人隔蛋白7的真核表达载体的构建及表达

目的构建人隔蛋白7(SEPT7,hCDC10/SEPT7)的表达载体并对U251人脑恶性胶质瘤细胞系进行转染且检测其表达。方法RT-PCR方法扩增SEPT7cDNA片段,并将扩增的片段插入pCDNA3真核表达载体,构建成含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,以脂质体介导该质粒转染人脑恶性胶质瘤细胞系U251,应用RT-PCR和免疫荧光染色鉴定转染细胞中hCDC10/SEPT7的表达。用流式细胞术对转染前后的U251细胞进行细胞周期分析。结果成功构建含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,并使其稳定转染U251细胞,在转染的细胞中,证实有SEPT7mRNA表达上调。细胞周期检测结果G0/G1期细胞增多,SPF降低。结论成功构建SEPT7表达载体,并在人脑恶性胶质瘤细胞系获得表达,延迟细胞周期进展。     

软组织平滑肌肉瘤中细胞周期蛋白D1基因扩增分析及蛋白表达检测

我们采用差异聚合酶链反应 (ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＰＣＲ ,ＤＰＣＲ)检测软组织平滑肌肉瘤 (ＬＭＳ)中细胞周期蛋白Ｄ1(ｃｙｃｌｉｎＤ1)基因ＣＣＮＤ1的扩增情况 ,并应用免疫组织化学方法检测ｃｙｃｌｉｎＤ1表达 ,以期了解二者的关系。一、材料与方法1.标本 :38例ＬＭＳ、10例平滑肌瘤和 10例正常平滑肌组织取自本院病理科 1989～ 1998年存档蜡块 ,肿瘤发生部位包括躯干、四肢、腹腔和腹膜后 (胃肠道除外 )。2 .ＤＰＣＲ :多巴胺受体基因 (ｄｏｐａｍｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒＤ2 ,ＤＲＤ2 )与ＣＣＮＤ1基因同位于 11号染色体的长臂上 (…     

t-PA基因新型真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)基因的新型真核表达载体,为血栓性疾病的基因治疗奠定基础。方法将tPA基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1MycHisB()中,进行酶切鉴定及DNA测序分析,并将携带有tPA基因的该真核表达载体,通过脂质体介导,转染鼠血管平滑肌细胞,底物发色法测定转基因血管平滑肌细胞tPA活性。结果经双酶切鉴定和测序证实已将tPA基因DNA片段正确插入到真核表达载体中,并能在真核细胞中表达、分泌有活性的tPA。结论成功构建pcDNA3.1MycHisB()/tPA基因新型真核表达载体。     

人RASSF1A基因的真核表达载体的构建及其表达

目的 通过构建人RASSF1A基因的真核表达载体,为研究其在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞、细胞增殖抑制等方面奠定基础.方法 采用RT-PCR从人外周血的单个核细胞RNA中扩增出人RASSF1A基因的全长cDNA,利用DNA重组技术将其插入到真核表达栽体pcDNA3.1(+)中获得重组质粒.利用脂质体将重组质粒转染入人鼻咽癌细胞株CNE-2中,采用RT-PCR.westem-blot检测RASSF1A的瞬时表达.结果 酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF1A基因已被完整、正确地插入到pcDNA3.1(+)质粒载体中,RT-PCR及Western-blot结果显示转染细胞的RASSF1A表达水平上调.结论 成功构建了RASSF1A基因的真核表达栽体pcDNA3.1(+)/RASSF1A.     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western...     

Trim6真核表达载体的构建及表达

目的:构建人Trim6的真核表达载体pcDNA3.1(+ )-Trim6,并观察其在HEK293T细胞中的表达.方法:提取HeLa细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增出Trim6编码区全长基因片段,克隆到pcDNA3.1(+),通过酶切、菌落PCR及测序进行鉴定.将该载体转染HEK293T细胞,用蛋白印迹检测Trim6蛋白的表达.结果:通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建人Trim6表达载体,该载体可以在HEK293T细胞细胞系中表达Trim6.结论:构建Trim6真核表达载体pcDNA3.1(+)-Trim6,为研究Trim6在固有免疫应答中的作用奠定了基础.     

CIP-KIP细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子家族

细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(CKI)是细胞周期调控网络的主要成员之一,在周期调控中具有重要的地位,CIP-KIP是CKI两个家族之一,与细胞生长分化和肿瘤发生方面有极其重要的关系。本文对CIP-KIP家族的细胞周期调控、基因敲除以及促CDK/CychnD装配功能的最新进展进行综述。     

重组pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体的构建与鉴定

背景：腺病毒临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。 目的：将人骨形态发生蛋白9的cDNA构建于pcDNA4 His/Max,得到重组真核表达载体pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9。 方法：将已有的Padtrack-cmv-人骨形态发生蛋白9进行PCR扩增,电泳回收人骨形态发生蛋白9片段,将pcDNA4 His/Max用Not Ⅰ和KpnⅠ双酶切,得到pcDNA4 His/Max酶切片段,连接人骨形态发生蛋白9和pcDNA4 His/Max片段得到重组质粒pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9,将该载体用DH5α转化,阳性克隆扩增及纯化、序列分析鉴定。 结果与结论：通过PCR及序列分析证明pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体的人骨形态发生蛋白9基因长度为1.3 kb,与报道的人骨形态发生蛋白9全长序列一致,无突变。结果证实,实验成功构建了pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体。     

人生长激素基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人生长激素的真核细胞表达载体,测定并分析目的 基因序列.方法 用PCR方法扩增出人生长激素基因,连接至T克隆载体,然后分别亚克隆至真核细胞表达载体pCDNA3.1、pCEP4中.使用DNA ssist软件分析序列.结果 所构建真核表达载体的酶切鉴定、PCR鉴定、测序鉴定均正确.结论 成功构建出多个人生长激素基因真核细胞表达载体,验证了基因序列的正确性,为下一步基因治疗研究打下基础.     

人骨形成蛋白2基因克隆及真核表达载体的构建

在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因并获得真核表达载体。由人成骨瘤细胞中提取总RNA，利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA；将此基因片段重组到pGEM-T克隆载体中，转化到大肠杆菌DH5α后，蓝白斑筛选阳性克隆，利用限制性酶切、PCR扩增和核苷酸序列分析鉴定重组质粒；将pGEM-T克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体中，用限制性酶切和PCR扩增鉴定重组质粒。结果表明：重组在两种质粒中的基因片段为人骨形成蛋白2基因全编码序列。克隆获得人骨形成蛋白2基因．并得到此基因的真核表达载体，为人骨形成蛋白2的表达打下了基础。     

小鼠凋亡相关新基因PNAS-4真核表达载体的构建、表达及体外抗肿瘤作用

目的：对小鼠凋亡相关新基因PNAS-4（mPNAS-4）进行克隆，构建其真核表达载体，并在小鼠Lewis肺癌细胞系LL2中转染表达；探讨mPNAS-4基因转染LL2细胞过表达所诱导的体外肿瘤细胞凋亡情况。方法：用RT-PCR从小鼠肝脏组织中克隆mPNAS-4编码区cDNA，构建重组真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4；用脂质体将pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞；用RT—PCR检测转染细胞中mPNAS-4的过表达情况；通过MTT、流式细胞术（FCM）及DNA Ladder分别检测转染细胞的增殖与凋亡情况。结果：从小鼠肝脏组织中克隆到mPNAS-4全长cDNA并成功构建其真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4，转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞可使其mRNA表达明显上调。mPNAS-4过表达能抑制LL2细胞增殖并诱导其凋亡。结论：mPNAS-4过表达对小鼠Lewis肺癌LL2细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用。     

真核基因的“非忠实”表达

自从50年代DNA的双螺旋结构问世以来,Crick的另一个重大贡献就是提出了遗传信息传递的“中心法则”,即储存在DNA中的遗传信息除能在细胞周期中进行自身复制以外,还能通过信使核糖核酸mRNA的传递,再将信息在核糖体内转译成特定的蛋白质,这也就是所谓遗传信息由DNA→RNA→蛋白质的传递规律。随后法国的Jacob与Monod首次证实了细菌中乳糖操纵子的调控机制,从而开始了基因调控机制研究的新纪元。直到60年代末期Tamin和Baltimore在病毒的研究中分别发现了能以RNA做为模板合成DNA的逆转录酶,为遗传信息     

携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体构建、转染及活性鉴定

目的 构建携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体并转染人脐静脉内皮细胞,鉴定所表达蛋白活性。方法 从pMD18-T-PRKCB1质粒中,扩增出人PRKCB1并与带有增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pReceiver-M29酶切后连接、转化,所获重组体酶切鉴定及测序。按优化的转染参数,将pReceiver-M29-PRKCB1转染人脐静脉内皮细胞,观察荧光蛋白表达,随机视野下计数转染效率。测定激光共聚焦显微镜下胞膜与胞质的荧光强度比值,鉴定其活化转位。结果 构建的真核表达质粒测序与GenBank公布的序列一致。转染后48h,荧光蛋白表达最佳,转染率为18.6%±1.6%。从胞膜与胞质的荧光强度比值,观察到蛋白的活化转位。结论 成功构建真核表达质粒并转染人脐静脉内皮细胞,观察到绿色荧光蛋白表达及蛋白的转位,为筛选稳定表达人蛋白激酶C 2的内皮细胞株,及其蛋白复合体分离提供分子工具。     

人SYNOVIOLIN基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建携EGFP的人SYNOVIOLIN基因真核表达载体。方法：应用基因重组技术,根据人SYNOVIOLIN基因序列和表达载体pIRES2-EGFP质粒上的多克隆位点设计引物,对含有SYNOVIOLIN基因的质粒pCDNA3-syno扩增,得到约1900 bp的目的片段,进行T-A克隆。SalⅠ/BamHⅠ双酶切测序正确的重组质粒,回收SYNOVIOLIN cDNA片段,将其亚克隆于pIRES2-EGFP载体的多克隆位点内得到质粒pIRES2-EGFP-syno。脂质体法转染HEK293细胞, 用激光共聚焦显微镜和Western blot检测EGFP和SYNOVIOLIN在HEK293细胞的表达。结果：PCR,酶切及测序结果表明pIRES2-EGFP-syno真核表达载体构建成功,激光共聚焦显微镜和Western blot显示EGFP和SYNOVIOLIN蛋白在HEK293细胞中成功表达。结论：成功构建pIRES2-EGFP-syno真核表达载体并在HEK293细胞表达,为抗肌腱粘连的　SYNOVIOLIN基因治疗研究奠定基础。     

人组蛋白H3真核表达载体的构建及功能初步检测

目的构建带myc标签的人组蛋白H3基因真核表达载体,获得Myc-H3融合表达蛋白,并对其功能进行初步检测。方法采用PCR技术从乳腺文库中扩增人H3基因编码序列,将其正确插入pXJ-40-myc载体,重组质粒转染人胚肾293T细胞,Western blot法检测融合蛋白表达,通过免疫共沉淀技术检测融合蛋白与已知结合蛋白组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶(LSD1)和组蛋白甲基转移酶(EZH2)的相互作用。结果构建得到组蛋白H3基因的真核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;经Western blot法检测,融合蛋白成功表达;免疫共沉淀检测证实Myc-H3融合蛋白可以和已知相互作用蛋白LSD1及EZH2相互作用。结论成功构建组蛋白H3真核表达载体,该融合蛋白正确表达。     

人CD226分子胞膜外区D1和D2真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的 构建含有人CD226分子胞膜外区结构域1(D1)和结构域2(D2)的真核表达载体,表达并纯化重组蛋白.方法用特异性引物分别扩增CD226 D1和D2的基因,定向插入真核表达载体pSecTag2B-Fc,进行酶切和DNA测序鉴定,重组质粒瞬时转染293T细胞,收集上清,纯化蛋白及SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果利用PCR方法克隆出CD226胞膜外区D1和D2的基因,并正确插入pSecTag2B-Fc载体中,真核表达载体瞬时转染293T细胞,Western blot结果证实转染293T细胞的培养上清液中含有hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc融合蛋白,培养上清经亲和层析柱纯化,可获得较高纯度的重组蛋白.结论 成功的构建了分泌型融合蛋白hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc真核表达载体,获得纯度较高的融合蛋白,为进一步探讨其配受体的相互作用机制奠定了基础.     

甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体的构建与表达

目的:构建甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏首例甲型H1N1流感病毒毒株(A/Nan jing/1/2009(H1N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-NS1质粒,双酶切pMD18-T-NS1与PXJ40-HA后,构建真核表达载体PXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。West-ern blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功克隆NS1全长基因,并构建了其真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究提供了材料。     

葡萄糖调节蛋白78真核表达载体及稳定转染人视网膜色素上皮细胞株的构建

背景：葡萄糖调节蛋白78是存在于内质网上最多的分子伴侣蛋白,具有保护细胞对抗细胞调亡的作用。 目的：构建携带并正确表达外源性人葡萄糖调节蛋白78基因的重组真核表达载体,建立葡萄糖调节蛋白78基因稳定转染的人视网膜色素上皮细胞系。 方法：扩增人葡萄糖调节蛋白78全长编码序列,将该目的基因与真核表达载体PEGFP-N1进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞,以PCR方法鉴定阳性克隆,并进行测序和分析比对,获得融合蛋白表达质粒载体pEGFP-grp78。通过阳离子脂质体介导将重组质粒pEGFP-grp78转染入体外培养的人视网膜色素上皮细胞,经G418筛选,建立稳定表达细胞系。 结果与结论：体外培养的人视网膜色素上皮细胞株作为真核细胞表达系统,经荧光显微镜和RT-PCR方法检测,G418筛选的稳定转染细胞系中GFP大量表达,葡萄糖调节蛋白78 mRNA的表达量是正常视网膜色素上皮细胞的4倍左右,表示脂质体介导的pEGFP-grp78质粒成功转染视网膜色素上皮细胞,并高效稳定表达葡萄糖调节蛋白78。     

真核表达人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法

目的 真核表达人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,SV)融合蛋白(fusion protein,),并完成蛋白纯化及纯度测定.方法 根据编码F蛋白的基因序列设计引物,CR方法扩增出3'端带His标签的F基因序列,克隆入pGEM-T-easy载体,经核酸序列分析后,进一步克隆到pcDNA3.1( )真核表达载体,限制性内切酶鉴定,用脂质体Lipofectamine2000转染COS-7细胞,2 h后再用Westem blot检测目的蛋白的表达.Ni柱亲和层析纯化COS-7细胞表达的F蛋白,高效毛细管电泳分析纯化后蛋白纯度.结果 核酸序列分析证实获得带His标签的RSV F基因序列,没有发生无义突变.转染COS-7细胞后,利用Western blot方法检测到F蛋白的特异性条带,纯度达99%以上.结论 初步建立了真核表达RSV F蛋白的纯化方法,为进一步优化RSV F蛋白制备条件及单克隆抗体及诊断试剂等研究奠定了基础.