临床分离铜绿假单胞菌mucA基因突变与藻酸盐合成的关系

目的：探讨临床分离铜绿假单胞菌mucA基因突变情况及其与菌落形态、藻酸盐合成之间关系。方法：对58株临床分离铜绿假单胞菌（50株黏液型菌株和8株非黏液型菌株）mucA基因进行PCR-SSCP及DNA序列分析,与GenBank中野生型铜绿假单胞菌PAO1标准序列进行比对,并用比色法测定58株细菌藻酸盐浓度。结果：细菌mucA基因突变总发生率为100%,能够影响氨基酸编码的有意义突变在非黏液型菌株中未能检获,在黏液型菌株中为32%（16/50）;共发现14个突变位点,其中导致氨基酸编码发生改变的位点有5个,其余为沉默突变;黏液型菌株藻酸盐含量较非黏液型细菌显著增加（P＜0.01）,发生了有意义的mucA基因突变的菌株,藻酸盐合成较发生无意义突变的菌株显著增加（P＜0.01）。结论：mucA突变与临床分离铜绿假单胞菌菌落形态以及藻酸盐合成能力有关。     

一株含新的mucA突变基因的黏液型铜绿假单胞菌的生物学特性

目的研究黏液型铜绿假单胞菌PA17中的mucA基因序列及其生物膜形成、生长速度和耐药性,并与铜绿假单胞菌标准菌株PAOI进行比较。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法分别扩增PA17与非黏液型铜绿假单胞菌标准菌株PAOI的mucA基因,全自动荧光测序仪测序。同时用改良的平板培养法分别建立PA17和PAOI的生物膜模型,于8h、24h、3d,6d用扫描电镜检测生物膜形成情况。稀释平板计数法比较PA17和PAOI的生长曲线,国际标准琼脂平皿二倍稀释法检测常用抗生素对上述两菌株的体外抗菌活性。结果PA17mucA基因第166～333位核苷酸缺失;其生物膜形成速度及生长速度明显慢于PAOI;PA17与PAOI对常用抗生素的耐药性一致。结论发现一株含新的mucA突变基因的黏液型铜绿假单胞菌,其生物学特性不同于以往报道的黏液型铜绿假单胞菌,可能与mucA基因新的突变有关。     

DNase Ⅰ对非黏液型和黏液型铜绿假单胞菌生物膜的影响

目的研究不同浓度DNaseⅠ对非黏液型和黏液型铜绿假单胞菌生物膜形成及成熟生物膜的影响。方法分光光度计法检测25、50、100U／ml的DNaseⅠ对非黏液型铜绿假单胞菌PAOⅠ和黏液型铜绿假单胞菌PA17生长曲线的影响；改良平板培养法建立生物膜模型，分别在生物膜形成过程中及生物膜形成后用25、50、100U／ml的DNaseⅠ处理，扫描电镜观察PAOⅠ和PA17的生物膜形态。结果随着DNaseⅠ浓度增加，PAOⅠ和PA17的对数生长期延迟，但最终不能抑制细菌生长；25U／ml的DNaseⅠ即可抑制不同类型铜绿假单胞菌生物膜形成且分解成熟生物膜，100U／ml的DNaseⅠ可完全阻止铜绿假单胞菌生物膜形成并彻底分解成熟生物膜。结论DNaseⅠ不能直接杀灭铜绿假单胞菌，但可有效抑制铜绿假单胞菌生物膜形成并分解成熟生物膜，对非黏液型和黏液型铜绿假单胞菌生物膜的影响无明显差异，作用效果呈浓度依赖性。     

抗藻酸盐血清与加替沙星联合对铜绿假单胞菌生物被膜形态的影响

目的　探讨抗藻酸盐血清对黏液型铜绿假单胞菌生物被膜中细菌形态上的影响。方法采用改良的组织培养平板法建立黏液型铜绿假单胞菌生物被膜模型 ,经不同稀释度的抗藻酸盐血清与不同浓度的加替沙星联合应用处理后 ,以银染法快速鉴定 ,扫描电镜 (SEM)确认细菌生物被膜形态 ,并采用计算机图像处理系统进行图像分析。结果　计算机图像分析系统显示 ,空白组生物被膜的平均光密度为 0 82± 0 0 6 ;加入抗藻酸盐血清后 ,抗藻酸盐血清组、抗藻酸盐血清与加替沙星联合用药组生物被膜的平均光密度值分别为 0 79± 0 0 6和 0 70± 0 0 4 ,加替沙星单独用药组生物被膜平均光密度值为 0 76± 0 0 7的 ;光镜和电镜图像可见黏液样物变稀疏 ,细菌数减少 ,形态不甚规则。结论抗藻酸盐血清能够影响黏液型铜绿假单胞菌生物被膜构建和形态 ,与加替沙星联用后可以使黏液型铜绿假单胞菌生物被膜结构发生不同程度破坏。     

mucA基因突变对铜绿假单胞菌黏液表型的影响

目的 研究mucA基因突变对铜绿假单胞菌黏液表型的影响.方法 收集临床分离的黏液型铜绿假单胞菌9株,对稳定黏液表型的铜绿假单胞菌采用聚合酶链反应方法对其mucA基因进行扩增,全自动荧光测序仪测序分析.结果 筛选出3株稳定的黏液表型的铜绿假单胞菌,编号分别为PA255、PA622和PA880.mucA基因序列分析中,3株均存在第342位(A→G)的无意义突变,PA255第426位G缺失导致第439位产生终止密码,还伴有393位(C→G)的无意义突变,PA880还存在第465位(T→G)的点突变,PA622未发现其它位置的突变.结论 mucA基因突变是造成铜绿假单胞菌产生黏液表型的原因之一,同时也存在其它的遗传因素使其产生黏液表型.     

溶原性噬菌体对铜绿假单胞茵生物被膜形成的影响

目的 研究铜绿假单胞菌(PA3094)溶原性噬菌体Ppa3094对该菌生物被膜形成的影响.方法 采用平板培养法建立PA3094及PA3094-L(带前噬菌体Ppa3094的溶原性菌株)两株菌的体外生物被膜模型;MTT法测定生物被膜形成过程中两株菌的生物被膜活菌量;实时荧光定量PCR测定两株菌在培养不同时间点藻酸盐合成基因algC、algD的表达量.结果 两株菌均在培养5～7 d时形成成熟的生物被膜,呈薄膜状.在生物被膜形成过程中,两株菌的生物被膜菌量存在明显差异,在整个生物被膜形成过程中,PA3094生物被膜菌量均比PA3094-L高,PA3094-L在培养第5 d时生物被膜菌量达最高,第7 d有所下降.随着培养时间的延长,藻酸盐合成基因algD、algC表达量均上调,但PA3094-L表达量均比PA3094低,且algC表达量差异更大.结论 铜绿假单胞菌溶原性噬菌体Ppa3094可降低藻酸盐合成基因algD、algC的表达,从而影响生物被膜的形成.     

溶原性噬菌体对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响

目的研究铜绿假单胞菌（PA3094）溶原性噬菌体Ppa3094对该菌生物被膜形成的影响。方法采用平板培养法建立PA3094及PA3094-L（带前噬菌体Ppa3094的溶原性菌株）两株菌的体外生物被膜模型;MTT法测定生物被膜形成过程中两株菌的生物被膜活菌量;实时荧光定量PCR测定两株菌在培养不同时间点藻酸盐合成基因MgC、algD的表达量。结果两株菌均在培养5～7d时形成成熟的生物被膜,呈薄膜状。在生物被膜形成过程中,两株菌的生物被膜菌量存在明显差异,在整个生物被膜形成过程中,PA3094生物被膜菌量均比PA3094-L高;PA3094-L在培养第5d时生物被膜菌量达最高,第7d有所下降。随着培养时间的延长,藻酸盐合成基因algD、algC表达量均上调,但PA3094-L表达量均比PA3094低,且algC表达量差异更大。结论铜绿假单胞菌溶原性噬菌体Ppa3094可降低藻酸盐合成基因algD、algC的表达,从而影响生物被膜的形成。     

肽核酸体外抑制铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成的研究

目的研究肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用,探讨其潜在的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的应用价值。方法采用计算机软件设计和斑点杂交联合筛选出能与铜绿假单胞菌PAO1早期生物膜形成关键基因motA mRNA结合紧密的反义寡核苷酸序列,根据其序列合成肽核酸(PNA)并连接穿膜肽(cell pene-trating peptide,CCPs)(KFF)3K形成CCPs-PNA,分别采用不同浓度的CCPs、PNA和CCPs-PNA处理铜绿假单胞菌PAO1,定量测定并用显微镜观察其对生物膜形成的抑制作用。结果 PNA和CCPs-PNA对铜绿假单胞菌PAO1生物膜的早期形成都有抑制作用,并且随着浓度的增加,其抑制作用也增加,但CCPs-PNA对生物膜形成的抑制明显优于PNA组。1、5、10μmol/L的(KFF)3K-PNA对PAO1生物膜形成的抑制率分别约为30%、50%、70%。而1μmol/L的PNA对PAO1生物膜形成基本没有影响,5、10μmol/L的PNA对PAO1生物膜形成的抑制率却分别为3%和10%左右。各个浓度的CCPs对细菌生物膜的形成都没有影响。与对照组相比,CCPs-PNA处理之后的PAO1,其运动能力明显下降,PAO1处理组与对照组在运动培养基上的扩散直径之比约为3∶5。结论针对motA基因的PNA通过抑制PAO1的运动能力、降低吸附,从而对铜绿假单胞菌PA01起始阶段的生物膜形成产生抑制作用,穿膜肽(KFF)3K大大增强了此作用。推测铜绿假单胞菌的motA基因或其编码产物可能是一个良好的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的靶点。     

同源重组构建铜绿假单胞菌新的mucA基因突变菌株

目的 构建铜绿假单胞菌新的mucA基因突变菌株,为研究新突变的mucA基因功能提供实验菌株.方法 首先将含新突变的mucA基因同源片段与自杀质粒pEX100T相连接,构建质粒pEXmucA56,再将质粒pEXmucA56转化人大肠埃希菌DH5α,与铜绿假单胞菌标准菌株PAO1共培养进行同源重组,并用羧苄青霉素(Carbenicillin)平板、假单胞菌分离平板(Pseudomonas isolation agar,PIA)和蔗糖(sucrose)平板进行筛选,获得染色体上含新突变的mucA基因的PAO1菌株.结果 经酶切及聚合酶链反应(polyrnerase chain reaction,PCR)鉴定质粒pEXmucA56构建及转化成功,经PCR及测序分析证实同源重组菌株PAOmucA56构建成功.结论 成功构建了含新的mucA基因突变的铜绿假单胞菌菌株PAOmucA56,为研究新突变的mucA基因的功能奠定了基础.     

铜绿假单胞菌生物被膜诱导肺泡上皮细胞分泌炎性细胞因子的研究

目的：通过研究经铜绿假单胞菌生物被膜作用后,肺泡上皮细胞分泌炎性细胞因子水平的变化,探讨铜绿假单胞菌生物被膜在感染性肺纤维化中的作用。方法：采用体外诱导铜绿假单胞菌形成生物被膜,应用乙醇沉淀法提取细菌被膜并纯化;选用人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549,采用ELISA法定量检测在铜绿假单胞生物被膜藻酸盐作用后上皮细胞上清液中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的水平。结果：铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐作用后,A549细胞分泌IL-1β和TNF-α能力在48 h内持续升高,但IL-6和IL-8则在24 h达到高峰,此后下降。结论：铜绿假单胞菌生物被膜能诱导A549细胞分泌IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α能力增强或一过性增强,可能与其诱导肺泡炎症,进而促进成纤维细胞活化、增殖及转化有关。     

氨溴索联合左氧氟沙星对粘液型铜绿假单胞菌生物被膜的体外干预作用研究

目的探讨盐酸氨溴索（Ambroxol Hydrochloride,Amb）联合左氧氟沙星（Levofloxacin,LFX）对粘液型铜绿假单胞菌生物被膜（biofilm,BF）的影响。方法以铜绿假单胞菌粘液型菌株PDO300为实验菌株,构建体外BF模型。分为生理盐水对照组、Amb组、LFX组、Amb与LFX联合作用组,二倍稀释法测定LFX最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration,MBC）,结晶紫染色法定量测定BF形成量。结果 PDO300培养7d后可形成稳定的BF。与单独应用LFX相对比,Amb与LFX联合作用后测定载体表面BF值显著降低（P〈0.01）,且载体表面BF随着LFX浓度增高而减少。结论 Amb可显著增强LFX对BF的破坏作用。     

两种铜绿假单孢菌慢性大鼠肺部感染模型的建立方法探讨

目的 建立两种铜绿假单孢菌慢性大鼠肺部感染模型,并根据细菌学和病理学指标对其进行评价.方法 (1)随机将健康清洁级Sprague-Dawley大鼠300只分为3组:野生型铜绿假单孢菌感染组(PAO1组),变异型铜绿假单孢菌感染组(PAO-JP2组)和对照组.(2)应用锐孔喷射装置,将两株铜绿假单孢菌的藻酸盐混悬液制成两种铜绿假单孢菌藻酸盐包裹体凝胶小珠,通过气管插管法将其接种至大鼠肺部,以无菌生理盐水-藻酸盐包裹体接种组作为空白对照组.在接种后3、7、14、28 d,取每组大鼠肺分别进行肺组织匀浆菌落计数和病理学检查.结果 (1)细菌学指标:感染后3、7、14、28 d,对照组肺组织均未培养出细菌,PAO1组和PAO-JP2组肺组织均分别培养出野生型和变异型铜绿假单孢菌,感染后3、7 d,PAO1组和PAO-JP2组大鼠肺组织匀浆菌落计数均＞105 CFU/g(对数值:3 d:PAO1组19±6,PAO-JP2组17±7;7 d:PAO1组13±4,PAO-JP2组:12±4),感染后14、28 d,上述两组大鼠肺组织菌落计数均＞103 CFU/g,PAO1组明显高于PAO-JP2组(P＜0.05)(对数值:14 d:PAO1组11.3±2.8,PAO-JP2组9.6±3.3;28 d:PAO1组9.1±1.5,PAO-JP2组4.2±3.0).(2)病理学指标:接种后3、7 d,感染动物肺组织均有不同程度的脓肿、实变、水肿、出血表现,镜下可见中性粒细胞聚集在藻酸盐包被体周围,形成脓肿.接种后14、28 d,实变逐渐减少,以局部肺不张、纤维增生、肉芽肿形成为主要表现,而以PAO1组表现得更为明显.结论 使用锐孔喷射装置,制成两种铜绿假单孢菌藻酸盐包裹体凝胶小珠并接种至大鼠肺部,可以成功地建立两种细菌的慢性大鼠肺部感染模型,方法较简便可行.     

铜绿假单胞菌QS系统缺陷对生物膜形成及大鼠肺部慢性感染的影响

目的研究lasI rhlI基因缺陷对铜绿假单胞菌体外生物膜形成的影响;观察铜绿假单胞菌PAO1野生型及其群体感应系统的lasI rhlI基因缺陷型菌株人工生物膜致病性的差异,了解群感应系统的lasI rhlI基因在铜绿假单胞菌生物膜感染致病过程中的作用。方法采用生理盐水-吸痰管系统进行铜绿假单胞菌体外生物膜的培养,3d后用扫描电子显微镜观察PAO1、PAO1 lasI rhlI形成生物膜的情况。从大鼠支气管内直接予以PA(菌种为铜绿假单胞菌PAO1野生型,PAO1 lasI rhlI基因缺陷型)海藻酸盐微菌粒悬液(1×109CFU/mL)攻击,建立PAO1野生型及QS系统的lasI rhlI基因缺陷型菌株人工生物膜肺部感染动物模型。于感染2周后评估各组大鼠的肺部病理学、细菌学的变化。结果3d后PAO1野生型的生物膜较厚,lasI rhlI基因缺陷型菌株所形成的生物膜结构呈薄膜状,明显薄于PAO1野生型。感染2周后,PAO1野生型组的病理学改变和细菌学改变均显著重于lasI rhlI基因缺陷组(P<0.001)。结论QS系统的lasI和rhlI基因影响铜绿假单胞菌体外形成生物膜的能力,并且在PA肺部感染过程中发挥着重要作用。     

黏液型与非黏液型铜绿假单胞菌的比较蛋白组学分析

目的 探讨黏液型与非黏液型铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.a)的差异蛋白谱,以发现黏液型P.a潜在的生物标志物.方法 采用来自于临床囊性纤维化患者分离的3株黏液型P.a菌株,脉冲场凝胶电泳以确定它们的同源性;采用同位素相对和绝对定量标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)结合二维液相色谱串联质谱(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2D LC-MS/MS)技术分析3株黏液型与对照组1株非黏液型P.a的差异蛋白谱,并采用RT-qPCR方法对5个共同差异蛋白进行验证.结果 3株黏液型P.a菌株不具有同源性,iTRAQ结果没有明显差异.3组共有219个上调和101个下调差异蛋白.pa2815、pa2018、dnak、pa5046和acef基因转录水平与iTRAQ结果一致.结论 不同黏液表型P.a的iTRAQ结果没有明显差异,219个上调和101个下调差异蛋白可以作为研究黏液型与非黏液型P.a致病机制的候选生物标志物.     

pvdQ基因对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响

目的 观察pvdQ(PA2385)基因对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响.方法 构建pvdQ基因表达质粒pME6032-pvdQ,鉴定后,采用电穿孔法将其转入PAO1野生株中,构建pvdQ高表达株.同时将空质粒pME6032采用电穿孔法转入PAO1野生株中,构建pME6032空质粒株,采用Real-time PCR检测各株...     

喹诺酮信号分子对铜绿假单胞菌毒力的影响

目的探讨喹诺酮信号分子（PQS）对铜绿假单胞菌（PA）毒力的影响。方法选择PAO1作为实验菌,分为PQS组、PQS与
抑制剂组、抑制剂组以及正常组。QPCR方法检测Ⅲ型分泌系统（T3SS）的调节基因ExsA和毒力蛋白基因ExoS的转录水平;分
光光度计检测绿脓素生成量;作用肺泡上皮细胞A549,用平板计数法比较PAO1粘附和侵袭力;构建小鼠腹膜炎模型,观察PQS
对小鼠存活时间的影响。结果PQS增多和减少不影响PAO1 的成长情况。与正常组相比,PQS组的ExsA与其调控表达的
ExoS 毒力蛋白基因转录水平均显著升高（P<0.01）;PQS组PAO1 产生的绿脓素也明显升高,抑制组却明显下降（P<0.01）;与
A549细胞作用时,抑制剂组PAO1的粘附和侵袭力均显著降低;腹膜炎模型小鼠PQS组存活时间也降低明显（P均<0.01）。抑
制剂组Exos的转录水平有降低,差异有统计学意义（P<0.05）。与正常组比较,抑制剂组的ExsA转录水平无明显差异,PQS组
PAO1的粘附力和侵袭力没有改变（P均>0.05）。结论在PA感染宿主的整个过程中,PQS能维持粘附和侵袭能力,PQS的浓度
与绿脓素的产生有正相关关系,从而最终使宿主的存活时间成负相关。
     

巯乙磺酸钠联合环丙沙星对铜绿假单胞菌生物膜的作用

的：探讨巯乙磺酸钠（mesna）对成熟铜绿假单胞菌生物膜(BF)的影响及其联合环丙沙星(CIP)对铜绿假单胞菌BF的作用。方法： 微量稀释法检测 mesna和CIP对铜绿假单胞菌PAO1的最低抑菌浓度（MIC）;建立铜绿假单胞菌BF体外模型后分为对照组、低浓度mesna组及高浓度mesna组, 用激光共聚焦显微镜(CLSM) 采集并结合BF图像结构分析软件(ISA) 定量分析mesna对铜绿假单胞菌BF作用后的结构参数; 铜绿假单胞菌BF再次分为mesna组、CIP组及CIP联合mesna组,用CLSM采集BF图像并结合Amira 5.2三维重建软件定性分析mesna单独及联合CIP对成熟铜绿假单胞菌BF的作用;以棋盘设计,将不同浓度的mesna (0、0.5、1.0、2.0、4.0 g•L^-1)和不同浓度的CIP(浓度依次为（0、1/2、1、2、4和8 MIC）两两组合,平板计数法检测mesna单独及与CIP联用后BF内活菌数。结果： mesna对PAO1的 MIC为10 g•L^-1,CIP对PAO1的MIC为0.125 mg•L^-1; CLSM图像经ISA软件定量分析显示,与对照组比较,mesna能使BF厚度、平均扩散距离和结构熵均减少(P<0.01),区域孔率增加(P<0.01),高浓度组较低浓度组效应更明显(P<0.01);CLSM图像经三维重建后可见,单用mesna（2 g•L^-1）, BF内细菌密集层叠,厚度较厚,可见大量活菌,未见明显死菌;单用CIP（2MIC）,BF内仍可见大量活菌,死菌数少; mesna（2 g•L-1）联合CIP（2 MIC）组可见BF细菌稀疏、厚度薄,活菌数少,BF内可见大量死菌;单用2 g•L-1mesna能使BF中的活菌数减少(P<0.05),单用2MIC CIP可使BF中活菌数降低(P<0.05), 1 g•L-1 mesna与1 MIC的CIP联合应用可使BF上的活菌数明显减少(P<0.05)。结论：mesna能破坏铜绿假单胞菌BF形态结构,mesna与CIP存在协同作用,可增强其杀菌能力。