MBD1甲基化调控胰腺癌BxPC-3细胞株mdr1转录及其表达的研究

目的 观察MBD1通过对mdr1转录区域结合位点甲基化影响,在转录水平间接调控胰腺癌mdr1基因表达.方法 应用RNA干扰技术对人胰腺癌细胞株BxPC-3中MBD1基因进行抑制;应用定量荧光聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术、MSP(甲基化专用聚合酶链式反应)方法分别检测转染前后细胞株中的mdr1 mRNA的表达差异和转录区域结合位点甲基化变化.结果 成功构建并转染MBDI siRNAs至人原位胰腺腺癌细胞BxPC-3(BxPC-3)细胞中,证实MBDI mRNA水平明显下调(下调幅度为93.19%).MBD1下调后,mdr1 DNA转录区域(-110GC和-50GC)甲基化分别上调(上调幅度分别为181.98%和409.57%);mdr1 mRNA表达明显下调(下调幅度为97.79%).结论 MBD1可通过对mdr1转录区域结合位点甲基化的影响,在转录水平间接调控胰腺癌mdr1基因表达.     

MBD1甲基化调控胰腺癌BxPC-3细胞株mdr1转录及其表达的研究

目的 观察MBD1通过对mdr1转录区域结合位点甲基化影响,在转录水平间接调控胰腺癌mdr1基因表达.方法 应用RNA干扰技术对人胰腺癌细胞株BxPC-3中MBD1基因进行抑制;应用定量荧光聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术、MSP(甲基化专用聚合酶链式反应)方法分别检测转染前后细胞株中的mdr1 mRNA的表达差异和转录区域结合位点甲基化变化.结果 成功构建并转染MBDI siRNAs至人原位胰腺腺癌细胞BxPC-3(BxPC-3)细胞中,证实MBDI mRNA水平明显下调(下调幅度为93.19%).MBD1下调后,mdr1 DNA转录区域(-110GC和-50GC)甲基化分别上调(上调幅度分别为181.98%和409.57%);mdr1 mRNA表达明显下调(下调幅度为97.79%).结论 MBD1可通过对mdr1转录区域结合位点甲基化的影响,在转录水平间接调控胰腺癌mdr1基因表达.     

MBD1 RNA干扰对胰腺癌细胞VIMENTIN、GRP78表达影响的实验研究

目的：观察下调甲基化CpG结合域蛋白1（MBD1）表达后对胰腺癌细胞甲基化相关基因VIMENTIN、GRP78表达的影响,探讨MBD1介导的甲基化调控网络在胰腺癌发生、发展中的重要作用。方法：人工设计合成针对MBD1基因的小分子干扰RNA,构建MBD1-siRNA重组质粒,脂质体法转染人胰腺癌细胞株BxPC-3,RT-PCR和Western印迹法检测转染前后MBD1、VIMENTIN和GRP78 mRNA与蛋白表达的变化。结果：MBD1-siRNA重组质粒成功转染胰腺癌细胞系BxPC-3,并筛选得到稳定表达的细胞株。转染后胰腺癌BxPC-3细胞株MBD1、VIMENTIN和GRP78的mRNA与蛋白表达水平均明显降低。结论：MBD1下调可使胰腺癌细胞VIMENTIN和GRP78表达下降：MBD1可能通过调控甲基化相关基因的表达,在胰腺癌的发生、发展过程中起重要的作用。     

MBD1 RNA干扰对胰腺癌细胞株BxPC-3生长影响的实验研究

目的 观察阻断MBD1表达后对胰腺癌细胞生长增殖的影响,探讨MBD1在胰腺癌发生发展中的作用.方法 采用RNA干扰技术,构建MBD1-siRNA重组质粒,脂质体介导转染人胰腺癌细胞株BxPC-3,RT-PCR和Western印迹检测转染前后MBD1 mRNA与蛋白的表达变化,MTT法检测转染前后BxPC-3细胞的生长曲线,将细胞接种于裸鼠,观察转染前后胰腺癌细胞体内移植瘤的生长情况.结果 转染siRNA-MBD1质粒后胰腺癌细胞株BxPC-3 MBD1的mRNA与蛋白表达水平明显降低.MTT法检测细胞的生长曲线,发现转染组较转染空质粒组和未转染组生长明显缓慢(P<0.01);体内实验显示,将转染前后的细胞接种于裸鼠,转染组移植瘤生长速度明显较其他两组减慢(P<0.01),RT-PCR检测移植瘤MBD1mRNA表达的变化,转染组中未能测到明显的MBD1表达.而转染组中CDH1、Rb等抑癌基因mRNA的表达明显高于转染空质粒组和未转染组.结论 通过RNA干扰技术,可在转录和翻译水平降低MBD1在胰腺癌细胞株BxPC-3中的表达,并能抑制肿瘤细胞的生长,但其作用机制尚不清楚,MBD1介导的转录抑制作用可能在胰腺癌的发生发展过程中起到重要的作用.     

胰腺癌外周血mdr1及其转录区域结合位点甲基化的检测和临床意义

目的：研究胰腺癌肿瘤组织及外周血有核细胞多药耐药基因1（mdr1）及其转录区域结合位点甲基化的表达及其相关性,探索适用于临床观察多药耐药性变化的有效手段。方法：应用免疫组织化学法和FQ-PCR技术、MSP方法分别检测胰腺癌肿瘤组织及其对应外周血标本中的mdr1的表达和转录区域结合位点甲基化程度,并通过Pearson统计学方法分析两者的相关性。结果：胰腺癌P-gp的表达与mdr1mRNA表达明显相关,并与mdr1基因转录区域结合位点甲基化程度显著相关。外周血中mdr1及其转录区域结合位点甲基化的表达与肿瘤组织中的表达存在显著相关性（P〈0.01）。结论：mdr1转录区域结合位点的甲基化与胰腺癌的多药耐药性密切相关;检测外周血mdr1及其甲基化的表达可动态监察胰腺癌病人化疗前后多药耐药性的变化,为临床治疗方案的决择提供依据。     

利用基因芯片和RT-PCR检测MBD1在胰腺癌中的表达

目的:利用基因芯片和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析胰腺癌中甲基化CpG结合域蛋白MBD1mRNA的表达;探讨MBD1调控胰腺癌基因异常转录表达的分子机制。方法:利用含18000个cDNA克隆的芯片,对3份胰腺混合标本样品(来自2例正常胰腺组织和4例中分化胰腺癌标本)进行基因表达谱对比分析研究;通过RT-PCR验证阳性结果;并进一步检测MBD1在4对胰腺癌和癌旁组织中的表达。结果:两份混合癌组织样品分别有1484和1353条差异表达基因,包括抑癌基因、细胞周期蛋白基因、生长因子及其受体基因、信号传导相关基因、转录调节因子基因等,其中同为上调表达的102条基因中MBD1差异最为显著,而甲基化相关基因如上皮细胞钙黏蛋白CDH1、视网膜母细胞瘤Rb和E2F转录因子5E2F5则呈下调表达,与RT-PCR验证结果一致。MBD1在胰腺癌中的表达明显高于癌旁组织(P<0.01)。结论:基因芯片技术为分析胰腺癌相关基因表达谱提供了有力的工具。MBD1在胰腺癌中的表达高于正常和癌旁组织。MBD1可能是多个甲基化相关抑癌基因转录表达下降的关键调控点。     

MDR1 siRNA对胰腺癌细胞株BxPC-3耐药性影响的实验研究

目的：观察阻断多药耐药基因1（MDR1）表达后胰腺癌细胞对化疗药物敏感性的变化,探索提高胰腺癌化疗疗效的新方法。方法：采用RNA干扰技术．构建MDR1 siRNA重组质粒．脂质体介导转染人胰腺癌细胞株BxPC-3,并筛选稳定转染细胞克隆,RT-PCR和Western印迹法检测MDR1 mRNA和蛋白的表达变化。将细胞接种于裸鼠,观察移植瘤对化疗药物吉西他滨敏感性的变化。结果：转染MDR1 siRNA质粒后胰腺癌细胞株BxPC-3 MDR1 mRNA与蛋白表达水平明显降低。体内实验结果显示,将转染前后的细胞接种于裸鼠,转染组移植瘤对化疗药物吉西他滨更为敏感（P〈0．05）。结论：通过RNA干扰技术,可在转录和翻译水平降低MDR1在胰腺癌细胞株BxPC-3中的表达,并能提高细胞对化疗药物的敏感性。     

沉默DNMT1和DNMT3b基因对胰腺癌BxPC-3细胞p16|RASSF1A基因启动子甲基化的影响

目的:探讨沉默DNMT1和DNMT3b基因对胰腺癌BxPC-3细胞p16,RASSF1A基因启动子甲基化的影响。方法:将胰腺癌BxPC-3细胞分为5组:DNMT1干扰组(转染DNMT1-siRNA),DNMT3b干扰组(转染DNMT3b-siRNA),双重干扰组(转染DNMT1+DNMT3b-siRNA),阴性对照组(转染阴性siRNA)和空白对照组(转染脂质体)。转染48 h后,应用荧光定量PCR法和Western blot法分别检测细胞中DNMT1和DNMT3b的mRNA及蛋白的表达水平;甲基化特异性PCR法检测p16和RASSF1A基因启动子甲基化。结果:与空白对照组和阴性对照组比较,各干扰组目的基因的mRNA及蛋白表达量均明显降低(均P<0.01)。空白对照组与阴性对照组p16和RASSF1A基因甲基化阳性;DNMT1干扰组和双重干扰组p16基因甲基化阴性,RASSF1A基因部分甲基化;DNMT3b干扰组p16基因部分甲基化,RASSF1A基因甲基化阳性。结论:DNMT1单干扰对胰腺癌BxPC-3细胞p16和RASSF1A基因的去甲基化作用优于DNMT3b单干扰,DNMT1和DNMT3b双重干扰无明显的协同效应;提示DNMT1是胰腺癌去甲基化治疗的一个有效靶点。     

甲基化结合域蛋白1调控内质网分子伴侣GRP78对胰腺癌侵袭转移的影响

目的 观察甲基化结合域蛋白1( MBD1)和葡萄糖调节蛋白78( GRP78)在胰腺癌侵袭转移中的作用.方法 检测毒胡萝卜素(Tg)处理后的BxPC-3细胞GRP78的表达及细胞迁移能力的变化;对MBD1-siRNA转染后的BxPC-3细胞MBD1和GRP78的表达、细胞侵袭能力的变化进行分析;免疫组织化学法检测40例胰腺癌组织和15例正常胰腺组织中MBD1和GRP78的表达.结果 Tg处理BxPC-3细胞后,GRP78表达明显上升,细胞的迁移能力增加;MBD1 -siRNA转染Bxpc-3细胞后,MBD1和GRP78的表达同时下降,细胞侵袭力减弱;MBD1和GRP78在胰腺癌中的表达明显高于正常胰腺组织(P＜0.05),两者的阳性表达呈正相关(r =0.594,P＜O.01),并均与淋巴结转移有关(P＜0.05).结论 GRP78可能受到MBD1的甲基化调控,并与胰腺癌的侵袭转移有关.     

黑色素瘤缺乏因子2通过磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路调控胰腺癌细胞增殖、凋亡的作用机制

目的探讨黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)对胰腺癌恶性细胞生物学行为的影响及其作用机制。方法通过慢病毒转染技术构建AIM2稳定过表达的胰腺癌细胞株BxPC-3和PANC-1, 并分别通过定量反转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)验证AIM2的mRNA及蛋白水平。通过BrdU增殖实验、划痕实验、Transwell侵袭实验、细胞凋亡以及细胞周期实验检测过表达AIM2对胰腺癌细胞株功能的影响。通过转录组测序探究AIM2在胰腺癌中的作用机制并进行验证, 使用基因表达差异分析评估多组样本之间的差异, 组间差异采用t检验分析。结果慢病毒转染可成功构建AIM2稳定过表达的胰腺癌细胞株。BrdU增殖实验结果表明, BxPC-3和PANC-1细胞LV-AIM2-OE组的增殖能力显著低于LV-NC组(吸光度值:0.502±0.006比0.543±0.005、0.956±0.032比1.235±0.091, t=5.568、2.903, P<0.05);划痕及Transwell实验结果表明, 过表达AIM2后BxPC-3、PANC-1细胞的迁移[(51.960±4...     

缺氧及沉默缺氧诱导因子-1α对BxPC-3细胞中RUNX3基因表达的影响

目的 观察缺氧及应用小干扰RNA (siRNA)沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因对胰腺癌细胞株BxPC-3中RUNX3基因表达的影响.方法 构建人RUNX3基因真核表达载体质粒pEGFP-RUNX3,CoC12化学模拟肿瘤缺氧环境,检测缺氧以及siRNA沉默HIF-1α对BxPC-3细胞中RUNX3基因在mRNA和蛋白水平的影响.结果 缺氧能使BxPC-3细胞中RUNX3基因的表达较常氧时显著升高[表达为(9.13±1.55),P＜0.05],siRNA转染BxPC-3细胞后能显著下调HIF-1α蛋白表达(抑制率90％),并导致RUNX3基因的表达也受到明显抑制.结论 缺氧促使BxPC-3细胞中HIF-1α在蛋白水平表达升高,缺氧时HIF-1α能上调RUNX3基因的表达水平.     

甲基化CpG结合域蛋白1在胰腺癌组织中的表达和意义

目的：检测甲基化CpG结合域蛋白I（MBD1）蛋白在胰腺癌组织中的表达，并探讨其临床意义。方法：应用S-P免疫组织化学法检测38例胰腺癌、17例胰腺癌旁组织、8例胰腺良性肿瘤、3例慢性胰腺炎和6例正常胰腺组织中MBD1蛋白的表达。结果：MBD1在胰腺癌组织、正常胰腺组织、胰腺良性肿瘤、胰腺癌旁组织中的表达阳性率分别是76．32％（29/38）、16．67％（1／6）、25．0％（2／8）、29．41％（5／17），3例慢性胰腺炎标本中未见表达；胰腺癌阳性表达率明显高于正常胰腺、慢性炎症、良性肿瘤和癌旁对照组织（P〈0．05）。MBD1表达水平的高低与病人的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度和TNM分期无显著性差异（P〉0．05）；而与淋巴结转移密切相关，有淋巴结转移者胰腺癌组织MBD1的表达阳性率为92．31％（24／26），高于无淋巴结转移者的41．67％（5／12）（P〈0．01）。结论：胰腺癌中MBD1呈高水平表达，并与胰腺癌的高转移侵袭活性有关，其机制可能与MBD1介导抑制多个甲基化相关抑癌基因的表达有关。MBD1的转录调控机制有待进一步研究。     

反义MBD1基因真核表达载体转染对人胆管癌细胞MBD1基因表达的影响

目的：探讨反义MBD1基因真核表达载体转染对人胆管癌QBC 939细胞中MBD1基因表达的影响，为进一步研究该基因的作用提供依据。方法：构建反义MBD1基因真核表达载体，通过脂质体转染入人胆管癌细胞株QBC 939中，以G418进行筛选得到稳定转染细胞株，用PCR鉴定外源性neoR基因在转染细胞中的表达以确定转染成功。半定量RT PCR观察转染前后MBD1基因mRNA水平的变化，流式细胞术检测转染前后MBD1蛋白的变化。 结果：人胆管癌QBC 939细胞中MBD1基因的mRNA水平从0.912±0.022降低至0.215±0.017，转染前后的差异有显著性(P＜0.01)；MBD1蛋白水平从(80.19±5.05)％降低到(35.11±4.05)％，转染前后的差异有显著性(P＜0.01)。 结论：反义MBD1基因转染能降低人胆管癌QBC 939细胞中MBD1基因的表达水平，提示MBD1基因在胆管癌的发生发展中具有重要作用，反义MBD1基因转染有可能成为胆管癌治疗的一种新方法。     

短发夹RNA/mdr1表达载体的构建及体外表达

目的构建短发夹RNA(shRNA)/mdr1的质粒表达载体并验证其体外表达效率。方法按照pSUPER的设计要求合成mdr1基因RNAi靶序列的64 bp寡核苷酸序列,退火后双酶切法(BglⅡ和HindⅢ)克隆,得到质粒pSUPER-shRNA/mdr1,转染感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆,测序证实后扩增培养并提取,然后转染融合达90%以上的HepG2/mdr1细胞,阴性载体为对照组,实时聚合酶链反应(Real—time PCR)、流式细胞术检测mdr1基因mRNA、P-gP表达、细胞耐药性等功能变化。结果成功构建质粒载体pSUPER-shRNA/mdr1,基因测序证实靶序列插入正确; HepG2/mdr1-si组mdr1基因的mRNA表达水平是耐药株HepG2/mdr1组的56分之一;HepG2/mdr1-si组细胞和阴性对照组HepG2/mdr1细胞的P-gp表达率分别为11.0%和98.6%,P<0.05; HepG2/mdr1组细胞耐药倍数从62.5下降到1.4,相对逆转效率99.34%;细胞内DNR累积量也明显增加,与对照组比较(79.32%比37.96%),P<0.05。结论多药耐药基因mdr1质粒表达载体pSU- PER-shRNA/mdr1能在HepG2/mdr1内稳定表达,并逆转其耐药性。