神经生长因子、Noggin基因转染对骨髓间充质干细胞分化的影响

目的 研究外源性神经生长因子(NGF]、Noggin转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可行性,并观察基因修饰的细胞向神经元方向的分化情况.方法 采用贴壁法分离纯化BMSCs,通过细胞表面标志及成脂诱导鉴定细胞.Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin单独及联合转染BMSCs.通过Westernblot、免疫细胞化学观察目的 蛋白表达.通过免疫组化观察转染后BMSCs向神经元方向分化情况.结果贴壁法获得的细胞具有BMSCs表型,能分化为脂肪细胞.未转染组和Ad-GFP转染组少量表达NGF,不表达Noggin.NGF、Noggin单独及联合转染BMSCs均能高效表达目的 蛋白.NGF、Noggin转染的BMSCs可分化为具有神经元形态,并表达神经丝蛋白(NF-H)的细胞,联合转染组NF-H阳性细胞比例最高.结论 贴壁法能有效纯化BMSCs,Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin单独及联合转染BMSCs安全并能高效表达目的 蛋白,NGF、Noggin转染的BMSCs 体外培养能向神经元样细胞方向分化,两种蛋白联合修饰能增强这种分化作用.     

神经生长因子、Noggin基因转染对骨髓间充质干细胞分化的影响

目的 研究外源性神经生长因子(NGF]、Noggin转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可行性,并观察基因修饰的细胞向神经元方向的分化情况.方法 采用贴壁法分离纯化BMSCs,通过细胞表面标志及成脂诱导鉴定细胞.Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin单独及联合转染BMSCs.通过Westernblot、免疫细胞化学观察目的 蛋白表达.通过免疫组化观察转染后BMSCs向神经元方向分化情况.结果贴壁法获得的细胞具有BMSCs表型,能分化为脂肪细胞.未转染组和Ad-GFP转染组少量表达NGF,不表达Noggin.NGF、Noggin单独及联合转染BMSCs均能高效表达目的 蛋白.NGF、Noggin转染的BMSCs可分化为具有神经元形态,并表达神经丝蛋白(NF-H)的细胞,联合转染组NF-H阳性细胞比例最高.结论 贴壁法能有效纯化BMSCs,Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin单独及联合转染BMSCs安全并能高效表达目的 蛋白,NGF、Noggin转染的BMSCs 体外培养能向神经元样细胞方向分化,两种蛋白联合修饰能增强这种分化作用.     

人β-NGF及BDNF基因共转染对大鼠骨髓基质细胞分化的影响

目的 探讨人β-神经生长因子(β-NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)基因共转染对大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)分化的影响. 方法 梯度离心法分离培养大鼠胫股骨骨髓中BMSCs,用Src癌基因同源区3抗体(SH3)的免疫细胞化学染色鉴定BMSCs.按照3μL脂质体/1μg(3 μL)pSVCEP NGF/BDNF-CAT质粒的比例共转染第一代BMSCs,并转染pEGFP-C1质粒作为转染的标记.BMSCs培养4周后,荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达并计算转染率,细胞免疫荧光染色后用激光扫描共聚焦显微镜观察表达产物以及BMSCs分化情况. 结果 体外培养能够获得纯化的原代和传代BMSCs,传代后仍然保持增殖和分化功能;免疫组化SH3染色阳性证实为纯化的BMSCs.人β-NGF/BDNF基因共转染BMSCs后,BMSCs能够稳定和持续表达NGF和BDNF;BMSCs也能表达Nestin、NSE、NF-M和GFAP. 结论 经脂质体介导的外源性目的 基因NGF/BDNF cDNA均能分别和共同在BMSCs中成功表达,基因转染后的BMSCs能诱导分化为神经前体细胞或神经样细胞.     

小鼠骨髓间充质干细胞体外扩增和分化为神经元样细胞的实验研究

目的体外分离和扩增小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),并观察不同方法诱导BMSCs向神经元样细胞分化的差异,以寻找一种效果理想的BMSCs体外诱导方法。方法取昆明小鼠双股骨骨髓,采用全骨髓贴壁法体外纯化扩增BMSCs,流式细胞术检测其表面标志物,并对其进行成脂、成骨诱导鉴定。分别用化学诱导法和共培养法诱导BMSCs分化为神经元样细胞,比较两种方法所获得的神经元样细胞的细胞形态。结果采用全骨髓贴壁法能有效分离小鼠BMSCs,随着传代次数的增加能得到逐渐纯化的BMSCs,而过多的传代次数则出现细胞生长速度缓慢、核固缩、脱离等衰老征象。流式细胞术检测结果显示P4代BMSCs阳性表达CD29和Sca-1,而阴性表达CD11b。具有成脂、成骨诱导分化的能力。共培养法诱导第5天可见神经细胞样形态且细胞突起数量较多并有分支;化学诱导法培养第7天细胞出现较长突起,形成神经样结构。结论采用全骨髓贴壁法能有效分离纯化小鼠BMSCs,通过共培养法诱导BMSCs分化为神经元样细胞效果优于化学诱导法。     

hTERT正、反义表达载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的研究提高和阻断端粒酶活性对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及分化的影响。方法采用直接贴壁法分离、培养SD大鼠BMSCs,流式细胞仪检测BMSCs表面标记。阳离子脂质体介导hTERT正、反义表达载体转染BMSCs,RT-PCR和免疫组化方法检测TERT表达,并对转染前后BMSCs的生长增殖能力、神经细胞方向的分化能力和大鼠颅内移植存活情况进行研究。结果大鼠BMSCs表面CD29、CD44、CD90阳性,CD31、CD34、CD45阴性,转染正义hTERT后BMSCs增殖速度明显提高,而其向神经元和星形胶质细胞诱导分化及异体海马移植后的存活能力未受影响,转染反义hTERT后BMSCs增殖速度减慢,5￣6周内死亡。结论BMSCs存在端粒酶低表达,提高或阻断端粒酶活性对BMSCs的增殖分别起到促进或抑制作用。     

人参皂苷Rg1诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的作用

目的研究人参皂苷Rg1在体外能否诱导Wistar大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。方法通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,人参皂苷Rg1诱导分化,光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达,RT-PCR检测细胞NGF mRNA的表达。结果大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可以在体外大量扩增。人参皂苷Rg1诱导72h后,部分骨髓间充质干细胞（35．57％±3．59％）转变为神经元样细胞,免疫细胞化学染色NSE呈阳性,分化的神经元样细胞可能表达NGF mRNA。结论人参皂苷Rg1可以在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,并且可能表达NGF mRNA。     

4001/转染bFGF基因骨髓间充质干细胞在珊瑚骨表面生长状况

目的：将转染bFGF基因的骨髓间充质干细胞与珊瑚骨的复合培养,观察转染bFGF基因的BMSCs在珊瑚支架材料上生长状况。材料和方法：穿刺抽取新西兰大白兔胫骨骨髓,采用密度梯度离心法分离BMSCs,采用贴壁筛选法对分离出的BMSCs进行纯化,利用脂质体转染bFGF-pcDNA3到BMSCs。取生长良好的转染bFGF基因BMSCs和未转染的BMSCs,分别接种于不同珊瑚表面,采用MTT法观察细胞－支架联合培养BMSCs的增殖情况和利用扫描电镜观察珊瑚支架上细胞的生长状况。结果：MTT法检测显示细胞－支架联合培养转染组细胞与联合培养未转染组细胞增殖相比有统计学差异（P﹤0.05）,联合培养转染组细胞生长增殖强于未转染组细胞。而联合培养的转染组细胞同单纯培养转染组细胞增殖相比无统计学差异（P>0.05）。扫描电镜观察显示复合BMSCs细胞贴附在珊瑚上,并在材料上完全铺展,形态多样,细胞向孔内长入或跨越微孔表面,部分区域有细胞外基质形成。 结论：转染bFGF基因的骨髓间充质干细胞在珊瑚支架材料上生长状况较未转染组好,珊瑚人工骨不影响BMSCs的增殖,可以作为BMSCs支架材料构建组织工程骨。     

神经节苷脂诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的作用的研究

目的探讨神经节苷脂(GM1)诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经细胞的作用。方法通过贴壁法分离大鼠BMSCs,体外扩增3代,加入GM1诱导分化。用倒置显微镜观察诱导分化后BMSCs的形态,免疫组化染色检测其神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。逆转录PCR检测BMSCs神经生长因子(NGF)mRNA和脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA的表达水平,并与胎牛血清(FBS)对照组和空白对照组的BMSCs比较。结果GM1诱导组BMSCs胞体变圆,突起增加,部分突起相互联结成网状,NSE阳性表达细胞为(29.47%±3.26)%,GFAP阳性表达细胞为(2.32±0.18)%,FBS组和空白对照组分别为(6.97±0.56)%和(10.6±0.75)%的细胞NSE表达阳性,(1.41±0.35)%和(1.21±0.35)%的细胞GFAP表达阳性。GM1诱导组NGFmRNA和BDNFmRNA水平显著高于FBS对照组(均P<0.01)和空白对照组(均P<0.05)。结论GM1在体外能诱导BMSCs分化为神经元样细胞。     

多细胞因子诱导成年鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化的实验研究

目的观察大鼠骨髓基质细胞(rBMSCs)的生长特点及诱导条件下分化成神经细胞的能力,并对其机制进行初步探讨。方法以密度梯度离心分离骨髓基质细胞,在神经干细胞培养液中培养,采用四唑盐(MTT)法观察在培养液中添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)对BMSCs增殖的影响;观察添加脑源性神经生长因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)和维甲酸(RA)对rBMSCs的诱导分化情况;采用免疫组织化学法(ABC)检测诱导后的细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经元核蛋白(NeuN)和胶质原性纤维酸性蛋白抗体(GFAP)等特异性标志物的情况;以流式细胞分选确定神经元的比例。结果bFGF和EGF能在体外促进rBMSCs增殖,BDNF、NGF和RA能诱导rBMSCs来源的神经干细胞(NSCs)表达NSE、GFAP等特异性标志物。结论EGF、bFGF、BDNF、NGF、RA及适宜的培养液可使rBMSCs定向转化为NSCs,获得足够的目的细胞,进而分化为神经元样和神经胶质样细胞。     

人参皂苷Rg1对痴呆大鼠脑匀浆中BMSCs的神经性分化作用

目的 研究人参皂苷Rgl对痴呆大鼠脑匀浆中BMSCs的神经性分化作用.方法 通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,观察人参皂苷Rg1及痴呆大鼠脑匀浆对其分化影响,光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达.结果 痴呆大鼠脑匀浆中BMSCs的神经性分化作用受到抑制,人参皂苷Rg1加入72h后,神经元样分化明显,免疫细胞化学染色NSE呈阳性.结论 加入人参皂苷Rg1后,BMSCs在痴呆大鼠脑组织匀浆液中NSE阳性表达率提高.     

Effects of nerve growth factor and Noggin-modified bone marrow stromal cells on stroke in rats

Treatment with bone marrow stromal cells (BMSCs) ameliorates neurological functional deficits after stroke. Nerve growth factor (NGF) is a neurotrophic factor that supports the survival and growth of neural cells. Noggin, an antagonist of bone morphogenetic protein (BMP), promotes the differentiation of stem cells into neurons. In this study, we hypothesize that transfection of NGF and Noggin in BMSC treatment of stroke promotes BMSC neuronal differentiation and improves functional outcome after stroke. Adenovirus was used to trasfect NGF and Noggin and the transfection efficiency was measured by Western blot and immunostaining in vitro. The transfected BMSCs with NGF and/or Noggin were administered intravenously at 5 days after middle cerebral artery occlusion (MCAo) in rats. The neurological functional outcome and BMSC migration and differentiation in the ischemic brain were measured. The transplantation of BMSCs with NGF or Noggin elicited neurological functional improvement, promoted BMSCs present in the ischemic brain, and also up-regulated neuro-like cell differentiation as well as increased synaptophysin expression in the ischemic brain compared with nontreatment control animals (P< 0.05). Treatment of stroke with a combination of transfection of NGF and Noggin in BMSCs induced a synergistic effect on improved neurological functional outcome, BMSCs present in the ischemic brain, and synaptophysin expression in the ischemic brain compared with BMSCs transfected with an NGF- or Noggin-alone group (P < 0.05). These data demonstrate that increasing NGF or Noggin expression in BMSCs contributes to brain plasticity after stroke and that a synergistic effect is induced on the coexistence of NGF and Noggin in BMSCs treatment of stroke.     

慢病毒介导的EphrinB2基因转染大鼠骨髓间充质干细胞表达的实验研究

目的将携带Ephrin B2基因慢病毒转染至骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测其过表达水平及细胞形态学变化,并探讨Eph B4/Ephrin B2是否具有促进大鼠BMSCs体外迁移活性的作用。方法单纯贴壁法分离大鼠BMSCs,倒置显微镜观察细胞生长形态。携带Ephrin B2慢病毒以感染复数3和10感染BMSCs分为低浓度转染组(MOI=3)和高浓度转染组(MOI=10),对照组采用未转染组、阴性转染组,利用q PCR检测Ephrin B2基因表达及Western blot检测Ephrin B2蛋白水平。观察Ephrin B2基因转染后BMSCs形态学变化。15 d后通过免疫荧光检测MAP2表达了解细胞分化。进一步Transwell实验检测细胞迁移能力来了解Eph B4/Ephrin B2在调节干细胞迁移的作用。结果培养BMSCs为多角形或棱形呈漩涡状排列生长。Ephrin B2-BMSCs经q PCR和Western blot检测证实有外源性Ephrin B2表达。Ephrin B2基因转染后BMSCs 24 h,BMSCs胞体开始收缩细胞有突起伸出,72 h后可见典型的神经样细胞形态改变。15 d后,BMSCs分化成为MAP2神经元,与阴性转染组相比,低浓度转染组和高浓度转染组MAP2表达率上升(P0.05)。Transwell实验结果显示:低浓度转染组与高浓度转染组较未转染组及阴性转染组穿膜细胞数量明显增加(P0.05)。结论慢病毒介导Ephrin B2能高效感染BMSCs,并随着时间延长分化成神经样细胞,同时Eph B4/Ephrin B2在调节BMSCs迁移具有重要作用。     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长、定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点。 目的：探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。 方法：将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序。利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆。采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Western-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期。 结果与结论：脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位主要位于胞浆。转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P < 0.05)。提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖。     

重组共表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4转染骨髓间充质干细胞对其成骨分化的影响

背景：在许多情况下,人体组织修复是多因子共同协调作用的结果,因而共表达多基因载体的构建能够满足多因子基因治疗的需要,是近年来基因治疗的新思路。 目的：观察重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后的表达及其对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响,为骨缺损的联合基因治疗奠定基础。 方法：使用全骨髓培养法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志抗原的表达;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒经酶切鉴定后,在脂质体介导下将其转入大鼠骨髓间充质干细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测;茜素红染色检测转染后大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。 结果与结论：流式细胞仪检测显示CD90表达强阳性,CD45表达阴性;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒成功转染至大鼠骨髓间充质干细胞中,并获得有效共表达;转染后第14天,茜素红染色阳性,能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,为骨缺损的联合基因治疗奠定了基础。     

骨形态发生蛋白4和骨形态发生蛋白4/7基因转染对骨髓基质干细胞成骨活性差异的比较**☆

背景：有文献报道骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)异源二聚体比同源二聚体的活性高，目前国内外尚无BMP-4/7异源二聚体与BMP-4同源二聚体间诱导成骨活性比较的报道。 目的：观察不同基因BMP-4、BMP-4/7对骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨活性的差异，探讨融合基因BMP-4/7的生物学活性。 方法：经脂质体转染分离培养的兔BMSCs，G418筛选出稳定表达株，利用RT-PCR法证明目的基因在BMSCs中的表达情况；以BMP-4和BMP4/7融合基因修饰的AAV载体，转染兔BMSCs，MTT法检测不同基因转染细胞的增殖能力；以BMP-4单基因和BMP-4/7融合基因修饰的AAV载体转染兔BMSCs 7 d后，测定两组细胞内碱性磷酸酶及骨钙素水平，观察成骨活性的变化。 结果与结论：实验成功构建高滴度的分别携带BMP-4单基因、BMP-4/7融合基因的重组腺相关病毒载体AAV-BMP-4、AAV-BMP-4/7；RT-PCR结果证明目的基因能够在BMSCs中得到稳定表达。AAV-BMP-4及AAV-BMP-4/7载体转染效率分别为68.20%、72.18%；转染BMSCs后，细胞增殖能力均明显提高，BMP-4/7融合基因的细胞增殖能力活性高于BMP-4单基因。以BMP-4和BMP-4/7融合基因修饰的AAV转染细胞7 d后，细胞内碱性磷酸酶活性明显上调，骨钙素水平升高，成骨活性均增强；两种基因比较，BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因(P < 0.01)。提示BMP-4、BMP-4/7修饰的AAV载体转染效率高，对BMSCs均有成骨活性，其中BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因。     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达**

背景：成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。 目的：观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。 方法：构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。 结果与结论：实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。