小柴胡汤剂作用日本血吸虫感染小鼠的血清多肽变化

目的  分析小柴胡汤剂作用于日本血吸虫感染小鼠后的血清多肽变化,评价其治疗效应。 方法  构建日本血吸虫感染小鼠模型及小柴胡汤剂治疗组,利用弱阳离子磁珠纯化血清多肽,应用时间飞行质谱（MALDI-TOF-MS）检测并结合ClinProTool数据处理软件进行分析。 结果  在Mr 800~17 000区段,与感染组小鼠血清多肽指纹图谱比较,对照组小鼠与小柴胡治疗组血清中均检测到3个差异表达的多肽峰,即Mr 2 924、8 210的表达呈极显著上调（P<0.01）;Mr 11 690呈显著下调（P<0.05）。 结论  小柴胡汤对治疗日本血吸虫病具有潜在的应用价值,并为从蛋白水平上筛选治疗靶点提供理论依据。     

日本血吸虫抗体检测试剂盒（IHA法）早期诊断效果的初步评估

目的  初步评估日本血吸虫抗体检测试剂盒（IHA法）的早期诊断效果。 方法  建立日本血吸虫感染家兔模型,日本血吸虫抗体检测试剂盒（IHA法）及基于该试剂盒所使用的血吸虫天然蛋白抗原X的ELISA法 (抗原X-ELISA法) 检测感染前及感染后第1、2、3、4、5、6周兔血清,并比较两种方法的早期诊断效果。 结果  日本血吸虫抗体检测试剂盒（IHA法）检测感染前及感染后第1、2周兔血清的阳性率均为0,从感染后第3w开始阳性率均达到100%;抗原X-ELISA法检测日本血吸虫感染前正常兔血清的假阳性率为30.77%,检测感染后第1、2周兔血清的阳性率分别为0和16.67%,从感染第3周开始阳性率也达到100%。两种方法检测同一时间点兔血清的阳性率差异均无统计学意义（P＞0.05）。 结论  日本血吸虫抗体检测试剂盒（IHA法）在早期诊断日本血吸虫病方面具有一定的潜在价值。     

日本血吸虫病经胎盘传播家兔血清抗体的检测

目的 探索日本血吸虫病经胎盘传播的血清免疫反应。方法 对不同孕期的怀孕母兔分别感染300条日本血吸虫尾蚴,仔兔出生后37－46d后收集母兔和仔兔血清84份,以ELISA检测家兔日本血吸虫特异性IgG抗体。结果 10份母兔血清均为阳性（OD＝1．42－1．82）,74份仔兔血清均为阴性（OD＝0．04－0．60）;其中怀孕中期感染日本血吸虫母兔所产仔兔（52份）和怀孕晚期感染所产仔兔（22份）血清,OD均值分别为0．19和0．36,两者差异有非常显著意义（P＜0．001）;同一怀孕期感染日本血吸虫母兔所产仔兔,检到虫体与未检到虫体血清检测,OD值差异无显著意义（P＞0．05）。结论 日本血吸虫经胎盘传播后,所产仔兔在短期内可能产生免疫耐受性。     

姜黄素对早期血吸虫病小鼠肝功能的影响

目的动态观察姜黄素（curcumin，CUR）对早期血吸虫病小鼠肝功能的保护作用。方法将64只小鼠随机分为4组，每组16只，分别为健康对照组、感染对照组、溶剂组和CUR组。除健康对照组外各组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴约25条。CUR组感染后即开始给予CUR200mg／kg体重灌胃治疗，2次／d，至第8周末；健康对照组和感染对照组给予同剂量的蒸馏水灌胃，溶剂组给予同剂量的4％羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethycellulose，CMC）溶液灌胃。于第6、8周末每组各取8只小鼠，处死，取血清和肝脏，以HE染色观察各组小鼠肝组织病变，通过测定小鼠血清以及肝匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）、丙二醛（MDA）水平的变化，观察CUR对血吸虫病小鼠治疗的效果。结果感染血吸虫后，CUR组与感染对照组比较小鼠肝组织损伤程度明显减轻，第6周末血清SOD含量显著升高（P〈0．01），GSH-px含量无显著变化（P〉0．05），MDA含量显著降低（P〈0．05），肝匀浆SOD、GSH-px含量显著升高（P〈0．05），MDA含量显著降低（P〈0．05）；第8周末小鼠血清和肝匀浆SOD、GSH—px水平均显著升高（P〈0．05或P〈0．01），MDA水平均显著降低（P〈0．05）。CUR组第8周末小鼠血清和肝匀浆SOD、GSH-px及MDA含量与第6周末相比差异无统计学意义。结论姜黄素有减轻血吸虫病急性期肝损伤的作用。     

保脾手术对晚期血吸虫病肝纤维化及相关细胞因子的影响

目的探讨保脾手术对晚期血吸虫病肝纤维化及相关细胞因子的影响。方法新西兰兔50只随机分为正常对照组（NCG）10只、模型对照组（MCG）12只、全脾切除组（TSG）14只、脾大部切除组（SSG）14只。后3组（MCG、TSG、SSG）先制作血吸虫病肝纤维化模型。感染后15周,NCG组和MCG组行假手术,TSG组行全脾切除术,SSG组行脾大部切除术（保留1/3脾组织）。观察各组家兔感染后8、15、21周血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）水平的动态变化和术前、术后6周肝组织转化生长因子β1（TGF-β1）、Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达变化。结果感染尾蚴后8周,模型家兔血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均较正常对照组显著升高（P均〈0.01）;至感染后15周（术前）,血清TNF-α、IL-6、IL-1β已显著回落（P均〈0.01）;术后第6周不同手术方式之间比较,血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平差异无统计学意义（P〉0.05）。术前模型组家兔肝组织TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达显著高于正常对照组（P〈0.01）;术后6周,不同手术方式之间比较,肝组织TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达差异无统计学意义（P〉0.05）。结论晚期血吸虫病行保脾手术不会加重肝纤维化,可能与晚期血吸虫病TGF-β1、TNF-α、IL-6、IL-1β水平已显著回落,此时切脾不影响这些细胞因子水平有关。     

原发性胆汁性肝硬化血清蛋白质谱的初步研究

目的筛选与原发性胆汁性肝硬化（PBC）相关的血清蛋白质分子标志物并建立指纹诊断模型。方法收集30例PBC患者血清,30例年龄、性别相匹配正常人,采用弱阳离子磁珠（MB-WCX）为检测介质,基质辅助激光解吸电离质谱（MADIL-TOF-MS）检测得到蛋白质谱,再应用基于磁珠的多维纳升级高效液相色谱及液体蛋白芯片指纹图谱（CLINPROT）系统比较两组血清蛋白质谱。结果在m/z100～10000范围内,检测出的129个蛋白峰中11个蛋白峰差异有统计学意义（P〈0.05）,其中m/z为4963.6、5805.33、1544.45、2292.16、2466.45、2845.85在PBC中表达上调,而m/z为3262.24、3191.2、4090.5、4072.43、3277.46的蛋白峰在PBC中下调;选择m/z为3262.24、3191.2这2个蛋白峰建立的蛋白芯片指纹图谱（CLINPROT）系统对PBC诊断的敏感性为90%,特异性为95%。结论筛选出的11个蛋白分子标志物可能与PBC有关,其中m/z4963在PBC中表达最明显;蛋白芯片指纹图谱（CLINPROT）系统可能对PBC的诊断具有一定临床意义。     

日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团（TSP2HD）基因合成、表达与免疫原性研究

目的合成和表达日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团（TSP2HD）基因,并研究其免疫原性。方法采用重叠PCR人工合成日本血吸虫TSP2HD（aa107～aa182）完整基因片段,经测序正确后,将此片段插入表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒TSP2HD-PG,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,获得含重组表达质粒的转化子,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）观察TSP2HD融合蛋白表达情况。用谷胱甘肽（GST）融合蛋白纯化胶（glutathione sepharose 4B）从表达产物裂解上清中纯化GST-TSP2HD融合蛋白,用凝血酶切割融合蛋白,制备纯化的重组TSP2HD蛋白。通过蛋白质印迹（Western blotting）分析重组TSP2HD蛋白与血吸虫病患者血清及血吸虫重感染兔血清的免疫反应性;重组TSP2HD蛋白刺激血吸虫感染小鼠淋巴细胞进行淋巴细胞增殖试验,通过比较实验组与对照组脉冲指数（cpm）值的差异研究重组TSP2HD蛋白的免疫原性。结果经过3轮重叠PCR扩增,获得长228bp的TSP2HD基因,序列分析证实与天然基因序列完全一致。含重组质粒TSP2HD-PG的转化子细菌,经IPTG诱导后表达相对分子质量（Mr）约为34000的可溶性GST-TSP2HD融合蛋白。凝血酶切割GST-TSP2HD融合蛋白获得纯化的重组TSP2HD蛋白。Western blotting分析证明,重组表达蛋白可被血吸虫重感染兔血清和血吸虫病患者血清识别,有较好的免疫反应性;重组TSP2HD蛋白能刺激血吸虫感染小鼠脾细胞增殖,实验组cpm值明显高于对照组,两者间差异有统计学意义（P〈0.01）。结论日本血吸虫TSP2HD基因合成及表达获得成功,重组TSP2HD蛋白有天然免疫原性。     

日本血吸虫病经胎盘传播免疫耐受性的进一步研究

目的进一步探索日本血吸虫病经胎盘传播的免疫耐受性.方法对不同孕期的怀孕母兔分别感染300条日本血吸虫尾蚴,感染45天后收集母兔和仔兔血清84份,在检测家兔日本血吸虫特异性IgG抗体研究结果的基础上,进一步以ELISA方法检测日本血吸虫特异性IgM抗体.结果10份母兔血清IgM抗体检测均为阳性(OD=0.82～1.51),74份仔兔血清均为阴性(OD=0.01～0.49);怀孕中期感染日本血吸虫母兔所产仔兔(52份)和怀孕晚期感染所产仔兔(22份)血清,OD均值分别为0.23和0.28,两者差异有显著意义(P＜0.05);同一怀孕期感染日本血吸虫母兔所产仔兔血清,OD值差异无显著意义(P＞0.05).结论日本血吸虫经胎盘传播后,所产仔兔在短期内产生免疫耐受性.     

亮氨酸氨肽酶在日本血吸虫感染中的抗体应答特征

目的以亮氨酸氨肽酶（LAP）作为检测抗原,观察日本血吸虫感染后不同时期动物血清中相应抗体的动态变化特征。方法应用免疫印迹试验（Western blot）鉴定日本血吸虫LAP（SjLAP）重组蛋白的表达,并利用His镍柱纯化目的蛋白。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测感染前、后不同时期小鼠及猪血清中LAP诱导抗体产生的变化特征。结果重组蛋白SjLAP可与anti-His单克隆抗体反应,并可被日本血吸虫感染后小鼠血清所识别。获得高浓度重组蛋白SjLAP,以该蛋白为抗原,采用ELISA法检测发现感染后4周猪血清和感染后6周小鼠血清抗体水平达到高峰;且随着虫卵大量出现,抗体水平均显著下降（P均〈0.01）。结论 SjLAP在感染早期的高表达可能对日本血吸虫病早期诊断具有一定的参考价值。     

基于可溶性童虫抗原（SSA）的IHA法早期诊断日本血吸虫病的初步研究

目的  建立基于可溶性童虫抗原（SSA）早期诊断日本血吸虫病的IHA法。 方法  收集日本血吸虫感染后第13d童虫,制备SSA;探索SSA致敏红细胞的最佳体积比例以及灭活补体阴性兔血清的最佳封闭浓度,制备基于SSA的IHA法诊断试剂（以下简称“SSA-IHA法”）,并检测日本血吸虫感染前及感染后第1、2、3、4、5、6周兔血清。 结果  SSA致敏红细胞的最佳体积比例为1:1,灭活补体阴性兔血清的最佳封闭浓度（V/V）为3%。SSA-IHA法检测日本血吸虫感染前及感染后第1、2、3、4、5、6周兔血清的阳性率依次为0%、0%、0%、90.91%、100%、100%和100%。 结论  基于可溶性童虫抗原（SSA）的IHA法在早期诊断日本血吸虫病方面具有一定的价值。     

Analysis of diferentially expressed protein from primary and recurrent ovarian cancer serum

ObjectiveTo study the value of the differentially expressed proteins from primary and recurrent ovarian cancer serum for early diagnosis of primary and recurrent ovarian cancer.MethodsWCX kit (Bruker Daltonics GraBH) and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) technology were used to detect serum samples from 49 patients with primary ovarian cancer and 21 patients with recurrent disease.ResultsIn the mass range (Mr) from 1 000 to 12 000 Da, eight differentially expressed protein peaks were screened from primary ovarian cancer serum. Among them, four protein peaks with Mr 1 457, 1 857, 2 202, 7 761 were lowly expressed and the others with Mr 2 946, 5 333, 5 859, 5 901 were highly expressed. Ten diferentially expressed protein peaks were screened from recurrent ovarian cancer serum. Among them, 1 944, 1 980, 2 080, 2 661, 2 993, 4 450, 4 659, 5 359 Da protein expressions were increased significantly, and 1897, 7868 Da protein expressions were decreased significantly. The pattern of primary ovarian cancer was applied to 8 early-stage ovarian cancer serum samples, and 7 serum samples were successfully predicted with the accuracy of 87.5%. The pattern of recurrent ovarian cancer was applied to 9 without pelvic or abdominal mass recurrent ovarian cancer serum samples, and 8 serum samples were successfully predicted with the accuracy of 88.9%.ConclusionCombination of MALDI-TOF-MS and WCX kit technology can directly screen the diferrential expressed protein from primary and recurrent ovarian cancer serum. They have clinical significance for enhancement of sensitivity and specificity of ovarian cancer diagnosis.     

WCX磁珠联合MALDI-TOF-MS技术在结直肠癌诊断中的应用

目的:比较结直肠癌与正常人血清蛋白质谱的变化,筛选特异性蛋白标志物,建立结直肠癌诊断分类树模型.方法:收集血清样本133例(其中结直肠癌67例,正常人66例),随机分为建模组和验证组.运用弱阳离子纳米磁珠(magnetic bead-weak cation exchange,MB-WCX)联合基质辅助激光解吸离子飞行质谱(matrix-assistedlaser desorption/ionization time-of-flight massspectrometry,MALDI-TOF-MS),建立结直肠癌与正常人血清蛋白质谱.用Flex Analysis2.4软件收集数据,应用ClinproTools2.2软件对建模组34例结直肠癌和33例正常人血清差异蛋白质谱进行定量分析,应用Genetic Algorithm算法建立结直肠癌诊断模型,应用所获取的诊断模型对验证组样本(33例结直肠癌和33例正常人)进行分类诊断,以评价诊断模型的诊断价值.结果:通过比较分析结直肠癌与正常人血清蛋白质谱,发现共有33个差异蛋白峰(P<0.05),其中在结直肠癌中表达上调25个,表达下调8个.利用其中5个差异峰(Mr分别为759,3316,4645,4248,2645Dr)建立诊断模型,获得了94.12%(32/34)敏感性和96.97%(32/33)的特异性,经独立样本双盲验证,其灵敏度为93.94%(31/33),特异度为96.97%(32/33).结论:基于磁珠分离和MALDI-TOF-MS技术能直接检测出结直肠癌患者血清差异表达蛋白,建立的诊断模型具有较高的敏感性和特异性,对提高结直肠癌的诊断具有一定的临床意义.     

利用SELDI-TOF-MS技术研究巨细胞病毒感染致婴儿肝炎综合征的血清蛋白标志物

目的:用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术研究人巨细胞病毒(hCMV)感染致婴儿肝炎综合征患儿血清蛋白质谱的差异表达,寻找特异性蛋白标志物,为研究hCMV感染引起婴儿肝炎综合征的蛋白质组学发病机制奠定基础.方法:实验组为hCMV感染所致的婴儿肝炎综合征患儿20例;对照组Ⅰ为感染hCMV但未发生婴儿肝炎者5例;对照组Ⅱ为hCMV感染阴性的婴儿肝炎10例;对照组Ⅲ为健康对照10例.采集全血,分离血清,用SELDI-TOF-MS技术和WCX2芯片检测各组蛋白质谱的表达.结果:hCMV感染引起的婴儿肝炎综合征组与其他对照组比较,血清中有4个蛋白质表达水平发生明显变化,分别为Mr4349.8、Mr5808.7、Mr7935.6和Mr8885.9的蛋白峰.hCMV感染的两个组与未感染的对照组婴儿比较,血清中共有5个蛋白质表达水平发生明显变化,分别为Mr3266.8、Mr5638.5、Mr5909.1、Mr7771.4和Mr15835.6的蛋白峰.hCMV感染但未发生婴儿肝炎组与其他组婴儿比较,血清中有2个蛋白质表达水平发生明显变化,分别为Mr4600.1和Mr5704.3的蛋白峰.两个婴儿肝炎组与肝功能正常的另两组婴儿比较,血清中有4个蛋白质表达水平发生明显变化,分别为Mr7567.0、Mr13744.8、Mr15100.7和Mr15915.0的蛋白峰.结论:一些特定的血清蛋白质分子如肝再生增强因子、前白蛋白和结合珠蛋白是与肝功能密切相关的因子;细胞因子β-防御素31,β-防御素8和巨细胞源性趋化因子等,可能与hCMV感染、感染后发病及感染后保护相关.     

应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法研究原发性胆汁性肝硬化的血清多肽谱

目的应用弱阳离子交换磁珠提取多肽结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF-MS)分析原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者的血清多肽谱,寻找具有潜在意义的血清标志物。方法收集105例血清样本,包括55例PBC患者、25例其他肝病患者和25例正常对照者血清样本,经弱阳离子交换磁珠纯化,MALDI-TOF-MS分析及ClinProTools生物信息学方法研究其血清多肽表达谱。结果在质荷比(m/z)1000～10 000 Da的范围内3组间共检测到158个血清多肽峰,其中83个有统计学意义(P<0.001),在PBC中表达上调的多肽有31个,表达下调的多肽有52个。组合m/z 1062.47、5356.13、4268.63、846.18、1945.31和6649.53Da 6个峰建立多肽诊断指纹图谱模型,该模型盲样验证的准确率在PBC组、正常对照组和其他肝病组分别为100%、81.8%和72.7%。结论可以利用MALDI-TOF-MS技术和ClinProTools软件来筛选PBC血清标志物,其在PBC诊断方面具有一定的价值。     

旋毛虫成虫排泄分泌抗原检测唾液中抗旋毛虫IgG抗体的研究

目的 评价旋毛虫(Trichinella spiralis)成虫排泄分泌抗原(adult worm excretory-secretory antigen,AWESA)作为诊断抗原检测旋毛虫感染日本大耳兔唾液中抗旋毛虫IgG抗体的可行性. 方法 建立旋毛虫感染日本大耳兔和对照组兔动物模型,采集感染前和感染后1～6周兔唾液和血清以及对照组兔唾液和血清.制备AWESA,建立AWESA作为诊断抗原的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),以市售旋毛虫IgG抗体检测试剂盒作为对照,测定感染前和感染后1～6周兔唾液和血清以及对照组兔唾液和血清中抗旋毛虫IgG抗体.AWESA和试剂盒测得的唾液A值和血清A值进行线性相关分析,AWESA和试剂盒测得的唾液阳性率和血清阳性率分别进行x2检验.结果 AWESA检测唾液和血清特异性IgG抗体阳性率依次为0、5%、20%、40%、60%、85%、90%,0、30%、60%、85%、95%、100%、100%,除感染后0、1、2周外其余各周唾液A值与血清A值呈显著线性相关(P＞0.05、P＞0.05、P＞0.05、P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05).市售旋毛虫IgG抗体检测试剂盒检测旋毛虫感染前和感染后兔唾液和血清中特异性IgG抗体阳性率依次为0、15%、20%、40%、55%、75%、90%,0、35%、60%、95%、95%、100%、100%,除0、1、3周外其余各周唾液A值与血清A值呈线性相关(P＞0.05、P＞0.05、P＜0.05、P＞0.05、P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05). 结论 AWESA与市售试剂盒检测唾液和血清中抗旋毛虫IgG抗体的阳性率具有一致性.     

日本血吸虫腺苷酸激酶基因的表达及其重组蛋白免疫反应性的评价

目的　将亚克隆入 pET3 2a( +)质粒的日本血吸虫腺苷酸激酶 (adenylatekinase ,AK )基因进行表达及蛋白纯化 ,并对表达产物的免疫反应性进行评价。　方法　将重组表达质粒 pET3 2a( +) AK转入宿主菌大肠埃希菌BL2 1,异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达后超声裂菌 ,离心 ,取上清进行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE) ;将SDS PAGE后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜上 ,分别用 6 组氨酸 ( 6 His)抗体、日本血吸虫尾蚴感染6wk的兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清为一抗进行蛋白质印迹试验 (Westernblotting) ;用金属Ni螯合物亲和层析树脂 (Ni NTA)层析柱纯化目标蛋白 ;以纯化后的融合蛋白为包被抗原 ,酶联免疫吸附测定 (ELISA)检测正常兔血清和血吸虫感染兔血清。　结果　重组菌用IPTG诱导表达后进行SDS PAGE ,于相对分子质量 (Mr) 40 0 0 0处见一特异表达带 ,与预期表达的融合蛋白大小相符 ;Western印迹分析显示该重组的融合蛋白带有预期的 6 His基团 ,且能与尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清发生特异性反应 ;ELISA结果显示纯化的重组AK蛋白可以特异识别血吸虫感染兔血清。　结论　AK基因在工程菌中以可溶性融合蛋白的形式得到表达 ,该重组蛋白与血吸虫感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清具有特异的免疫反应性。     

肺结核患者强化治疗前后血清差异蛋白质质谱分析

目的研究肺结核患者强化治疗前后血清蛋白质谱的变化。方法利用弱阳离子(WCX)液体蛋白质芯片和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,对16例肺结核患者强化治疗前后的血清蛋白质谱进行比较分析。结果强化治疗前后有22种蛋白质的相对含量有明显差异,11种蛋白质在强化治疗后相对含量明显升高(P0.05),另外11种蛋白质在强化治疗后相对含量明显降低(P0.05)。结论肺结核患者强化治疗前后血清蛋白质谱存在明显差异。     

快速诊断人畜旋毛虫病ELISA试剂盒的研制及应用

本研究建立了快速诊断人畜旋毛虫病的ELISA试剂盒,该试剂盒与常规ELISA平行检测107例旋毛虫病人血清,阳性率分别为99.07％和97.19％;检测10份感染旋毛虫的病猪血清、5份病豚鼠血清、4份病犬血清、5份病兔血清,除病兔的阳性率两法均为80％外,其余两法均为100％。实验证明该试剂盒具有较好的特异性和重复性,已在全国人体寄生虫病分布调查中推广应用。