不同镁离子浓度对TTV核酸检测的影响

目的:确定输血传播病毒TTV核酸检测方法中的最佳镁离子浓度.方法:根据TTV ORF2区基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针.结果:在确定最佳引物浓度之后,分别建立不同镁离子浓度的PCR检测体系,根据反应曲线选择最佳镁离子浓度.结论:最佳镁离子浓度应为4.0 mmol/L.     

荧光定量PCR检测细胞代谢综合征相关基因表达的优化

目的优化MRSG mRNA表达的Taqman荧光定量PCR检测反应体系并进行系统评价。方法设计荧光PCR适用的引物和探针,从模板、引物、探针、镁离子浓度等方面优化荧光定量PCR检测反应体系,评价优化系统的特异性和稳定性。结果确定系统的模板取样量为2μl,引物浓度为0.4μmol/L,探针浓度为0.2μmol/L,Mg~（2＋）浓度为4mM,建立了稳定的MRSG mRNA表达的Taqman荧光PCR检测方法。结论优化后的MRSG mRNA荧光PCR检测方法特异性和稳定性较好。     

啮齿动物螺杆菌多重PCR检测方法的建立

目的建立一种可同时检测肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌的多重PCR方法。方法根据已公布的肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌16SrRNA基因序列设计三对特异性引物进行多重PCR并对反应条件进行优化。结果三对引物能分别扩增出特异性的417 bp、364 bp、324 bp目的条带。最佳退火温度为52℃,镁离子浓度为2.0mmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,引物浓度为0.625μmol/L。在此条件下多重PCR同时检测的肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌敏感度均为10 fg。结论本实验建立的多重PCR是一种敏感、特异、高效的方法,为同时检测啮齿动物中肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌奠定了良好的基础。     

PCR技术反应体系镁离子浓度的优化

成功的体外DNA扩增,镁离子浓度的优化是十分重要的。镁离子浓度可以影响到Taq DNA聚合酶的活性、精度及产物的特异性,还可影响模板与PCR产物的解链温度,引物二聚体的形成等,镁离子在PCR技术反应体系中的优化最终要求模板DNA、引物和dNTP能够满足Taq DNA聚合酶结合的镁离子。     

心脏不停跳心内直视术围术期血浆镁离子的变化及意义

目的:探讨心脏不停跳心内直视术围术期血浆镁离子的变化及意义.方法:检测转机前,转机30min,停机,术后4、24、48h血浆中镁离子的浓度.结果:转机后血浆镁离子浓度增高,转机30min达最高值,术后血浆镁离子高于转机前.结论:心脏不停跳心内直视术围术期血浆镁离子明显增高,血浆镁离子的改变在心脏手术中具有重要意义.     

人细小病毒B19实验诊断技术研究

目的建立一种快速、准确、特异和定量检测人细小病毒B19的实验检测方法。方法以B19病毒NS1基因为靶序列,设计并合成引物和Taqman探针,优化引物与探针比例,调整镁离子浓度,建立对细小病毒B19进行荧光定量检测的实验方法。同时利用荧光定量PCR技术检测本院收集的490例孕妇血清。结果引物与Taqman探针比例为1∶4,镁离子浓度为2.5mmol/L时,反应的本底最低,荧光信号最强。该方法的灵敏度为1.0×101拷贝,有较好的特异性和重复性。检测的490例临床孕妇血清标本,人细小病毒B19DNA阳性为44例,感染率为8.9%(44/490)。结论使用Taqman探针技术的荧光定量聚合酶链反应,能够准确快速定量检测血清中的人细小病毒B19。     

PCR-RFLP法检测葡萄糖激酶基因启动子-30位点变异的实验条件研究

目的：确定PCR扩增葡萄糖激酶基因启动子区以及用Alw21I内切酶切割-30位点的最佳实验条件。方法：对影响PCR反应以及酶切的实验因素进行系统研究。结果：最佳引物浓度为0．3μmol／L；以1 U酶量效果最满意；最适dNTP浓度为167μ mol／L；最适镁离子浓度为1．5mmol／L。20μL的酶切体系中，最佳酶切产物为5μL，最佳内切酶量为5 U，酶切时间应超过9h。以上参数偏离最适条件将会导致实验失败。     

全自动生化分析仪镁离子测定干扰去除方法

大多数实验室都采用二甲苯胺蓝比色法检测血清镁离子的浓度.其具体原理为在碱性条件下,镁离子与二甲苯胺蓝形成蓝色复合物,于500nm波长处有吸收峰,根据一定范围内吸光度计算镁离子的浓度.本实验室近期镁离子测定中,空白值明显偏高,质控及标本都显示高值或大于最大测定范围,甚至低值质控测定值高于高值质控测定值.根据这一情况,本实验室设定一系列试验以去除镁离子测定的干扰.……     

心脏不停跳心内直视术围术期血浆镁离子的变化及意义

目的：探讨心脏不停跳心内直视术围术期血浆镁离子的变化及意义。方法：检测转机前，转机30min，停机，术后4、24、48h血浆中镁离子的浓度。结果：转机后血浆镁离子浓度增高，转机30min达最高值，术后血浆镁离子高于转机前。结论：心脏不停跳心内直视术围术期血浆镁离子明显增高，血浆镁离子的改变在心脏手术中具有重要意义。     

面肩肱型肌营养不良实时荧光定量PCR诊断方法的影响因素分析

目的分析探讨面肩肱型肌营养不良（FSHD）实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）诊断方法的影响因素。方法通过改变镁离子终浓度、PCR扩增中退火温度、退火时间或延伸时间、RNaseH酶用量和活性等,确定FQ-PCR诊断FSHD的最佳反应条件。结果退火温度55℃、时间20s、镁离子终浓度5．OmM、RNaseH酶用量IOOU、RNaseH酶在95℃下灭活8min为最佳反应条件,其中RNaseH的活性选择对FSHD诊断的特异性影响较大。结论通过降低RNaseH酶的活性可提高诊断的特异性,最终确立了FSHD的FQ-PCR基因诊断最佳反应条件。     

荧光定量PCR检测TTV方法学建立及临床应用

目的　建立一种灵敏度高、特异性好、操作简便的荧光实时定量PCR技术。方法　设计针对TT型肝炎病毒(TTV)基因保守序列非转录区的一对引物和一条荧光基团双标记探针。将PCR扩增所得的产物片段克隆 ,作为定量检测的标准品。对 36例丙肝患者及 12 3例不同血清标志物阳性的乙肝患者、16 6例健康体检者血清中TTVDNA定量检测 ,评估TTVDNA在不同人群中检出阳性率的差异显著性。结果　该方法检测TTVDNA的灵敏度高于普通套式PCR ELISA方法 ,线性范围为 10 2～ 7拷贝 /ml;批间CV为 13.2 %～ 16 .0 % ,批内CV为 6 .5 %～ 11.3%。健康体检者、丙肝患者、乙肝患者三组人群阳性检出率无显著性差异 ;且乙肝患者 (TTVDNA )血清ALT水平与TTVDNA载量无显著相关性 (P >0 .0 5 ) ;乙肝患者血清ALT异常与正常两组TTVDNA阳性检出率无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　该方法操作简单、灵敏度高、特异性好、结果数据化 ,适合于临床实验室进行临床标本的TTVDNA定量检测。     

血液透析患者中TT病毒感染的检测及序列分析

目的：研究血液透析患中TT病毒（TTV）的感染状况及其致病性。方法：针对病毒基因保守区设计引物,采用套式PCR方法对69例血液透析患血清标本进行TTVDFNA检测及序列分析。并同时检测患血清丙氨酸转氨酶（ALT）及丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）。结果：患血清TTVDNA总阳性率为27.5%。对其中1例PCR扩增产物测序。结果与其他TVV分离株如GH1、TA278、TTVCHN1和TTVCHN2的核苷酸序列同源性为89%-100%,推测的氨基酸序列同源性为87%-100%。抗-HCV阳性与阴性患的TTV DNA阳性率无明显差异。所有患均未见ALT明显升高。结论：血液透析患存在较严重的TTV感染与HCV感染无明显相关性。未发现TTV感染导致ALT明显升高的证据。     

输血传播病毒在原发性肝癌患者中的感染状况研究

目的 了解新型肝炎病毒输血传播病毒（ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｖｉｒｕｓ，ＴＴＶ）在原发性肝癌（ＰＬＣ）患者中的感染状况。方法 在ＴＴＶ长的ＯＲＦ保守区设计引物，建立巢式聚合酴链反应（ＰＣＲ）技术，检测了１５１例原发性肝癌患者血清中ＴＴＶ ＤＮＡ。结果 １５１例原发性肝癌患者中有２８例ＴＴＶ ＤＮＡ阳性，阳性率为１８．５％；而同时检测１２５例正常人血清只３例ＴＴＶ阳性，阳性率     

O1群和O139群霍乱弧菌荧光PCR快速检测方法的建立

目的建立检测O1群和O139群霍乱弧菌的实时荧光聚合酶链反应（荧光PCR）方法,并进行优化和评价。方法根据O1群和O139群霍乱孤菌O抗原编码基因设计探针和引物,建立同时检测霍乱孤菌O1群和O139群的荧光PCR方法,并对体系中的引物、Mg^2＋、dNTP和Taq酶进行优化,然后对建立的方法进行特异性、灵敏性、重复性的评价,并进行224份河口水样本的检测。结果建立了检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重荧光PCR方法。对非O1群和O139群霍乱孤菌无扩增反应,敏感度比常规分离培养高。结论以O抗原编码基因为目标检测片段建立了O1群和O139群霍乱孤菌双重荧光PCR检测方法,可用于疑似霍乱弧菌感染的样本常规分离前的快速筛查。     

部分人群中输血传播病毒的检测

目的　了解部分人群是否有输血传播病毒 (TTV ,TransfusionTransmittedVirus)感染。方法　利用半套式PCR方法对慢性乙肝患者、慢性丙肝患者、血液透析者、健康人群中TTV的感染状况进行了筛选。结果　 2 40例慢性乙肝患者中发现 2例TTV阳性 ,10 0例慢性丙肝患者中发现 4例TTV阳性。 2 0例血液透析者和 10 0例健康人群中都未发现TTV感染。结论　慢性丙肝患者比慢性乙肝患者有较高的感染率 ,在血液透析者和健康人群中没有发现TTV感染者。     

原因不明性肝炎患者血清中TTV DNA的检出及其临床意义

目的：研究原因不明性肝炎患者输血传播性病毒（Rransfusion transmitted virus,TTV)感染的检出状况及其临床意义。方法：在TTV ORF1保守区设计引物,建立巢式聚合酶链反应（Nested-PCR),检测50例原因不明性肝炎、40例健康人与30例乙肝病毒携带者血清中TTV DNA,比较TTV DNA阳性的肝炎患者的临床特征。结果：50例原因不明性肝炎中16例TTV DNA呈阳性（占32％）,比健康人群（2／40,5％）与乙肝病毒携带者（2／30,6．7％）血清中TTV DNA检出率高（P＜0．05）,16例TTV DNA阳性患者中以慢性肝炎占多数（12／16,75．5％）,临床表现为反复、持续ALT异常。结论：TTV在原因不明性肝炎中感染率明显高于其他人群,其可能是本地区原因不明性肝炎的致病因子。     

输血传播病毒(TTV)感染的慢性肝病临床研究

目的：研究慢性肝病输血传播病毒（TTV）感染的临床意义和TTV的致病性。方法：采用TTV套式PCR（聚合酶链式反应）检测183例慢性肝病的TTV感染，分析其肝功生化结果。结果：慢性乙型肝炎（CHB）患TTVDNA阳性48例，其中并有肝硬化12例，占25％（12／48）；重型肝炎18例，占37．5％（18／48）。病死12例，病死率为25％（12／48）；TTVDNA阴性90例，其中肝硬化6例，占6．7％（6／90），重型肝炎6例，占6．7％（6／90），病死3例，病死率3．3％（3／90）。非甲非乙型慢性肝炎有18例TTVDNA阳性，其中TTV阳性的病例无一例并发肝硬化和重型肝炎。HBV＋TTV混合感染的慢性肝炎组的总胆红质和ALT水平均高于CHB组和单纯TTV感染的慢性肝炎组，白蛋白和PTA水平均低于后两组，有显性差异。结论：TTV套式PCR是检测TTV感染的可靠手段之一。HBV和TTV混合感染可以加重病情，容易并发肝炎后肝硬化和形成重型肝炎，病死率高。     

献血人群感染TTV的检测及部分DNA序列分析

目的调查志愿无偿献血人群中输血传播病毒（TTV）的感染情况和分析TTV DNA部分基因序列。方法以TTV ORF1保守区设计两对引物,用巢式多聚酶链式反应（PCR）检测TTV DNA,并克隆和测序。结果在血液筛查合格的无偿献血人群中检出TTV DNA的阳性率为5．0％（5／100）。在单一转氩酶异常,HBV、HCV和HIV血清标记物正常的献血人群检出TTV DNA的阳性率为5．6％（4／71）。两者有非常显著性差异（P〈0．01）。与日本首例TTV-N22株相比,SZT1和SZT2株基因序列同源性为98．9％（3／272）和96．7％（9／272）,SZT3和SZT4株为67．3％（89／272）和86．0％（38／272）。结论在符合献血条件的人群中存在无症状TTV携带者。与之相比较,在ALT异常献血人群中TTV流行率相对较高,对其部分基因序列的比较显示了较大的变异性。     

肝病患者中TT病毒的检测

目的：在153例肝病患中分析新型肝炎病毒TTV的感染状况。方法：通过设计特异引物采用半巢式PCR反应进行血清标本的TTV DNA检测。结果：在153例肝病患中,第1轮PCR未见明显的扩增带,在第2轮PCR中33例具扩增带,阳性率为21．6％。其中31例慢性肝炎中6例呈阳性,24例肝硬化中2例阳性,6例肝癌和4例急性肝炎中各1例呈阳性,88例不明原因的肝功能异常中23例呈阳性。而8例肝功能正常无1例呈阳性。结论：通过检测在肝病患中存在TTV感染,这可能是另一种新型的肝炎病原。     

两例TTV感染者不同TTV克隆的DNA序列分析

目的探讨TTV的基因变异及其与致病性的关系。方法在ORF1区的高变区设计特异性引物建立巢式多聚酶链反应（PCR），扩增献血员与慢性非甲-庚型重型肝炎患者血清中的TTV DNA。PCR产物纯化回收后进行分子克隆，每例挑选10个不同TTV DNA克隆进行测序。不同们TTV DNA克隆之间及其与日本株TA278之间进行序列比较并进行进化树分析。结果成功地构建了TTV DNA克隆。与G1a亚型TA278的序列相比较有74％～95％的同源。献血员存在2种不同的TTV病毒株，其序列有7％的差异，都为G1a亚型。慢性非甲-庚型重型肝炎患者中存在7种不同的TTV病毒株，彼此之间序列有5％～24％不同，分别属于G1a和G1b亚型。结论慢性非甲-庚型重型肝炎患者中TTV的基因变异比献血员中的复杂得多。TTV基因变异的复杂性及其基因变异过程中可能产生的强毒力病毒株均有可能在其致病机制中起一定作用。G1b亚型可能有一定的致病性。