阻断ICOS分子对小鼠移植胰岛功能的影响

目的:拟观察小鼠同种异体胰岛移植排斥反应中,可诱导共刺激分子(Inducible costimulator,ICOS)的表达情况及阻断其对排斥反应的影响。方法:供体为BALB/C小鼠,受体为C57BL/6。随机分成4组,每组10只。对照组:单纯胰岛移植,不给ICOSmAb处组;实验1、2、3组:分别于移植后1、3、5d腹腔内注射ICOSmAb50、100、200?g/kg。术后观察小鼠的血糖变化和移植胰岛组织病理学改变;采用微量全血3H-胸腺嘧啶掺入法检测单个核细胞在刀豆蛋白A刺激下的增值程度;流式细胞仪检测外周血T细胞亚群及ICOS在CD4+细胞/CD8+细胞表面的表达情况。结果:实验2组小鼠血糖维持正常时间和实验3组相同,差异无统计学意义,而与对照组和实验1组相比,差异有统计学意义;术后7d,对照组和实验1组单个核细胞在刀豆蛋白刺激下的增值程度明显强于实验2组和实验3组,差异有统计学意义;术后7d,对照组和实验1组ICOS分子表达上调明显,并且以CD4+细胞表面表达为主,与实验2组和实验3组相比,差异有统计学意义;术后7d,实验2组和实验3组小鼠肾被膜下胰岛素免疫组化染色强度均高于实验1组和对照组。结论:ICOS分子在小鼠同种异体胰岛移植排斥反应中表达上调,以CD4+细胞为主;ICOS单克隆抗体(ICOSmAb)通过阻断ICOS共刺激信号途径,可明显减轻小鼠胰岛移植后排斥反应的发生,显著延长移植胰岛有功能存活时间;ICOSmAb的最佳给药剂量为100μg/kg。     

抗ICOS单抗与小剂量环孢素A联用对大鼠心脏移植慢性排斥反应的影响

目的：探讨抗可诱导共刺激分子（inducible costimilator,ICOS）单克隆抗体与小剂量环孢素A（cyclosporine,CsA）联用对同种异基因大鼠心脏移植后移植物生存质量和慢性排斥反应的影响。方法：建立大鼠腹腔异位心脏移植模型,术后随机分为同基因移植对照组和同种异基因移植试验组,其中试验组根据术后处理不同又分为安慰剂组、常规剂量CsA组、抗-ICOS-单抗组、小剂量CsA组和抗-ICOS-单抗联合小剂量CsA组,观察各组大鼠移植心脏的存活时间及移植心组织病理学变化,对移植心长期存活（〉100d）的受体,应用流式细胞仪检测其外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞。结果：单独使用不同剂量CsA者移植心脏的存活时间较安慰剂组明显延长（P〈0.05）;抗-ICOS-单抗联用小剂量CsA组移植心脏的存活时间较单用小剂量CsA组明显延长（P〈0.05）;与安慰剂组相比,单用抗-ICOS-单抗组移植心脏存活时间差异无统计学意义（P〉0.05）。移植心长期存活受体中,与常规剂量CsA组比较,联合治疗组移植心慢性排斥损伤明显减轻,而外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞比例有显著升高（P〈0.05）。结论：抗ICOS单抗加小剂量CsA联合免疫治疗,可有效延长大鼠移植心存活时间和减轻慢性排斥反应,CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的高水平表达与诱导移植耐受、抑制慢性排斥反应有重要关联。     

共刺激通路与同种异体器官移植免疫耐受

近年来人们发现,在实验动物模型中应用单克隆抗体或融合蛋白联合阻断或激活共刺激分子通路,诱导免疫耐受的效果常常比单独应用的效果好,可使同种异体移植受体的存活时间大大延长。该通路包括     

B7特异性RNA干扰对皮肤移植的影响

目的探讨RNA干扰技术阻断B7／CD28共刺激信号对小鼠异体皮肤移植排斥反应的影响。方法设计并合成B7特异性siRNA,在脂质体的介导下转染树突状细胞,转染后72h收集细胞,用蛋白印迹法检测B7-1、B7-2蛋白的表达。在小鼠异体皮肤移植前7d,经静脉将转染B7特异性siRNA的DC输入小鼠体内（DC转染组）,同时设立同种异体移植对照组、同系移植对照组、环孢素A（CsA）治疗组（术后每日皮下注射CsA5mg／kg）和未转染DC组（移植前输注未转染DC）,观察各组移植皮瓣的存活时间和排斥反应情况,并用MTT法检测混合淋巴细胞增殖反应,术后1个月观察迟发性超敏反应情况。结果Western Blot结果显示转染72h后,siRNA1对B7-1蛋白表达的抑制率为（77.2±6.26）％;siRNA2对B7-2蛋白表达的抑制率为（73.3±5.42）％。与同种异体移植对照组和未转染DC组比较,DC转染组移植皮瓣成活时间明显延长（P〈0.01）,组织排斥反应程度较轻,混合淋巴细胞反应和DTH反应显著降低（P〈0.01）。结论聊特异性siRNA可明显抑制树突细胞B7基因的表达,以阻断B7／CD28共刺激通路,抑制小鼠皮肤移植排斥反应,为进一步研究siRNA诱导免疫耐受提供了新方法。     

M2型巨噬细胞在糖尿病小鼠同种异体胰岛移植中的抗排斥作用

目的：探讨腹膜腔来源的M2型巨噬细胞对糖尿病小鼠同种异体胰岛移植的抗排斥作用。方法：体外分 离诱导C57BL/6小鼠腹膜腔M2型和M0型细胞,流式细胞术鉴定巨噬细胞表型。链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导 C57BL/6雄性小鼠的糖尿病模型作为受体,分离BALB/c小鼠胰岛细胞移植于C57BL/6糖尿病小鼠左肾包膜下。将移植 后糖尿病小鼠随机分为3组,每组8只。于胰岛移植术后1,3,7 d分别经尾静脉输注PBS(islet+PBS组)、2.5×106个M0型 巨噬细胞(islet+M0组),2.5×106个M2型巨噬细胞(islet+M2组)。移植术后取尾静脉血监测受体血糖水平的变化,记录 胰岛存活时间,并于移植后10 d每组随机抽取2只小鼠处死取左肾做病理学检查,观察移植物形态结构和胰岛素表达 水平。结果：Islet+PBS组、islet+M0组和islet+M2组移植物的中位存活时间分别为6.5(4~10),7.5(4~10)和24(>15) d;与 islet+PBS组和islet+M0组比较,islet+M2组移植物调节血糖正常水平时间和中位存活时间明显延长(P<0.01)。病理学检 查结果显示islet+M2组胰岛移植10 d后移植物结构完整,胰岛素染色阳性;而islet+PBS组和islet+M0组胰岛移植物均被 排斥,胰岛素染色阴性,局部见大量淋巴细胞浸润。结论：腹膜腔来源的M2型巨噬细胞能减轻受体对胰岛移植物的 免疫排斥反应,延长胰岛移植物的存活时间,从而提高受体对血糖的耐受能力。     

CD40-CD40L和CD28-B7共刺激信号在同种异体角膜移植免疫排斥反应中的研究进展

角膜移植在器官移植手术中的成功率很高，而术后免疫排斥反应是导致移植失败的主要因素之一。目前已知角膜移植后免疫排斥反应的主要原因是T淋巴细胞介导的免疫排斥反应，而T淋巴细胞的激活是共刺激信号协同作用的结果。CD40．CD40L和CD28-B7共刺激信号在同种异体角膜移植免疫排斥中具有重要意义，而且两者具有协同作用，同时阻断这两个信号比单独阻断任一信号可延长移植物的存活时间。该文对CD40-CD40L和CD28-B7的生物学特性、免疫学功能以及两者的关系进行综述。     

Th17细胞在胰岛移植中的作用

目的 研究Th17细胞在胰岛移植免疫排斥反应中的作用,探讨IL-23R抗体联合应用Anti-CD154mAb诱导胰岛移植免疫耐受的可行性.方法 体外实验分为5组:空白对照组,SD大鼠胰岛细胞单独培养;A组,大鼠胰岛细胞混合淋巴细胞培养,不加IL-23R抗体;B、C、D组,将大鼠胰岛细胞混合淋巴细胞培养,分别加IL-23R抗体0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL.作细胞甩片后,行丫啶橙(AO)/碘化丙啶(PI)荧光染色、胰岛素和胰高血糖索免疫组化染色、胰岛素刺激实验.体内实验(将分离纯化的胰岛移植于小鼠左肾包膜下)分成4组:对照组,胰岛移植后不予任何干预;IL-23R抗体(200 μg)治疗组;Anti-CD154mAb(200 μg)治疗组;联合治疗组.监测移植后小鼠血糖,取移植肾作HE染色及胰岛素、胰高血糖素免疫组化染色.结果 共培养3 d后,在胰岛素刺激实验中,空白对照组的葡萄糖刺激指数为3.66±0.10,与A、B、C、D组相比升高(P＜0.05).D组刺激指数高于其他各组,达到1.95±0.75.胰岛素和胰高血糖素免疫组化染色,体外和体内实验显示各实验组移植物有功能存活明显好于对照组.移植3 d后,对照组血糖与各实验组相比升高(P＜0.05),各实验组血糖比较无明显差异.结论 Th17细胞参与了胰岛移植的免疫排斥反应.通过阻断IL-23R能有效的下调IL-17的表达,阻断效果呈剂量依赖性.Anti-CDl54mAb和IL-23R抗体联合应用能在一定程度上防止胰岛移植物的急性排斥反应,但与单独使用Anti-CD154mAb治疗相比无明显差异.     

Cy7.SE标记ICOS-Ab荧光示踪技术评估小鼠心脏移植术后急性排斥反应

目的 探讨以T细胞活化表达的可诱导共刺激分子(inducible co-stimulatory molecule, ICOS)为基础的荧光示踪技术无创诊断小鼠心脏移植后急性排斥反应的可行性。方法 以小鼠颈部异位心脏移植为模型,分为同系移植、同种移植、同种移植+他克莫司(tacrolimus,FK506)治疗(同种移植治疗组)及同种移植治疗后停药组,分别在移植术后1、3、5、7 d,采用荧光染料Cy7.SE标记抗小鼠ICOS抗体(Cy7.SE-ICOS-Ab)经尾静脉注入移植小鼠,用荧光实时显像仪观察移植物荧光图像变化;同时用流式细胞仪检测各组小鼠脾脏T细胞表面ICOS表达,H-E染色分析心脏移植物病理改变。结果 同系移植及同种移植治疗组小鼠移植术后各时间点基本不显影;同种移植术后1 d,移植物荧光图像无明显变化,但术后3、5、7 d荧光逐渐增强,术后7 d时荧光强度最明显;同种移植治疗后停药组停药3 d移植物荧光强度逐渐增强,停药5、7 d后强度明显增强。H-E染色表明:各时间点同系移植及同种移植治疗组小鼠心脏移植物无明显排斥反应;同种移植及同种移植治疗后停药组在术后(或停药后)1 d移植物无明显排斥反应,术后3、5、7 d排斥反应逐渐出现并加重。流式细胞仪检测显示:术后1 d,各组脾脏T细胞表达ICOS水平无明显差异;同系移植及同种移植治疗组在各时间点基本不表达ICOS,但同种移植及同种移植治疗后停药组在术后(或停药后)3、5、7 d ICOS表达逐渐增加(P<0.05)。结论 ICOS表达强度与心脏移植后排斥反应强度有关,荧光标记的ICOS抗体可能有助于无创评估移植术后急性排斥反应的发生及程度。     

供体骨髓来源的未成熟树突状细胞抑制小鼠同种异体牙移植后排斥反应的效果研究

目的:研究供体小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(Immature dendritic cell, imDC)对小鼠同种异体牙移植后排斥反应的抑制效果.方法:运用50 U/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)诱导出小鼠骨髓来源imDC,流式细胞术鉴定细胞表型,并于同种异体牙移植前1周以2×106个/只回输入受者体内,组织病理切片观察imDC对小鼠同种异体牙移植后排斥反应的抑制效果.结果:imDC回输组与未回输imDC的同种异体牙移植组相比,淋巴细胞浸润减少、炎症反应减轻.结论:imDC可以减轻同种异体牙移植后的排斥反应.     

同种异体肢体移植特异性免疫耐受诱导方案的研究

目的探讨联合应用亚致死量放射线照射、氟达拉滨及骨髓腔内骨髓移植对诱导大鼠同种异体肢体移植产生特异性免疫耐受的影响。方法以纯系SD大鼠及Wistar大鼠为供受体，行同种异体右后肢移植。40只大鼠肢体移植后随机分为4组：A组：仅进行肢体移植；B组：在肢体移植前1d，受体给予亚致死量^60Co照射及腹腔内注射氟达拉滨；C组：肢体移植当天受体接受供体骨髓腔内骨髓移植；D组：受体联合应用亚致死量照射、注射氟达拉滨及骨髓腔内骨髓移植，用法及用量同B、C组。观察移植物排斥反应征象及存活情况，并对D组产生免疫耐受大鼠进行SD大鼠及DA大鼠皮肤移植以及脾细胞中细胞因子mRNA检测。结果与其他实验组相比，D组移植物发生排斥反应的时间及存活时间均显著延长（P〈0．01）（〉120d）；D组大鼠仅对第3方DA大鼠的皮肤呈现强烈的免疫反应；与A组大鼠相比，D组大鼠Thl型细胞因子的表达明显降低，而Th2型细胞因子的表达明显增高。结论联合方案可以诱导大鼠同种异体肢体移植产生特异性免疫耐受。     

人可诱导共刺激分子胞外片段和小鼠免疫球蛋白Ig融合基因的表达及生物学活性鉴定

目的:探讨用基因工程方法表达的人可诱导共刺激分子(ICOS)与小鼠免疫球蛋白的融合蛋白竞争抑制ICOSB7RP1共剌激通路的作用.方法:以RT-PCR方法克隆编码人ICOS胞外片段,与编码小鼠免疫球蛋白IgG恒定片段(Ig)的基因融合,构建携带融合基因的高效真核表达载体pcDNA4/HisMAX A-ICOS-Ig.采用脂质体法转染CHO细胞,用Western 印迹法检测稳定表达细胞中融合基因的表达,流式细胞术检测重组蛋白的配体结合活性.以适当浓度的重组融合蛋白作为拮抗剂与BALB/c和C57BL小鼠脾单个核细胞进行混合培养,观察重组蛋白在体外抑制淋巴细胞增殖的效果.结果:构建了携带融合基因的高效真核表达载体pcDNA4/HisMAX A-ICOS-Ig;Western印迹法检测表明转染细胞有重组蛋白的表达;流式细胞术分析显示重组蛋白有配体表达细胞的结合活性;该重组融合蛋白作为拮抗剂可体外抑制混合淋巴细胞增殖.结论:构建并成功表达了ICOS-Ig融合基因高效真核表达载体;该重组蛋白具有配体结合活性,可在体外通过抑制ICOS-B7RP1共刺激通路抑制淋巴细胞增殖.     

人源重组ICOSIg对鼠不成熟树突状细胞的生物学作用

目的分析人源可诱导共刺激分子(ICOS)可溶性融合蛋白(ICOSIg)与鼠源不成熟树突状细胞(DCs)是否发生特异性结合及其一般生物学特性。方法通过流式细胞术结合特异性抗体检测了解ICOSIg与不成熟DCs的结合作用;以AnnexinⅤ/PI双染色、活细胞染料CSFE和CCK-8研究ICOSIg对DCs的细胞毒性作用;以[3 H]掺入法研究ICOSIg对于混合淋巴细胞反应的阻断作用。结果 ICOSIg可结合小鼠DCs表面的ICOSL,ICOSIg不引起DCs早期和晚期凋亡,不影响DCs细胞的增殖,可以抑制不同基因小鼠脾细胞的混合淋巴细胞反应。结论本实验室构建的体外表达的ICOSIg具有较强的生物学活性,对鼠DCs无明显的生物学毒性作用,首次从实验角度证实人源ICOSIg可以特异性结合小鼠不成熟DCs表面配体ICOSL,可以用于进一步探讨ICOSL/ICOS共刺激通路的免疫作用。     

B7-1共刺激分子表达对Lewis肺癌肿瘤增殖和凋亡的影响

目的了解共刺激分子B7 1的表达水平对Lewis肺癌增殖和凋亡的影响。方法 18只Lewis肺癌小鼠分为对照组、空载体组和B7 1组。治疗 2周后 ,检测肿瘤组织中B7 1分子的表达率、凋亡指数 (AI)和外周血、脾中的CD8+ 细胞的百分比。结果对照组肿瘤细胞的B7 1的表达率为 (8.8± 0 .9) % ,空载体组的表达率为 (8.4± 0 .8) % ,两组表达水平相近 (P >0 .0 5 ) ;B7 1组的表达率为 (4 6 .6± 5 .7) % ,同时其凋亡指数为 (5 .3± 1.0 ) % ,均较对照组高 (P <0 .0 5 )。B7 1组外周血和脾脏中CD8+ 细胞的百分比分别为 (15 .4± 3.2 ) %和 (4 1.8± 2 1.8) % ,均较对照组和空载体组高 (P <0 .0 5 ) ,第 8、14d的抑瘤率分别为 34.6 %、87.0 %。结论提高肿瘤细胞表面共刺激分子的表达 ,有助于增加肿瘤的免疫原性 ,引起凋亡 ,从而抑制肿瘤生长     

B7-CD28机制在嗜酸性粒细胞呈递抗原过程中的作用

目的：探讨B7-CD28协同刺激信号通路对嗜酸性粒细胞(EOS)在体内和体外呈递抗原能力的影响。方法：以鸡卵清蛋白(OVA)致敏和雾化吸入刺激BALB／c小鼠以诱发EOS在气道聚集。将分离纯化的气道EOS和致敏T细胞在体外共同培养,观察在有(无)抗B7-1单克隆抗体(单抗)或(和)抗B7-2单抗存在条件下T细胞增殖反应的变化;同时,将EOS注入致敏小鼠的气道,然后收集气管旁淋巴结细胞,观察EOS在体内呈递抗原和T细胞增殖反应之间的关系。在部分实验中,小鼠接受抗B7-1单克隆抗体(单抗)或(和)抗B7-2单抗静脉注射。结果：EOS无论在体内还是在体外均具有将所摄取的抗原呈递给致敏T细胞的能力．抗B7-1和抗B7-2单抗明显抑制由于EOS抗原呈递所引发的T细胞增殖反应。结论：EOS必须提供协同刺激信号才可作为抗原呈递细胞将抗原信息传递给T细胞,B7-CD28是主要的协同刺激信号通路。     

携带可诱导共刺激分子基因的重组腺病毒载体构建及其在小鼠间充质干细胞中的表达

目的阻断可诱导共刺激途径协同骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可能能增强急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD)的防治作用。文中旨在构建携带小鼠可诱导共刺激分子(inducible costimula-tor,ICOS)基因的重组腺病毒载体,转染小鼠骨髓MSCs,为转基因治疗提供实验基础。方法设计含有EcoRⅠ、SalⅠ酶切位点的引物,PCR扩增ICOS,将扩增产物克隆到穿梭质粒PDC318上,筛选阳性克隆,测序鉴定正确,将其与含有5型腺病毒右臂的质粒pPE3-F11B-EGFP在293细胞中同源重组,筛选获得含有ICOS基因的重组腺病毒质粒,行PCR鉴定。重组腺病毒质粒转染293细胞,扩增后用氯化铯密度梯度离心纯化病毒,用50%组织培养感染剂量法测定病毒滴度,并转染小鼠MSCs。结果重组腺病毒质粒经鉴定,证实含有ICOS基因,病毒滴度为6.54×109pfu/ml。转染小鼠MSCs,荧光显微镜下可见较多绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪检测ICOS表达率为90.16%。结论成功构建了携带小鼠ICOS基因的重组腺病毒载体,并获得高滴度的病毒,能高效转染小鼠MSCs,为后续研究奠定了基础。     

5-脂氧合酶诱导表达系统的建立

为建立5－脂氧合酶（5LO）诱导表达系统，深入研究5LO功能、信号转导机制及药物筛选，采用PCR扩增含HindⅢ酶切位点的2kb长的5LO cDNA基因片段并将其克隆入质粒pBI-G中构建重组表达载体pBI-5LO。pBI-5LO/pTK-Hyg共转染Tet-HeLa细胞。多西环素与转染细胞孵育48h诱导目的基因表达。对构建的重组载体pBI-5LO进行序列测定，证实克隆的目的基因片段是5LO基因片段，且阅读框架正确。X－gal染色证实多西环素能诱导目的的基因表达，阳性细胞的细胞核被染为蓝色。提示5LO诱导表达系统建立成功，证实其在细胞模型上系统工作。     

iNOS在16例肺癌中的表达及其临床意义

目的 探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在肺癌中的表达及其临床意义.方法 应用免疫组织化学方法对16例肺癌组织标本中iNOS的表达进行检测.结果 iNOS在肺癌中的阳性表达与癌症部分生物学特性有相关性(P<0.05).iNOS在肺癌组织中阳性表达率为62.5%,在肺腺癌组织中的阳性表达率为75%,在肺鳞癌组织中的显著表...     

低氧诱导因子-1α及诱导型一氧化氮合酶在炎症性肠病中的表达

目的:探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在炎症性肠病(IBD)中的表达及作用. 方法:取经过临床表现、内镜、病理、影像学等方法共同确诊的IBD活检的石蜡标本,用免疫组织化学方法检测HIF-1α和iNOS蛋白表达情况. 结果:在47例溃疡性结肠炎(UC)、13例克隆病(CD)和10例正常结肠黏膜组织中,HIF-1α蛋白的细胞表达阳性率中位数分别为54%,59%和1%,前两者分别与后者比较有显著性差别(P<0.01),而前两者之间比较无显著性差别(P>0.05);iNOS蛋白的细胞表达阳性率中位数分别为58%,54%和2%,前两者分别与后者比较有显著性差别(P<0.01),而前两者之间比较无显著性差别(P>0.05);HIF-1α和iNOS蛋白水平呈正相关(溃疡性结肠炎:r=0.627;克隆病:r=0.610)(P<0.05). 结论:HIF-1α和iNOS蛋白均参与了IBD的发病,HIF-1α可能是iNOS基因表达中的一个重要调节者.     

原位杂交法检测卵巢上皮癌中诱导型一氧化氮合酶mRNA

目的 :研究卵巢上皮性癌诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)的转录水平。方法 :原位杂交法检测 71例卵巢上皮性癌 ,13例卵巢良性肿瘤及 11例正常卵巢组织中iNOSmRNA表达水平。结果 :卵巢上皮性癌中iNOSmRNA高于正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤 ,P<0 .0 5。但卵巢上皮性癌Ⅲ ,Ⅳ期与Ⅰ ,Ⅱ期比较无显著差异 ,P>0 .0 5。分化程度比较 ,中、低分化组明显高于高分化组 ,但中、低分化组织间差异无显著性。结论 :诱导型一氧化氮合酶转录水平的升高 ,是引起诱导型一氧化氮合酶水平升高的主要原因 ,在卵巢上皮性癌发生、发展中发挥一定作用