高表达蛋白hSav1对人胚肾HEK293增殖能力的影响

目的 观察高表达人Salvadorl(hSav1)蛋白对人胚肾293(HEK293)细胞增殖的影响.方法 构建含有绿色荧光蛋白(GFP)的hSav1质粒GFP-N1-hSav1;将构建好的GFP-N1-hSav1质粒在脂质体Lipofectamine 2000的介导下转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察质粒转染效率;分别在转染后12、24、36、48 h通过噻唑蓝(MTT)比色法计算细胞增殖抑制率,抑制率=[(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)×100%;转染后36 h加入5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU),通过其掺入比率来显示hSav1对细胞增殖的影响.结果 质粒GFP-N1-hSav1构建成功,转染效率为70%-80%左右,蛋白hSav1明显高表达;MTT结果显示转染质粒后12、24、36、48 h,高表达蛋白hSav1组的细胞增殖抑制率分别为2%、5%、15%、23%,而阴性对照分别为2%、3%、2%、2%;BrdU结果显示,在HEK293细胞中高表达蛋白hSav1后细胞增殖抑制率为(27.3±3.8)%,阴性对照组的细胞增殖抑制率为(12.9±5.3)%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 在人胚肾HEK293中高表达蛋白hSav1可明显抑制细胞增殖能力.     

高表达蛋白hSav1对人胚肾HEK293增殖能力的影响

Objective To elucidate the effects of human Salvador 1 (hSav1 ) on cell proliferation of human embryonic kidney cell line HEK293. Methods The plasmid CFP-N1-hSav1 was constructed and transfected into HEK293 cells with lipofectamine 2000. The transfection efficiency was detected by fluorescent microscopy. The effects of hSav1 on cell proliferation were measured by MTT and BrdU incorporation. Results The transfection efficiency was about 70% -80%. The MTT results showed that the inhibition rate of cell proliferation in transfected group at the 12th, 24th, 36th, and 48th h was 2% , 5% , 15% , and 23% , respectively;while that in the control group was 2% , 3% , 2% , and 2% respectively. The BrdU incorporation revealed that the BrdU incorporation rate in transfected group (12. 9 ±5. 3)% was significantly lower than in control group (27.3±3.8)% (P<0.05). Conclusion hSav1 is a newly identified protein that can cause cell proliferation inhibition in HEK293 cells.     

镉通过作用于细胞线粒体诱导人胚肾细胞（HEK）293发生Caspase依赖和非依赖的细胞凋亡

镉（Cd）无论是在体内还是在体外实验都证明对肾脏有毒性，同时其肾脏毒性与其诱导细胞发生凋亡有关，但其内在机制仍不清楚。本研究评价了镉对HEK-293细胞的效果及探讨镉所诱导发生细胞凋亡的相关内在机制。MTT结果、细胞形态学的改变以及DNA片断化的分析表明了30-60μM的镉确实诱导了细胞发生凋亡，而120μM的镉则主要引起了细胞的坏死。     

原代人胚成肌细胞体外培养增殖及分化特性

目的 分离培养人胚胎成肌细胞,观察原代细胞体外增殖与分化特性。方法 选择健康妇女损赠的胎儿骨骼肌标本,参照Blau等的胰蛋白酶与胶原酶混合、多步消化法分离成肌细胞。经美速贴壁法纯化后,在含20％胎牛血清的生长培养基中培养,以生长曲线评价及其增殖情况;含5％胎牛血清的融合培养基中培养,以磷酸肌酸激酶－MM型合成量及成肌细胞融合率评价及其分化能力。通过光镜、透射电镜、免疫细胞化学方法（小鼠抗人肌球蛋白单克隆抗体）鉴定所得细胞。结果 电镜下可见所得细胞含大量游离核糖体,肌球蛋白免疫细胞化学染色强阳性,能合成磷酸肌酸激酶,能融合形成肌小管,证明其为骨骼肌成肌细胞。在生长培养基中原代细胞倍增时间为4．8天,在融合培养基作用下,肌小管融合率及磷酸肌酸激酶合成量明显增加。结论 多步酶消化法与差速贴壁法能获得足量、纯净成肌细胞,所得细胞增殖能力强,能表达骨骼肌特异的收缩蛋白;融合培养基能促进其体外分化。     

17-β雌二醇对人胚肾成纤维细胞生物特性的影响

雌激素作为一种多功能的自分泌和旁分泌激素具有生殖功能以外的重要生理作用［１］。雌激素可抑制肾小球系膜细胞合成和分泌胶原,减少系膜基质的聚集,限制肾小球硬化的发展［２］。在间质纤维化的发展过程中,肾成纤维细胞（ｋｉｄｎｅｙ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ,ＫＦＢ）的增殖起着决定性作用［３］。１７－β雌二醇（１７－β ｅｓｔｒａｄｉｏｌ,Ｅ２）对肾脏病的进展可能具有良性作用,其对ＫＦＢ的影响尚未见报道。本试验拟在细胞水平,观察Ｅ２对ＫＦＢ增生、凋亡及细胞外基质成分（ＥＣＭ）之一的纤连蛋白（Ｆｎ）表达的影响。 一…     

ptsA58H质粒转染人胚腱细胞的增殖特性及端粒酶活性分析

目的 分析体外长期传代ptsA58H质粒转染人胚腱细胞的增殖能力及端粒酶活性。方法 选用连续传代培养的第40代、第70代、第75代转化人胚腱细胞,免疫组化染色观察细胞分泌胶原类型,比较细胞生长曲线,并行染色体核型分析,流式细胞术检测细胞增殖周期,提取细胞总RNA,RT－PCR二步法检测细胞我端粒酶逆转录酶mRNA表达。结果 转化人胚腱细胞传代至70代以后,细胞形态发生改变,出现复制哀老现象。细胞具有正常分泌Ⅰ型胶原的能力,转化人胚腱细胞染色体呈异倍性（2n=94）。转化人胚腱细胞无人端粒酶逆转录酶mRNA特异扩增带,无端粒酶活性表达。结论 单纯SV40转染不能使人胚腱细胞永生化,同时也说明转化人胚腱细胞无恶性转化倾向。     

肾癌特异相关基因GYLZ-RCC18的表达及对肾癌细胞生长及增殖活性的影响

目的 通过检测肾癌相关新基因GYLZ－RCC18（基因号：BE825133）在肾癌中的表达特点及其对肾癌细胞生长、增殖的影响，探讨GYLZ－RCC18基因的功能及其在肾癌发生发展中的作用。方法 应用逆转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）的方法检测肾癌相关基因GYLZ－RCC18在31例肾癌标本中的表达特点；观察GYLZ－RCC18反义寡核苷酸对肾癌细胞生长、增殖活性、形态学的影响。结果 GYLZ－RCC18基因在肾癌组织特异表达，正常肾组织较肾癌组织低表达或不表达，两者表达量差异为1－9倍。GYLZ－RCC18基因的表达在高分级、高分期肾癌明显高于低分级、低分期肾癌；导入GYLZ－RCC18反义寡核苷酸后，可明显抑制癌细胞的生长和增殖活性，并减少分期肾癌，导入GYLZ－RCC18反义寡核苷酸后，可明显抑制癌细胞的生长和增殖活性，并减少GRC－1细胞的核分裂。结论 GYLZ－RCC18是肾癌组织相对较特异表达的新基因，它的高表达与肾癌发生发展以及生长、增殖密切相关，它的成功克隆为阐明肾癌发生发展的分子生物学机制开辟了新的途径，为今后肾癌的特异诊断，基因治疗提供了新的理论依据。     

依普拉芬对鸡胚成骨细胞的增殖和分化的影响

目的 建立鸡胚额骨成骨细胞的培养方法,研究依普拉芬对其成骨细胞增殖和分化功能的影响。方法 采用混合胶原酶和胰酶、两次消化的方法,获取成骨细胞,经培养传代,取状态良好的第3代细胞在96孔板上进行增殖率和碱性磷酸酶活性的测定。结果 消化培养的细胞具有明显的成骨细胞的特点:属于成纤维目细胞型、碱性磷酸酶黑染、基质前体红染,长期培养能形成矿化结节。应用依普拉芬后发现10-4mol/L IP可抑制成骨细胞增殖,而10-8moL/L对改善成骨细胞的增殖和分化有显著功效(P<0.01),小于10-10mol/L浓度的IP则对成骨细胞与对照组无差异。结论 酶混合消化可以得到较纯的成骨细胞,应用依普拉芬研究表明,适宜浓度的IP可促进鸡胚额骨成骨细胞增殖和分化,提高其碱性磷酸酶活性,增强成骨细胞矿化,促使骨形成。     

过氧化物酶体增殖物活化受体γ激动剂对人肾间质成纤维细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)激动剂在抗肾间质纤维化方面的潜在作用.方法原代培养正常人肾间质成纤维细胞(HFB),PPARγ配体15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)和PPARγ激动剂TZDs(曲格列酮和齐格列酮)作用细胞24至72 h.应用台盼蓝染色进行活细胞计数,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测细胞增殖情况,应用流式细胞技术检测细胞凋亡和细胞周期.结果在PPARγ激动剂作用下,HFB的活细胞数较对照组明显减少(P＜0.05).MTT检测发现PPARγ激动剂能明显抑制H邝细胞增殖(P＜0.05).流式细胞技术检测,PPARγ激动剂处理组细胞凋亡明显,与对照组比较差异有显著性意义.凋亡率分别是对照组(3.49±0.60)%,15d-PGJ2组(14.07±0.24)%,齐格列酮组(13.46±0.81)%,曲格列酮组(14.78±1.17)%,与对照组比较,各用药组P分别＜0.01,＜0.01,＜0.05.PPARγ激动剂处理48～72 h后用流式细胞仪观察到G0/G1细胞数明显增加,与对照组比较差异显著(P均＜0.01).结论PPARγ激动剂可以促进HFB细胞凋亡,通过G1期停滞抑制其增殖,提示PPARγ可能作为防止肾间质纤维化的一个潜在的治疗靶目标.     

姜黄素抑制人肾癌细胞769-P增殖及促凋亡的实验研究

【摘要】 目的 分析不同浓度姜黄素（curcumin，分子式C₂₁H₂₀O₆）对人肾癌细胞769-P的生物学作用及其调控机制。方法 体外培养人肾癌细胞769-P，用不同浓度姜黄素处理24 h后，采用MTT比色法测定姜黄素对细胞的增殖抑制作用，利用倒置显微镜观察细胞的显微形态结构，采用细胞划痕法观察细胞的迁移情况；Western Blot 法检测细胞内Caspase-3、 AIF蛋白质的表达情况；用反转录PCR法检测AIF、Bax mRNA的表达水平。结果 MTT法检测显示姜黄素能显著抑制人肾癌细胞系769-P的增殖，呈现浓度和时间效应关系；倒置显微镜结果显示姜黄素能够使肾癌细胞系的形态学发生改变，呈现出典型凋亡特征如核皱缩、核破裂、核肿胀等形态；细胞划痕实验显示，姜黄素抑制了肾癌细胞系的迁移；RT-PCR实验显示，姜黄素促进了BAX mRNA和AIF mRNA的表达；蛋白杂交实验显示，姜黄素促进了Caspase-3和AIF蛋白的活化，从而促进了凋亡。结论 姜黄素能显著抑制人肾癌细胞的增殖并促进其凋亡，这种生物学效应可能与激活Bax和AIF表达，活化Caspase-3的信号通路有关。     

Expression of embryonic stem cell markers in cultured JKT-1, a cell line derived from a human seminoma

Testicular germ cell tumours (TGCTs), the most frequent solid tumour of the young men, originate from the primitive germ cells. They share some pluripotency stem-cell markers which may help to distinguish between seminoma, the most frequent TGCTs and non-seminoma tumours, such as embryonal carcinoma, teratocarcinoma or choriocarcinoma. Due probably to the propensity of seminoma to apoptosis, only two cell lines originated from pure testicular seminoma, TCam-2 and JKT-1 have been up to now, established, maintained and proposed as representative models of human testicular seminoma. However, both seem, following recent reports, to be able to drift. Thus, the molecular signature of embryonic stem-cell markers of the JKT-1 cells cultured in our laboratory, were studied by RT-PCR, Western blot and immunofluorescence (IF). JKT-1 cells analysed after 30 passages, expressed placenta alkaline phosphatase but not alphafoetoprotein (αFP) nor beta-human chorionic gonadotropin. JKT-1 cells also expressed markers of pluripotency such as NANOG and OCT3/4 and more specific seminoma markers, such as AP2γ and HIWI. However, protein expression of OCT3/4 and AP2y was weak and these JKT-1 cells expressed SOX2, a marker of embryonal carcinoma and did not express c-KIT usually expressed in most seminoma. Possible derivation through in vitro culture conditions was supported by looking at later passages (61) which showed a decrease of NANOG and HIWI protein expression. JKT-1 cells express a signature of markers which is still near from the one express by seminoma cells, allowing carcinogenetic studies. However, because of their great ability to drift as shown for TCam-2, it is recommended to verify and to precise this molecular signature before reporting functional results.     

表达肾癌G250基因和hGM-CSF基因HEK293细胞系的建立

目的 建立稳定表达肾癌G250基因与基因佐剂hGM-CSF基因编码蛋白的的HEK293细胞系。方法 通过脂质体转染的方法,将表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的双顺反子pIG250-GM真核表达质粒导入HEK293细胞中;经持续G418压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系;用免疫组化、ELISA和Western Blot方法,检测目的蛋白在HEK293细胞中的表达。结果 经600 μg/mL的G418压力筛选后,获得了抗性细胞克隆;免疫组织化学方法检测到表达G250的阳性细胞;ELISA方法检测到pIG250-GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF的表达与空载体对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;Western Blotting方法检测到G250蛋白的表达,分子量约54Ku,与预期大小相符。结论 成功建立可稳定表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的HEK293细胞系,为研究防治肾癌疫苗的免疫应答机制提供了实验基础。     

芸香对人膀胱癌EJ细胞体外作用的研究

目的:探讨芸香对人膀胱癌EJ细胞的作用。方法:MTT法检测EJ细胞生长抑制率;流式细胞仪检测细胞周期改变和免疫组化SP法检测Ki-67蛋白表达的变化。结果:芸香浓度为30、60、90μmol/ml时,EJ细胞的生长受到不同程度的抑制,且具有时间和浓度依赖性。EJ细胞经不同浓度的芸香作用24h后G0/G1期细胞比率明显下降,而G2/M期比率明显上升。EJ细胞Ki-67的阳性率随芸香浓度的增高而下降(P<0.05)。结论:芸香能抑制癌细胞的生长增殖。其机制可能通过诱导癌细胞周期阻滞于G2/M期、下调Ki-67表达有关。     

Effect of curcumin on cisplatin- and oxaliplatin-induced oxidative stress in human embryonic kidney (HEK) 293 cells

Generation of reactive oxygen species (ROS) is involved in the nephrotoxicity of platinum anticancer drugs. This study involved incubation of human embryonic kidney (HEK) 293 cells in cell culture media supplemented with cisplatin or oxaliplatin in the presence or absence of curcumin, a well-studied antioxidant. Thereafter several indices of oxidative stress have been measured, which included glutathione (GSH), total antioxidant capacity (TAC), and antioxidant enzymes [(superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidases (GPX)]. The impact of platinum drugs on cells viability, lipid peroxidation, and lactate dehydrogenase leakage was also examined. The results show that at both acute (60 min) and chronic (24 h) durations of incubation, cisplatin and oxaliplatin induced oxidative stress as evidenced by significant inhibition of the activities of SOD, CAT, and GPX enzymes as well as significant reduction of the concentrations of GSH and TAC. Curcumin ameliorated the oxidative stress induced by these insults by significantly restoring the measured oxidative indices. Our findings provide evidence that curcumin significantly ameliorates oxidative stress induced by both cisplatin and oxaliplatin in HEK cells.     

SET蛋白对精原细胞株GC-1spg增殖和凋亡的影响

目的探讨SET蛋白对精原细胞株GC-1spg增殖和凋亡的影响。方法使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃、5%CO2条件下培养GC-1spg细胞,分对照组(转染无关序列腺病毒)和实验组[转染SET干涉腺病毒(AdH1-siRNA/SET)];GC-1spg接种于96孔板或者6孔板,转染腺病毒48h、72h后收集细胞,免疫荧光和共聚焦激光扫描显微镜检测SET蛋白在GC-1spg细胞中的表达与定位;提取细胞总蛋白,Western Blot检测转染前后SET蛋白的表达;细胞计数试剂盒-8(CCK8)和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记法检测细胞的数目和增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果 SET蛋白表达于GC-1spg细胞的胞核和胞浆中,且胞浆分布多于胞核;转染SET干涉腺病毒后,干涉组GC-1spg细胞中的SET蛋白相对表达量为(0.217±0.044)显著低于对照组的(0.629±0.170)(P0.05),同时GC-1spg细胞的数目减少,增殖减慢,且细胞凋亡率显著增加[干涉组(21.663±1.287)%,对照组(8.813±0.671)%](P均0.01)。结论SET蛋白在精原细胞GC-1spg胞核和胞浆中均有表达,且胞浆分布多于胞核;GC-1spg细胞中SET蛋白表达降低,能够抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,提示SET蛋白可能参与调节精子发生的过程。     

金属硫蛋白1E对胰腺癌SW1990细胞生长的影响

目的 观察外源性人金属硫蛋白1E(MT1E)基因对胰腺癌SW1990细胞生长的影响.方法 构建MT1E基因真核表达载体,转染SW1990细胞并获得阳性单克隆细胞.用Westernblot技术检测转染前后MT1E蛋白表达,噻唑蓝(MTT)实验检测其增殖能力的变化,流式细胞仪分析细胞周期时相分布.同时检测Cyclin D1与p53的表达.结果 MT1E融合蛋白在SW1990MT1E细胞中表达.MTT结果表明,与SW1990和SW1990MT1E空细胞比较,SW1990MT1E细胞增殖速度明显增快.SW1990MT1E细胞与SW1990和SW1990空细胞比较,G0/G1期细胞明显减少,S期明显增多,差异有统计学意义.SW1990MT1E较SW1990空的细胞Cyclin D1与p53表达明显升高.结论 MT1E能够促进SW1990增殖,可能和上调Cyclin D1促使细胞进入S期增多,通过失活p53蛋白使细胞恶性变.     

异丙酚对人肝癌HepG2细胞增殖的影响

目的 评价异丙酚对人肝癌HepG2细胞增殖的影响.方法 将人肝癌HepG2细胞以1×105个/ml浓度接种于96孔培养板中,100 μl/孔,采用随机数字表法,将其随机分为5组(n=33)∶正常对照组(C组)、脂肪乳组(Ⅰ组)、30、60、120 μg/ml异丙酚组(P1-3组),P1-3组分别加入30、60、120 μg/ml异丙酚,Ⅰ组加入10％脂肪乳.于异丙酚孵育24 h时,光学显微镜下观察细胞形态学,分别于异丙酚孵育即刻、24、48、72 h时测定细胞增殖情况,于异丙酚孵育48 h时测定Fas表达.结果 P1组、P2组和P3组细胞数量逐渐减少.与C组比较,Ⅰ组细胞增殖程度升高(P＜0.05),Fas表达差异无统计学意义(P＞0.05),P1～3组细胞增殖程度降低,Fas表达上调(P＜0.05);与P1组或P2组比较,P3组细胞增殖程度降低,Fas表达上调(P＜0.05).结论 异丙酚可呈浓度依赖性抑制人肝癌HepG2细胞增殖,其机制与上调Fas表达有关.     

姜黄素抑制肾癌ACHN细胞增殖及促凋亡的实验研究

目的观察姜黄素对人肾癌ACHN细胞株增殖及细胞凋亡的影响,探讨姜黄素诱导ACHN细胞株凋亡的作用机制。方法不同浓度姜黄素作用人肾癌ACHN细胞24 h后,应用MTT比色法检测姜黄素对人肾癌ACHN细胞的增殖抑制率;流式细胞术检测姜黄素诱导细胞的凋亡率;RT-PCR检测姜黄素对ACHN细胞Bcl-2、Bax、NF-κBP65 mRNA表达的影响;Western blot方法检测其对细胞Bcl-2、Bax、NF-κBP65I、κB蛋白表达的影响。结果姜黄素对人肾癌ACHN细胞有明显的抑制作用,可引起细胞凋亡,并且存在剂量和时间依赖;不同浓度姜黄素作用细胞24 h后,Bcl-2、NF-κBP65 mRNA水平下降,Bax mRNA水平升高(P0.05),Bcl-2、NF-κBP65蛋白表达量下降,BaxI、κB蛋白表达量升高(P0.05)。结论姜黄素通过上调IκB,下调NF-κB活性,调控凋亡基因Bcl-2/Bax的表达,抑制人肾癌ACHN细胞的增殖,诱导人肾癌ACHN细胞的凋亡。