禽流感病毒(H5N1)血凝素蛋白真核表达载体的构建与表达

目的:构建禽流感病毒(H5N1)血凝素蛋白HA真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏H5N1流感病毒毒株(A/Jiangsu/07-4(H5N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增HA全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-HA质粒,双酶切pMD18-T-HA与PXJ40-MYC后,构建真核表达载体PXJ40-MYC-HA,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过West-ern blot鉴定HA蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实HA基因的真核表达载体构建成功。Western blot法可见HA基因编码蛋白的成功表达。结论:成功构建了H5N1血凝素真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达HA蛋白的细胞模型和HA蛋白功能研究奠定了基础。     

靶向人STAT3基因的shRNA慢病毒载体的构建

目的:构建并鉴定靶向人转录因子STAT3基因的shRNA慢病毒载体.方法:设计合成针对人STAT3基因的shRNA序列,运用基因重组技术将其插入到含U6启动子及绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体pSicoR中,构建shRNA重组质粒pSicoR-STAT3-shRNA.经双酶切及DNA测序鉴定后,利用转染试剂X-tremeGENE HP将第3代慢病毒载体共转染至HEK293细胞进行病毒包装.以阴性载体为对照,用RT-PCR和Western blot分别检测STAT3基因和蛋白表达水平.结果:双酶切及测序证实载体构建正确,在HEK293中成功包装出高滴度慢病毒颗粒,感染HEK293后STAT3基因表达和蛋白质表达水平均较对照组明显降低(P＜0.05).结论:成功构建了靶向人STAT3基因的shRNA慢病毒载体.     

小鼠BTLA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠BTLA慢病毒表达载体,并对表达产物进行鉴定.方法 以pET-28a-mBTLA质粒为模板,通过PCR技术构建pMD18-T-mBTLA质粒,将小鼠BTLA基因全长编码序列克隆到慢病毒转移载体,通过脂质体转染293T细胞包装成小鼠BTLA慢病毒颗粒.PCR技术和基因测序对重组质粒进行鉴定.荧光显微镜观察重组慢病毒感染293T细胞形态学变化.RT-PCR和Western blot法鉴定BTLA在重组慢病毒感染293T细胞中的表达.50％组织培养感染剂量法(TCID5o法)检测重组慢病毒滴度.结果 成功构建的pMD18-T-mBTLA质粒和pSL6-mBTLA质粒,经双酶切电泳后均出现大小约为1 kb的条带与mBTLA编码序列的大小相符.基因测序并比对分析进一步证实mBTLA编码序列成功整合到质粒载体.病毒上清PCR扩增和293T细胞形态学观察证实Lenti-mBTLA慢病毒包装成功.TCID50法测定Lenti-mBTLA慢病毒滴度为1.3×108 pfu/mL.RT-PCR和Western blot法证实Lenti-mBTLA慢病毒能有效表达mBTLA mRNA和蛋白质.结论 成功构建了表达小鼠BTLA的慢病毒.     

甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体的构建与表达

目的:构建甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏首例甲型H1N1流感病毒毒株(A/Nan jing/1/2009(H1N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-NS1质粒,双酶切pMD18-T-NS1与PXJ40-HA后,构建真核表达载体PXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。West-ern blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功克隆NS1全长基因,并构建了其真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究提供了材料。     

整合深圳人源H5N1禽流感病毒株血凝素蛋白的假型逆转录病毒的构建

目的 构建整合深圳人源H5N1禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)株血凝素(HA)的假型逆转录病毒.方法 利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增深圳人源H5N1禽流感病毒株HA基因,将扩增产物与pGEM-T载体连接,在经过酶切及测序鉴定后,通过Sal Ⅰ与BamHⅠ酶切位点将HA基因克隆至真核表达载体CMV/R,然后协同转移载体pHR-Luc、包装载体pCMV&8.2通过磷酸钙共沉淀法转染人胚肾细胞(293T),72 h后收集假病毒上清,超速离心后通过Western blot鉴定假病毒颗粒HA、P24蛋白的表达,同时测定HIV-HA假病毒对犬肾传代细胞(MDCK)、宫颈癌上皮细胞(HeLa)、中国仓鼠卵母细胞(CHO)和293T等4种不同细胞株的感染活性.结果 深圳人源HSN1禽流感病毒株A/Shenzhen/406H/06属于subelade2.3,其HA基因开放读码框编码567个氨基酸,在GenBank登录号为EF137706.经Sal Ⅰ与BamH Ⅰ双酶切鉴定HA基因成功克隆至真核表达载体CMV/R.将pHR-Luc、pCMV&8.2、CMV-HA共转染293T细胞后,所收集的假病毒经Western blot证实假病毒颗粒不仅含有HIV基质蛋白P24,还可以整合AIV HA蛋白,并且能够由前体蛋白HA0裂解为具有生物活性的HA1和HA2蛋白.HIV-HA假病毒可以感染MDCK、HeLa、CHO、293T等4种靶细胞,表明所构建的假病毒具有感染活力,且具有广泛的宿主范围.结论 本研究成功构建整合A/Shenzhert/406H/06 HA蛋白的假型逆转录病毒,并且HIV-HA假病毒具有良好的感染活性,从而为下一步筛选中和抗体及抗原表位分析奠定基础.     

基于鞭毛蛋白的H5亚型禽流感疫苗候选株的构建及鉴定

目的构建基于鞭毛蛋白的H5亚型禽流感疫苗候选株。方法以H5N1禽流感病毒血凝素(HA)基因和鼠伤寒沙门菌SL7202基因组为模板,通过重叠PCR扩增出HA1-2-fljB基因片段,将其插入原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET32a-HA1-2-fljB,再将其转化表达菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达。SDS-PAGE和Western blot法鉴定分析融合蛋白HA1-2-fljB。通过刺激HEK293-TLR5细胞,检测融合蛋白的TLR5生物学活性。结果正确构建出重组质粒pET32aHA1-2-fljB,SDS-PAGE显示,融合蛋白HA1-2-fljB相对分子质量(Mr)约为100 000,Western blot法表明融合蛋白具有良好的免疫反应性。TLR5生物活性实验结果显示,与HA1-2蛋白刺激组相比,HA1-2-fljB诱导HEK293-TLR5细胞分泌了高水平的IL-8(P0.01)。结论成功表达出具有TLR5活性的融合蛋白HA1-2-fljB,为研究H5亚型禽流感新型疫苗奠定了基础。     

HIV-1包膜蛋白ENV慢病毒载体的构建及表达

目的:构建表达HIV-1包膜蛋白ENV的慢病毒载体,感染人胚肾细胞HEK293T,观察env基因在HEK293T中的表达。方法:通过点突变获得HIV-1 env完整基因,将env基因亚克隆至慢病毒穿梭载体pLVX-IRES-ZsGreen1的EcoRⅠ、XhoⅠ位点,构建重组质粒pLV-env,采用脂质体转染法转染HEK293T,经RT-PCR、Western blot检测目的基因表达,同时利用激光共聚焦技术对env基因的表达进行了定位。结果:成功获得了HIV-1 env基因,构建了重组慢病毒质粒pLV-env,RT-PCR、Western blot检测均表明外源基因能够表达,并具有抗原性,同时env基因表达后可以分泌到细胞膜表面膜上。结论:成功构建了含有HIV-1包膜蛋白env基因的重组慢病毒质粒,并验证了其表达,为下一步慢病毒的包装以及细胞模型和动物模型的构建奠定了基础。     

可溶性CD20在HEK293T细胞中的高效表达

目的构建CD20真核表达载体,在HEK293T细胞中高效表达CD20蛋白。方法以人外周血单个核细胞(PBMC总RNA为模板,反转录PCR扩增得到CD20基因,并插入真核表达载体p CMV3-C-His,PCR初步验证后,再测序验证。将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞进行蛋白表达,ELISA、Western blot法检测CD20蛋白表达,优化表达条件。结果 PCR与测序均显示成功插入CD20基因。转染HEK293T细胞72 h后,Western blot法检测到细胞内和细胞培养上清液中的CD20蛋白。HEK293T细胞传代次数与细胞培养上清液中CD20表达量相关。结论成功构建CD20真核表达载体,高效表达CD20可溶性蛋白。     

小鼠IL-10重组慢病毒载体的构建和病毒包装

目的:构建小鼠IL-10重组慢病毒表达载体并进行包装,为进一步研究IL-10基因修饰树突细胞在哮喘免疫耐受中的作用提供实验基础。方法:小鼠IL-10基因片段经PCR扩增后,与酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,获得PGC-LV-IL-10重组慢病毒并转化细菌感受态细胞。克隆菌落行PCR鉴定,对阳性的重组质粒进行测序并转入293T细胞,荧光显微镜下观察GFP表达并行Western blot鉴定。将重组质粒与慢病毒包装系统一同转染293T细胞进行病毒包装,Real-time定量PCR法检测病毒滴度。结果:DNA测序结果及Western blot鉴定证实成功构建小鼠IL-10重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为2×108TU/ml。结论:成功构建并包装小鼠IL-10重组慢病毒表达载体。     

H5N1禽流感病毒HA假病毒的构建及特性研究

目的 构建包膜蛋白为H5N1禽流感病毒HA蛋白的假病毒,对其生物学特性进行研究,并将其初步应用于H5N1禽流感病毒的血清检测.方法 将我国分离的高致病性H5N1禽流感病毒的HA基因插入真核表达质粒,得到pLP-HA,与假病毒构建体系的三种质粒pLP1,pLF2和pEmGFP,瞬时共转染人胚肾细胞293T,48 h收集假病毒上清,对其感染性,血凝活性进行测定,并应用于微量中和实验.同时,构建了优化HA基因的假病毒以及一株含有越南禽流感病毒HA基因的假病毒,进行比较.结果 电镜下观察到假病毒颗粒的存在;Western-Blot表明HA蛋白存在于假病毒颗粒中;HA假病毒与野生型活病毒的微量中和实验相比,两者结果具有很好的相关性.结论 成功构建了不同高致病性H5N1禽流感病毒HA蛋白的假病毒,所构建的假病毒可以应用于微量中和实验.研究发现不同禽流感病毒株HA蛋白假病毒的包装效率不同,并且真核表达优化基因并不能显著提高假病毒颗粒包装效率.     

结核分枝杆菌脂蛋白G在HEK293T细胞中的表达及纯化

目的构建含结核分枝杆菌(MTB)脂蛋白G(Lpr G)基因的真核表达载体pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG,并在HEK293T细胞中表达和纯化Lpr G融合蛋白。方法以MTB H37Rv基因组DNA为模板,用PCR法扩增Lpr G基因,并通过DNA重组构建真核表达载体pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG,酶切鉴定并测序。将重组质粒转染HEK293T细胞后,应用Western blot法检测His-Lpr G-FLAG融合蛋白的表达。利用Ni-NTA金属亲和层析柱从细胞上清和细胞裂解液中纯化融合蛋白His-Lpr G-FLAG,并用SDS-PAGE和Western blot法检测纯化后的蛋白。结果成功构建了pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG的真核表达载体,Western blot结果表明转染质粒后,HEK293T细胞裂解液中检测到目的蛋白,相对分子量(Mr)为27 000。经Ni-NTA金属亲和层析柱纯化后得到高纯度的融合蛋白His-Lpr G-FLAG。结论成功构建并在HEK293T细胞中表达和纯化了His-Lpr G-FLAG融合蛋白。     

IFITM2的克隆表达及其抗病毒作用初探

目的:构建含有ifitm2基因的重组质粒,在人胚肾HEK293T细胞中表达,并验证IFITM2蛋白的抗病毒作用.方法:参照Genbank ifitm2基因序列,设计上下游引物,通过RT-PCR技术扩增ifitm2基因,并将扩增产物连接至pMD18-T-simple载体上,目的基因测序正确后进一步亚克隆至真核表达载体pVAX1上,转染HEK293T细胞,通过RT-PCR,蛋白免疫印迹(Western blot)和激光共聚集显微镜(LCSM)验证外源基因在细胞内的表达情况.同时HEK293T细胞过表达IFITM2蛋白,利用含有EGFP基因的VSV-G假膜病毒感染细胞,通过Western blot检测IFITM2蛋白对病毒的抑制作用.结果:成功获得ifitm2基因,测序正确,将其连接到pVAX1载体中,经酶切鉴定,证明含有ifitm2基因的重组质粒构建成功,Western blot和LCSM分析表明,目的基因能够在HEK293T细胞中表达,且呈广泛分布.过表达IFITM2蛋白后,荧光蛋白分析表明,该蛋白对病毒感染具有一定的抑制作用.结论:成功构建了含有ifitm2基因的重组真核表达质粒,该质粒可以在真核细胞中得到有效表达,且对VSV-G假膜病毒具有一定抑制作用,该研究为进一步探讨IFITM2蛋白的抗病毒作用及其分子机制提供了实验及理论基础.     

慢病毒载体介导下DJ-1过表达细胞模型的建立

目的构建人野生型DJ-1及其L166P突变体的慢病毒载体并探讨慢病毒载体在构建基因过表达细胞模型中的作用。方法分别构建野生型DJ-1与L166P突变型DJ-1慢病毒载体质粒。进行测序确定比对正确后,进行质粒的大量扩增与制备并转染包装细胞系HEK293T细胞,荧光法和Western blot检测野生型DJ-1与L166P突变型DJ-1在细胞系中的表达。在确定目的蛋白正确表达之后,大量转染HEK293T细胞进行包装并生产携带目的基因的慢病毒颗粒。测定病毒上清滴度后感染PC12细胞,荧光显微镜和Western blot观察GFP荧光强度以及目的蛋白的表达,确定病毒的感染效率。结果成功构建携带DJ-1野生型及其突变体的慢病毒载体。该病毒载体可以转染进入HEK293T细胞内且目的蛋白能够正确表达。LV-DJ-1与LV-DJ-1/L166P的病毒滴度分别为2×10~9TU/m L与2×10~8TU/m L。病毒上清可以高效感染PC12细胞,绝大多数细胞可表达目的蛋白。外源野生型DJ-1和L166P突变体的蛋白表达量分别是内源性含量的315%和285%。结论慢病毒感染细胞效率很高,是很好的制备基因过表达细胞的方法。通过慢病毒载体介导,本研究获得了DJ-1及其突变体的过表达细胞模型。该模型可以用于后续DJ-1功能研究。     

重组慢病毒表达载体介导HIV-1 Vpr蛋白调控KSHV潜伏感染的初探

目的 利用慢病毒载体系统包装含人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)病毒蛋白R(Vpr)的重组慢病毒,使之感染原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞BCBL-1,并检测Vpr蛋白对细胞中卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)潜伏感染与裂解性复制的影响.方法 从实验室先前构建的重组真核表达质粒pCI-neo-Vpr中扩增出Vpr基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen载体中构建成重组慢病毒质粒pHAGE-Vpr,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2及包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达,293T细胞培养上清经0.45 μm滤器过滤后即获得重组病毒悬液.慢病毒系列稀释后感染293T细胞,荧光计数法测定病毒滴度,逆转录PCR(RT-PCR)检测Vpr基因在293T细胞中的转录.以感染复数(MOI)为1的病毒量感染靶细胞BCBL-1,荧光显微镜观察靶细胞中GFP的表达,并利用RT-PCR和和免疫印迹(Western blot)技术分别检测Vpr基因在靶细胞中的转录和表达情况,同时检测KSHV裂解期基因复制与转录激活子(Rta)mRNA转录及蛋白表达.结果 经酶切鉴定、核酸序列测定和293T细胞中GFP表达证实成功包装了携带HIV-1Vpr基因的重组慢病毒,滴度为4×107TU/ml.重组慢病毒感染BCBL-1细胞后,细胞中有GFP表达,RT-PCR和Western blot均能够在相应位置检测到目的 基因Vpr的条带,并且Vpr降低了KSHV RtamRNA转录及蛋白表达水平.结论 重组慢病毒介导的HIV-1 Vpr蛋白过表达能够抑制KSHV裂解性复制、增强病毒的潜伏感染.     

胞嘧啶脱氨酶和血管内皮抑素基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建携带胞嘧啶脱氨酶(CD)和血管内皮抑素(ES)基因的慢病毒载体.方法 根据GenBank提供大肠杆菌源CD和ES基因序列设计、合成2个基因并构建与荧光蛋白融合的真核表达载体pEGFP-CD和pDS-RED-ES.酶切和测序鉴定后,将载体瞬时转染HEK293细胞,运用实时PCR检测CD和KS基因表达情况.把载体中基因片段EGFP-CD和DS-RED-ES通过BP/LR重组分别构建慢病毒载体,并利用293FT细胞进行慢病毒的包装.将病毒原液浓缩,并测定病毒滴度.结果 酶切、测序及PCR鉴定证实构建出慢病毒载体pLenti6.3-CD-EGFP和pLenti6.3- ES- Monomer - DsRed.感染293FT细胞后荧光显微镜下观察到GFP和DsRed的表达.浓缩慢病毒滴度分别为2.2× 108 TU/ml和6.5×107 TU/ml.结论 成功构建了CD和ES基因慢病毒载体.     

靶向MAG基因shRNA慢病毒载体的构建及其对MAG基因表达的沉默

 目的：设计以MAG基因为靶点的短发夹状RNA（shRNA）,构建重组慢病毒载体并鉴定此RNA干扰体系对MAG基因表达的影响。方法：将3条靶向大鼠MAG基因的shRNA片段插入至慢病毒载体pWPI,与pCDNA3-MAG-FLAG质粒用Lipofectamine　2000共转染293T细胞,Western blotting法鉴定出最有效的shRNA。此重组质粒与pAX2和pMD2G经293T细胞包装后,产生的重组慢病毒感染少突胶质细胞,48 h后Western blotting法检测MAG蛋白的表达情况。结果：经双酶切后测序鉴定,构建了MAG shRNA慢病毒载体pWPI-MAG,鉴定出shRNA-2为最为有效的shRNA。重组慢病毒能明显抑制少突胶质细胞中MAG的表达。结论：慢病毒介导的shRNA干扰技术可特异性阻断MAG的表达,为进一步探讨MAG特异性shRNA治疗神经系统髓鞘损伤奠定了基础。     

TRIM22稳定过表达细胞系的构建及其抗流感病毒的功能

目的构建稳定表达TRIM22的HEK293T细胞系HEK293T-TRIM22,观察TRIM22蛋白在该细胞内的表达及对流感病毒复制的影响并初步探究其抑制机制。方法扩增TRIM22基因并与反转录病毒载体进行体外重组连接,经菌液PCR、测序确认后与反转录病毒骨架载体共转染进HEK293T细胞进行包装病毒。用包装的反转录病毒感染HEK293T细胞,感染24 h后用嘌呤霉素筛选稳定过表达TRIM22的细胞,筛选48 h后用Western blot检测TRIM22表达水平;用IAV-LUC病毒检测稳定过表达TRIM22的HEK293T对流感病毒的抑制作用;再用双分子荧光互补实验(Bi LC)检测与TRIM22相互作用的流感蛋白。结果经测序确认目的基因TRIM22成功克隆到载体p QC-XIP中。包装反转录病毒并感染HEK293T细胞,经过嘌呤霉素筛选后,稳定过表达TRIM22的HEK293T细胞中TRIM22的蛋白表达水平升高(P0.05)。在稳定过表达TRIM22的细胞内流感病毒复制减弱(P0.05)。Bi LC检测TRIM22与流感蛋白NP有相互作用。结论稳定过表达TRIM22的HEK293T细胞系构建成功,TRIM22与NP有相互作用并且抑制流感病毒复制。     

过表达连接子蛋白40(Cx40)通过引起细胞周期阻滞抑制H9c2大鼠心肌细胞增殖

目的 建立过表达连接子蛋白40(Cx40)的H9c2心肌细胞稳定株，初步探讨慢病毒载体介导的Cx40蛋白过表达对H9c2细胞增殖的影响及其相关机制。方法 采用实时定量PCR从H9c2细胞株扩增Cx40基因片段，与慢病毒载体质粒pLVX-IRES-Puro连接，获得重组pLVX-Flag-Cx40表达载体。通过与包装质粒共转染人胚肾HEK293T细胞，获得携带Flag-Cx40的重组慢病毒颗粒。感染的H9c2细胞经嘌呤霉素(puromycin)筛选出稳定表达株(H9c2-Flag-Cx40细胞)。采用Western blot法检测Cx40蛋白表达情况；通过CCK-8法检测Cx40对H9c2细胞增殖的影响；流式细胞术检测细胞周期的变化；实时定量PCR检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的mRNA表达；Western blot法检测cyclin D1蛋白表达；免疫共沉淀(Co-IP)实验检测H9c2细胞Cx40和Yes相关蛋白(YAP)的相互结合情况；分离胞质、胞核蛋白，利用Western blot法检测Cx40对YAP细胞定位的影响。结果 测序结果显示成功构建重组pLVX-Flag-...     

小鼠β-防御素2与甲型流感病毒HA1融合基因真核载体的构建与表达

目的：构建小鼠β-防御素2（mBD2）与甲型流感病毒A／PR／8／34（H1N1）血凝素（HA1）基因融合表达的真核载体，并检测其在HEK293细胞中的表达。方法：用PCR技术分别从质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2和peDNA3．1（＋）／HA1中扩增mBD2与HA1基因片段，再用重叠延伸PCR法（overlap-PCR）将HA1与mBD2通过一段多肽接头Gly4Ser融合为mBD2-HA1。将mBD2-HA1融合基因插入真核表达载体pcDNA3．1（＋），经酶切、PCR和测序鉴定正确后，用脂质体转入HEK293细胞，通过免疫荧光检测其瞬时表达。结果：融合基因mBD2-HA1的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／mBD2-HA1构建成功，并在HEK293细胞中成功表达融和蛋白。结论：融合基因mBD2-HA1真核表达载体的成功构建，为研究防御素在流感病毒核酸疫苗中的佐剂作用奠定了基础。     

表达anti-CD19-CAR协同沉默PD-1的慢病毒载体重构

本研究通过PCR方法扩增含EF1a启动子的DNA片段,利用同源重组酶将该DNA片段整合到pGreenPuro-shRNA慢病毒载体CMV启动子下游,获得新的多启动子慢病毒载体pGreenPuro-Dual。同时,在改造的慢病毒载体的CMV启动子下游插入鼠源anti-CD19-CAR片段,并在H1启动子下游EcoRI和BamHI酶切位点之间插入PD-1shRNA片段,重组获得pGreenPuro-Dual/anti-CD19-CAR/shRNA PD-1慢病毒载体,重组质粒与2个辅助质粒共转染HEK293FT细胞包装重组慢病毒颗粒。利用包装病毒感染HEK293T细胞后,荧光观察病毒感染效率,并提取细胞总蛋白Western blotting检测antiCD19-CAR以及PD-1的表达。结果显示表达anti-CD19-CAR以及shRNA PD-1的重组慢病毒成功感染了HEK293T细胞,鼠源anti-CD19-CAR成功表达,同时PD-1蛋白被有效沉默。