核表达载体;SDS-PAGE电泳分析显示TAT-IhC-Der p 1-3T可诱导表达;
Western blot 检测表明该融合蛋白纯化成功;IgE 结合试验表明TAT-IhC-Der p 1-3T结合屋尘螨过敏病人血清IgE 的能力强于
Der p 1变应原（P<0.001）。结论成功构建了可表达经MHC通路的编码Der p 1的3段T细胞表位的重组pET-28a-TAT-IhC-Der
p 1-3T载体,纯化的TAT-IhC-Der p 1-3T具有较强的IgE结合能力,从而为后续经MHC通路的特异性免疫治疗奠定基础。
     

靶向肿瘤干细胞标记CD133特异性结合肽的筛选和初步鉴定

摘要：目的筛选可与人肿瘤干细胞表面标记物CD133特异性结合的短肽并进行初步鉴定。方法首先合成人肿瘤干细胞
表面标记物CD133 细胞外片段的生物素化蛋白,以此为靶,利用噬菌体肽库技术,高通量液相淘选CD133 的特异性短
肽。应用夹心EL ISA选择出结合较强的克隆。提取DNA测序,通过竞争性阻断实验验证其特异性,根据噬菌体基因序
列推导出多肽序列。通过免疫荧光技术初步验证合成多肽和人大肠癌细胞的结合情况。结果4 轮液相筛选后,与
CD133特异性结合的噬菌体得到有效富集,第4轮与第1轮相比,富集了388倍。经ELISA 鉴定的20个噬菌体单克隆中,
有13个与CD133有较高亲和力,具有阳性意义。经比对得到11条完全一致的氨基酸序列TISWPPR,2条完全一致的氨
基酸序列STTKLAL,竞争性阻断ELISA实验表明第一条特异性较强。结论成功利用噬菌体肽库技术,淘选出1条可和
人CD133特异性结合的高亲和力短肽,为后续CD133的研究奠定了基础,表明从噬菌体肽库中液相淘选生物素化小分子
的高亲和力多肽的方法切实可行。     

人Tau基因多表位肽段原核表达载体的构建与表达

摘要：目的构建含人Tau多表位肽段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化目的蛋白,检测Tau多表位DNA疫苗
免疫小鼠后特异性抗体产生情况。方法以质粒pVAX1-Tau 为模板,用PCR 扩增人Tau 多表位肽段基因,插入表达载体
pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-TauP1/P2。将鉴定后的阳性重组质粒转入E.coli BL21（DE3）中,经异丙基-β-D-
硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,并采用GST法纯化、SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达。以TauP1/P2 DNA疫苗免疫小鼠获
取血清,Dot-blot检测TauP1/P2特异性抗体产生情况。结果PCR扩增出约300 bp的基因片段,克隆至表达载体后,经酶切和测
序验证正确;获得了纯化的目的蛋白,并证实了GST-TauP1/P2融合蛋白的表达。Dot-blot检测到特异性TauP1/P2抗体的产生。
结论成功构建和表达人Tau多表位肽段基因的目的蛋白GST-TauP1/P2,能够识别Tau多表位DNA疫苗免疫后小鼠产生的特
异性TauP1/P2抗体。
     

IgA肾病患者血清6种常见过敏食物特异性抗体的检测

目的初步探讨6种常见过敏食物的主要过敏蛋白与IgA肾病发病的关系。方法采用ELISA双抗体夹心法检测并比较
31例IgA肾病患者及80例健康体检者血清中6种常见过敏食物的主要过敏蛋白特异性的IgA1、IgG及IgE水平,并对所有病人
进行食物过敏情况问卷调查,观察多种食物抗体水平均明显升高的患者的临床特征。结果IgA肾病组患者血清中6种常见过
敏食物的主要过敏蛋白特异性的IgA1及IgG水平均显著高于健康对照组（P<0.05）。两组中均未检测到食物特异性的IgE。所
有病人均无明确的食物过敏史。多种食物（大于4种）特异性IgG抗体水平均明显升高的患者均有蛋白尿。结论某些食物尤其
是高致敏性食物在IgA肾病的发病及进程中可能伴有重要角色。
     

HBeAg的B细胞线性表位预测及鉴定

目的预测并鉴定乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）的B细胞线性表位,为乙型肝炎的诊断和治疗提供新的依据。方法采用
生物信息学分析技术,利用NCBI数据库和免疫表位数据库提供的相应软件预测HBeAg的B细胞线性表位,采用人工合成法合
成相应表位肽并分别将与血蓝蛋白（KLH）偶联,作为免疫原,免疫大白兔制备抗HBeAg抗原表位抗体,ELISA法鉴定抗体的特
异性。结果发现了1MDIDPYKEFG10、37LYREALESPEHCSP50、74SNLEDPAS81、127RTPPAYRPPNAPIL140等4条新的HBeAg蛋白
B细胞线性表位肽,其与KLH的偶联物作为免疫原免疫大白兔,获得特异性高效价抗体,抗体滴度大于1∶512000,ELISA实验
证实上述抗体均可与HBeAg发生特异性免疫反应。结论采用生物信息学技术成功确认了4个HBeAg蛋白B细胞线性表位
肽,为深入研究HBeAg的功能和作用以及乙型肝炎的治疗提供了新依据。
     

粉尘螨过敏原Der f15的表达、纯化和生物信息学分析

目的表达纯化出粉尘螨过敏原Der f15蛋白,并预测其三维结构及B细胞抗原表位。方法利用实验室已有的Der f15质粒转化到大肠杆菌Rosetta,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过亲和层析纯化蛋白,经免疫印迹法(Western-blot)分析Der f15免疫原性,用生物信息学方法分析Der f15的三维结构及B细胞抗原表位。结果高效表达出Der f15蛋白。SDS-PAGE结果显示:表达的产物分子量约107ku。经亲和层析成功纯化蛋白,纯化蛋白以尘螨过敏患者血清为一抗进行Western-blot,结果显示:Der f15重组蛋白能与患者血清IgE发生特异性结合,而阴性对照没有反应条带出现,表明Der f15具有良好的抗原性。对B细胞抗原表位的预测表明,Der f15蛋白的第20~35、121~131、340~359及485~500是潜在B细胞抗原表位。结论粉尘螨Der f15表达、纯化和生物信息学分析研究有助于了解Der f15蛋白的分子生物学特性,为粉尘螨过敏反应性疾病的特异性诊断和疫苗治疗奠定理论基础。 更多还原     

屋尘螨Der p7基因的克隆表达、纯化及过敏原性鉴定

目的探讨屋尘螨Der p7基因的克隆表达、纯化及过敏原性分析。方法逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)扩增屋尘螨Der p7基因,经酶切、连接后转化大肠杆菌,挑取阳性单克隆菌落,扩增培养后测序鉴定正确后大量表达;采用亲和层析法纯化表达产物,免疫印迹(Western blot)法鉴定其过敏原性;生物信息学方法分析其基因的同源性。结果 RT-PCR显示Der p7基因片段大小约700 bp;大量表达后进行的SDS-PAGE电泳分析显示,Der p7蛋白表达于沉淀物中,以包涵体蛋白为主,分子质量约39 kDa。Western blot显示该重组基因所表达的蛋白可与尘螨过敏患者的血清起反应,表明该重组蛋白具有过敏原性。生物信息学分析显示克隆的Der p7基因与Der f7基因的同源性约79.14%。结论本实验成功获得大量表达及纯化后具有过敏原性的Der p7蛋白,对临床上完善对过敏性疾病的检测与治疗具有积极的意义。     

粉尘螨Der f 38的结构与免疫优势表位的生物信息学预测分析

目的：分析粉尘螨过敏原Der f 38的理化性质及结构特征，并综合生物信息学工具预测其免疫优势B、T细胞表位。方法：从世界卫生组织/国际免疫学联合会的过敏原数据库中获取Der f 38的氨基酸序列信息，利用ProtParam对Der f 38的理化性质特征进行分析。通过SWISS-MODEL、AlphaFold2及GalaxyRefine对Der f 38的三维结构模型进行综合构建、优化得到最佳的蛋白模型。利用DNAStar Protean、Bepipred 2.0、ElliPro、DiscoTop、TepiTool进行Der f 38蛋白的B细胞线性、构象型表位以及T细胞表位的综合预测。结果：Der f 38为分子量13.99kDa且等电点为9.08,总平均亲水性为-0.337,不稳定指数为31.79。通过多种生物信息学工具综合分析，共得到4个优势B细胞线性表位、8个B细胞构象表位和8个T细胞表位。结论：Der f 38属于碱性蛋白，具有一定的亲水性和稳定性，含有多个免疫优势的B细胞和T细胞抗原表位，为进一步针对该蛋白的疫苗和过敏原特异性免疫疗法的设计与开发提供理论参考。     

HCV高变区1串联模拟表位基因免疫研究

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)高变区1(HVR1)串联模拟表位基因免疫在BALB/c小鼠体内引起抗体产生的特点.方法针对中国人群HCV HVR1位中6个较保守的AA位点设计并合成多肽表位,从中筛选活性最好的肽1、5、6、7构建含4条多肽编码基因的表达载体.将HCV HVR1串联模拟表位表达载体对小鼠股四头肌直接免疫,采用ELISA法检测小鼠血清内抗体的产生,并将免疫血清与一系列基于本室对HVR1氨基酸序列的分析结果合成的多肽进行反应,分析免疫血清对这些多肽的交叉反应性.结果免疫血清同编码的各合成肽都有较好的反应性,其中对肽1反应最好.免疫血清同合成的4条HVR1全序列多肽及其他非编码HVR1多肽有较好的反应性.结论基因免疫能够在小鼠体内引起表位特异性抗体的产生.此串联表位设计引起的体液免疫反应对HCV HVR1合成肽有较好的交叉免疫反应.     

1844例变态反应性皮肤病血清过敏原特异性IgE抗体分析

目的 探讨变态反应性皮肤病血清中过敏原特异性IgE抗体及总IgE水平变化.方法 对临床确诊的1844例变态反应性皮肤病患者包括荨麻疹884例,湿疹704例,特应性皮炎256例,采用酶免疫分析法对血清过敏原特异性IgE和总IgE进行检测及分析.结果 1844例患者血清总IgE检测阳性（大于90IU/mL）1148例,占62.3%;食入组过敏原以虾蟹居首位（24.1%）,其后是鱼（19.0%）、猪牛羊肉（13.7%）、牛奶（11.2%）、蛋白蛋黄（8.6%）、大豆花生（4.0%）;吸入组过敏原粉尘螨最高（30.5%）、多价霉菌（29.8%）、蒿属植物（24.8%）、屋尘（24.2%）、榆柳杨树花粉（23.5%）、豚草（9.7%）.结论 检测变态反应性皮肤病血清中过敏原特异性IgE抗体及总IgE水平可确认过敏体质,寻找相应过敏原,为变态反应性疾病的预防和治疗提供依据.     

阿尔茨海默病Aβ人抗体可变区片段基因的克隆和表达

目的 筛选出β淀粉样蛋白40 (Aβ40)的人源抗体单链可变区片段,克隆单链抗体的基因并在原核生物大肠杆菌表达,为阿尔茨海默病的诊断和治疗开辟新的途径。方法 先将Aβ40包被在免疫反应板上,后用来自正常人外周血淋巴细胞的单链抗体文库结合。经过5轮的生物淘金法筛选,从最后一轮噬菌体感染的大肠杆菌TGl中随机挑选55个克隆进行ELISA测试,筛选出Aβ40特异的单链抗体并对其进行基因测序。将人源抗体单链可变区片段基因克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,转化大肠杆菌BL21表达谷胱甘肽-s-转移酶(GST)融合的单链抗体。结果 ELISA测试表明,55个克隆中有33个克隆能结合Aβ40,Aβ40对10个克隆的竞争抑制率达到50％以上,而其中5个克隆的抗原结合表位在Aβ40的氨基端1-16个氨基酸之间。DNA测序结果发现,Aβ40单链抗体基因由768bp组成,推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构。将单链抗体基因克隆到原核表达系统中诱导表达,得到相对分子质量为55000的GST融合抗体表达产物。结论利用非免疫途径筛选出阿尔茨海默病发病中起关键神经元毒性作用的Aβ40的人源抗体单链可变区片段,为该抗体的表达和临床应用打下了基础。     

尘螨1类变应原Derf1和Derp1生物信息学分析

目的:分析尘螨1类变应原的理化特性。方法:Gen Bank检索尘螨1类变应原Der f 1和Der p 1的氨基酸序列,利用生物信息学软件预测分析这两个氨基酸序列的一级结构、疏水性、跨膜区、二级结构及空间结构,并对其可能的功能位点进行预测。结果:尘螨1类变应原Der f 1和Der p 1分别编码321和320个氨基酸,分子量分别为36.4和36.1 ku,理论等电点(p1)分别为5.66和5.65,两蛋白均为亲水性蛋白且可能均无跨膜区,Der f 1的二级结构以不规则卷曲为主(43.93%),而Der p1的二级结构以α螺旋为主(43.75%)。两变应原均由蛋白酶抑制子I 29和木瓜蛋白酶C-端2个结构域组成,且半胱氨酸活性位点、组氨酸活性位点和天冬酰胺活性位点的位置相似。结论:Der f 1和Der p 1的这些特性有助于为螨性过敏性疾病的变应原特异性免疫治疗提供理论支持。     

Cloning, sequence analysis and expression in E. coli of the group 3 allergen of Dermatophagoides farinae

Background The dust mites, which are mostly represented by Dermatophagoides spp. （Acari： Pyroglyphidae）, are the major sources of indoor allergens. Identification and characterization of these mite allergen molecules are an important step in the development of new effective diagnostic procedures and possible therapeutic strategies for allergic disorders associated with dust mites. Methods Total RNA was extracted from Dermatophagoides farinae. The gene coding for Der f 3 was amplified by RT-PCR with the primers designed based on previous sequence published in GenBank. The target gene was cloned intermediately into pMD19-T plasmid and finally into plasmid pET28a （＋）, expressed in E. coil BL21 at the aid of the inducer isopropyI-D-thiogalactopyranoside （IPTG）. The physicochemical properties, spatial structure of the allergen were analyzed with bioinformatics software. Results The cDNA coding for group 3 allergen of Dermatophagoides farinae from China was cloned and expressed successfully. Sequencing analysis showed that there were nineteen mismatched nucleotides in five Der f3 cDNA clones in comparison with the reference （GenBank Accession No. AY283291）, which resulted in deduced amino acid sequence incompatibility in eleven residues. Bioinformatics analysis revealed that the Der f 3 pro-protein was an extracellular hydrophobic protein, consisting of 259 amino acids with a 16 amino acid signal peptide. The protein was deduced to have three chymotrypsin active sites （53-68 AA, 108-122 AA and 205-217 AA）, one N-glycosylation site, one cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site, four protein kinase C phosphorylation sites, two casein kinase II phosphorylation sites, and five N-myristoylation sites. Conclusions Der f3 is an extracellular hydrophobic protein which possesses multiple activation and phosphorylation sites. Polymorphism may exist in the Der f3 gene but this needs to be further confirmed in the future.     

桂北五步蛇金属蛋白酶原基因800bp片段的克隆和序列分析

目的：扩增桂北五步蛇金属蛋白酶原基因,并对其进行序列分析,方法：从广西桂北山区五步蛇毒腺中抽提蛇毒总RNA,采用一步法（RT－PCR和PCR在同一试管内进行）扩增金属蛋白酶原基因,对其进行电泳检测,得到3条特异的DNA条带,大小分别为1．5kb,1.3kb,和800bp,利用平端连接方法将800bp克隆至pGEM-T载体,挑选白色菌落,用酶切和PCR法对其进行鉴定,提取阳性菌落进行测序并推导编码的氨基酸序列。结果：信号肽和前肽和已报道的皖南五步蛇金属蛋白酶很相似。同源性为97．9％,但仅含有部分金属蛋白酶成熟肽的氨基酸序列。结论：推测此800bp片段为广西五步蛇金属蛋白酶原基因的一部分。     

内皮抑素30肽对SGC-7901细胞增殖活性的影响

目的研究经RGD修饰的人内皮抑素(endostatin)N-端的30肽对胃癌SGC-7901细胞增殖能力的影响。方法人工合成人内皮抑素1～30位氨基酸(30肽,25～31序列由RGIR GAD改为RGDRGD)所对应的核苷酸序列,连接到质粒pTYB2中,再转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,用WST-1试剂检测30肽对SGC-7901细胞增殖活性的影响。结果 30肽能够有效抑制SGC-7901细胞的增殖,并呈时间剂量依赖性。结论 30肽能有效抑制SGC-7901细胞的增殖,其在临床胃癌的治疗上具有潜在的应用前景。     

哺乳动物MHC I类分子α链的信号肽预测及保守性分析

目的 主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）由一紧密连锁、高度多态的基因座组成,在脊椎动物的移植排斥反应、免疫应答和免疫调控等方面发挥极其重要的作用。MHCⅠ类分子由α链和β微球蛋白以非共价键结合组成,其中α链直接参与抗原肽的呈递,显示极为丰富的多态性。本研究旨在分析哺乳动物MHCⅠ类分子α链的信号肽是否呈现出多态性,并明确其分子生物学特征。方法 利用NCBI网站收集人等8种哺乳动物编码MHCⅠ类分子α链的mRNA序列,采用信号肽在线预测软件SignalP 4.1和LipoP1.0分析α链信号肽存在的概率、长度及信号肽酶切位点;利用Mega4.1软件进行信号肽氨基酸序列比对,分析其保守性。结果 8种哺乳动物MHCⅠ类分子α链N端的前24个氨基酸均为其信号肽区,信号肽酶切位点全部属于信号肽酶Ⅰ型,且信号肽酶切位点的-3、 -1、1、2、3位置上的氨基酸非常保守,是信号肽酶识别的关键位点。氨基酸序列比对分析发现α链信号肽24个氨基酸中有13个位点的氨基酸相同,占信号肽氨基酸总数的54.17%。结论 8种哺乳动物MHCⅠ类分子α链的信号肽具有较强的保守性,这可能与信号肽指导蛋白质分选和蛋白质定位的功能相关。     

一种新的五步蛇蛇毒类凝血酶Cdna的克隆和序列分析

目的：克隆出五步蛇的类凝血酶cDNA，为研究其结构和功能的关系。并为下一步基因表达开发抗血栓药物提供依据和基础。方法：从五步蛇蛇腺中提取了总RNA，通过反转录合成第一链cDNA，经PCR扩增出五步蛇毒腺中类凝血酶TLE1的cDNA片段，并将其连接到质粒载体扩增，然后进行DNA测序。结果：成功克隆出一种新的五步蛇类凝血酶的cDNA片段。此片段全长794bp，包括编码部分的全长为777bp。推导其编码的蛋白质序列为258个氨基酸，其中包括18个氨基酸的信号肽，6个氨基权的前肽和234个氨基酸的成熟氨基酸顺序。TLE1成熟肽与其它蛇毒类凝血酶相比，蛋白质一级结构具有较高的同源性。结论：从五步蛇中成功克隆出一 种新的类凝血酶cDNA，并确定了它的DNA顺序。     

Indoor mite allergen levels, specific IgE prevalence and IgE cross-inhibition pattern among asthmatic children in Haikou, southern China

Background  Haikou locates in tropical island with unique mite propagation. The aim of this stuy is to determine mite allergens levels in Haikou, and to investigate the prevalence of mite specific IgE-sensitization and IgE cross-reactivity between house dust mites. 

Methods  Allergen and antigen concentrations against six mite species were tested by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Specific IgE concentrations and cross-inhibitions were measured with ADVIA Centaur^®.

Results  Allergen or antigen Dermatophagoides pteronyssinus (Der p 1), Blomia tropicalis (Blo t ) and Tyrophagus putrescentia (Tyr p) were detected in dust samples. Dermatophagoides farinae (Der f 1), Lepidoglyphus destructor (Lep d 2), and Acarus siro (Aca s ) were found in very few samples. Specific IgE tests showed high prevalence of sensitizations against all tested mites with high IgE levels to Der p, Der f, and Blo t. Storage mites, Blo t, Tyr p, Lep d, and Aca s, could inhibit Der p from 0 to 50%. Storage mites could inhibit Der f between 30% and 100%. Der p IgE could be inhibited by Der f with up to 90%, and vice versa. Der p could inhibit Blo t from 40% to 80%. Blo t was able to fully inhibit IgE binding to Lep d, Tyr p, and Aca s compared to partial inhibition by Der p.

Conclusions  Der p is the dominating mite and has the highest specific IgE prevalence among asthmatic children. Blo t represents an important source of storage mite sensitization and some patients may be independently sensitized to both Der p and Blo t. High prevalence of sensitization to Der f may be due to IgE-mediated cross-reactivity with Der p and Blo t.

     

内皮抑素30肽对HepG2细胞黏附、侵袭能力影响的机制研究

目的  探讨RGD修饰的人内皮抑素30肽对HepG2细胞黏附、侵袭的影响及作用机制。方法  人工合成人内皮抑素1～30位氨基酸（30肽,序列25～31由RGIRGAD改为RGDRGD）所对应的核苷酸序列,连接到质粒pTYB2中,再转化至大肠埃希菌BL21（DE3）中表达,同法合成人内皮抑素1～27位氨基酸构成的27肽作为对照。细胞黏附实验及Transwell实验分别检测30肽和27肽对HepG2细胞黏附能力和侵袭能力的影响,同时筛选与侵袭作用相关的整合素;免疫荧光检测30肽和27肽对αvβ3整合素的聚集作用,流式细胞仪检测30肽和27肽对HepG2细胞表面相应整合素表达的影响;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot检测30肽和27肽对HepG2细胞TIMP1和TIMP2 mRNA和蛋白质表达量的影响。结果  30肽能明显抑制HepG2细胞黏附、侵袭,对侵袭作用的影响与整合素αvβ3相关,同时,30肽能上调HepG2细胞中TIMP1和TIMP2 mRNA及蛋白质的表达,30肽加αvβ3抗体后,上述作用明显增强。结论  30肽可能是通过整合素αvβ3发挥其抗肿瘤侵袭转移作用,可以成为临床上肝癌的辅助化疗药物发挥作用。