骨髓源性神经干细胞去甲肾上腺素神经递质变化的实验研究

目的研究骨髓源性神经干细胞在体外培养及诱导分化条件下能否分泌去甲肾上腺素(NE).方法分离兔骨髓基质细胞(BMSCs),在体外应用神经干细胞培养液和诱导分化因子使其分化为神经干细胞及神经元样细胞,采用免疫细胞化学方法进行鉴定;应用高效液相色谱法(HPLC)检测其NE的含量.结果BMSCs培养7～14 d免疫细胞化学鉴定Nestin抗原阳性;培养20 d可见长突起神经元样细胞,神经核蛋白(NeuN)呈阳性表达;HPLC检测神经干细胞培养液及L-02肝细胞等阴性对照组及BMSCs(0～5 d)组未检测到NE,骨髓源性神经干细胞(培养7 d、14 d)及神经元样细胞(培养20d)均可检测到NE.随着培养天数的增加,所含的NE浓度也逐渐增加(P＜0.01).结论在适宜条件下,兔BMSCs可在体外分化成神经干细胞及神经元样细胞,并合成和分泌NE.     

大鼠骨髓间质细胞向Schwann-like细胞的诱导分化

目的探索成年大鼠骨髓间质细胞(MSCs)向Schwann—like细胞转化的方法和机理。方法分别用变性神经提取液和含有大鼠白血病抑制因子(rLIF)、上皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等的诱导液诱导成年大鼠骨髓间质细胞,观察诱导过程中细胞形态学变化,利用免疫细胞化学染色鉴定诱导细胞性质;同时培养大鼠Schwann细胞作为对照。结果经变性神经提取液诱导后细胞转化为梭形细胞,并排列成网状;经细胞因子诱导后细胞呈梭形排列,S-100,GFAP染色呈阳性反应。结论变性神经提取液中含有促使骨髓间质细胞向Schwann-like细胞分化的必要成份;LIF可能是这些必要成份的重要组成之一。     

骨髓基质细胞体外诱导分化成神经元和胶质细胞

目的　探索骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells,BMSC)体外诱导分化为神经元和神经胶质细胞的可行性 ,为BMSC在神经科学领域内的应用奠定基础。方法　以成年犬BMSC为实验对象 ,利用碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、表皮生长因子 (EGF)、维甲酸 (RA)、脑源性神经营养因子 (BDNF)、胶质细胞系来源神经营养因子 (GDNF)等作为增殖及分化诱导因子 ,进行增殖培养、分化诱导 ;免疫组化法进行细胞性质鉴定。结果　加入bFGF、EGF增殖培养 72h可见细胞分裂相 (成纤维细胞样细胞 )。加入RA、BDNF、GDNF诱导 3d ,部分细胞有NSE、GFAP成分表达 ;第 10d可见有神经元、神经胶质形态样细胞形成 ,经细胞成分 (NSE、GFAP)鉴定证实为神经元、神经胶质细胞。结论　BMSC在体外培养条件下 ,经过bFGF、EGF、RA、BDNF、GDNF等因子的“程序性”作用 ,可以分化成神经元和神经胶质细胞     

化学去细胞异体神经联合骨髓间充质干细胞修复损伤坐骨神经的生物力学评价

文题释义： 生物力学：是应用力学原理和方法对生物体中的力学问题定量研究的生物物理学分支,其研究范围从生物整体到系统、器官(包括血液、体液、脏器、骨骼等),从鸟飞、鱼游、鞭毛和纤毛运动到植物体液的输运等。生物力学的基础是能量守恒、动量定律、质量守恒定律并加上描写物性的本构方程。生物力学研究的重点是与生理学、医学有关的力学问题。依研究对象的不同可分为生物流体力学、生物固体力学和运动生物力学等。 周围神经研究热点和发展趋势：周围神经损伤的治疗已经取得了突破性的进展,但由于周围神经走行长、结构复杂、功能多样,损伤后其自身和靶器官会发生改变,而且是动态的、有时间效应的改变,因此以整体统一的理念研究周围神经损伤是今后研究重点。如何将基础研究与临床相结合,最终实现成果转化服务于患者,是研究者们的努力方向。国内外学者对自体神经损伤移植替代材料的研究从未间断过。随着组织工程和生物力学的发展,同种异体神经和人工神经已逐渐应用于临床,去细胞神经移植物也已取得了很好的临床效果。背景：以拉伸力学指标评估化学去细胞异体神经联合骨髓间充质干细胞治疗坐骨神经损伤的效果,目前鲜有报道。 目的：评估化学去细胞异体神经联合骨髓间充质干细胞移植治疗坐骨神经损伤的效果。 方法：将45只SD大鼠随机分为自体神经移植组、化学去细胞异体神经移植组、化学去细胞异体神经联合骨髓间充质干细胞移植组,每组15只,制备10 mm坐骨神经损伤模型,分别以自体神经、化学去细胞异体神经、化学去细胞异体神经联合骨髓间充质干细胞修复坐骨神经损伤,术后20周,进行坐骨神经电生理检测和坐骨神经单向拉伸实验。 结果与结论：①化学去细胞异体神经联合骨髓间充质干细胞移植组与自体神经移植组波幅值、运动传导速度值大于化学去细胞异体神经移植组(P < 0.05);②化学去细胞异体神经联合骨髓间充质干细胞移植组与自体神经移植组拉伸弹性限度应变、弹性限度应力、最大应变、最大应力大于化学去细胞异体神经移植组(P < 0.05);③结果表明,化学去细胞异体神经联合骨髓间充质干细胞移植对坐骨神经损伤具有明显的修复效果。ORCID: 0000-0002-1029-8117(吴志峰) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

大鼠骨髓间质干细胞基本生物学特性的研究

目的:研究成年大鼠骨髓间质干细胞(rBMMSCs)的基本生物学特性,并与成人骨髓间质干细胞(hBMMSCs)作比较。方法:分别采用贴壁法和Ficoll-Paque淋巴细胞分离法分离获得rBMMSCs和hBMMSCs,进行体外传代、扩增、纯化,比较分析不同代数的rBMMSCs和hBMMSCs的增殖能力和克隆形成能力,观察传代次数对rBMMSCs的神经分化能力的影响,流式细胞仪检测rBMMSCs表面抗原表达;采用中期分裂相秋水仙素阻抑法分析rBMMSCs的核型。结果:原代rBMMSCs和hBMMSCs在体外扩增后可分别获得(7-8)×10⁵和(5-6)×10⁵个细胞,体外扩增5代后可分别获得1.7×10⁸和l×10⁸个细胞,体外扩增15代后,可分别获得(4-8)×10¹²和(3-4)×10¹²个细胞,随着传代次数的增加,细胞的增殖能力、克隆形成能力和神经分化能力有所下降,但各代rBMMSCs的增殖能力和克隆形成能力都比hBMMCs较强。流式细胞仪检测结果显示rBMMSCs的CDllb、CD45、CD61、CD71、CD8O、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ表达为阴性,而CD29和CD44表达阳性。rBMMSCs为正常大鼠二倍体核型。结论:rBMMSCs具有极强的自我更新能力和神经分化能力,是一种具有正常二倍体核型的间质干细胞,在组织工程中具有广阔的应用前景。     

自体骨髓单个核细胞移植治疗糖尿病下肢周围神经病变

背景：有研究表明移植骨髓单个核细胞治疗糖尿病下肢神经病变动物模型,通过在组织内能促进血管再生和增加血管生成因子及神经营养因子能改善临床症状。                             目的：观察自体骨髓单个核细胞移植治疗糖尿病下肢周围神经病变的临床效果。 方法：30例糖尿病下肢闭塞症患者60条下肢,按治疗方式的不同分为2组：自体骨髓单个核细胞移植的治疗组和对侧下肢非自体骨髓单个核细胞移植的对照组,各30条下肢。 结果与结论：移植4周后,治疗组总有效率高于对照组(P < 0.05)。两组治疗后神经病变自主症状问卷神经病变主觉症状问卷评分均较治疗前明显降低,治疗组评分降低更明显(P < 0.01),治疗组胫神经和腓总神经感觉和运动神经传导速度均较对照组快(P < 0.01),患者未出现并发症和不良反应。说明自体骨髓单个核细胞移植治疗糖尿病下肢周围神经病变的临床效果较好。     

谷氨酰胺诱导nestin阳性大鼠骨髓间充质干细胞分化为施万细胞样细胞

<正>组织工程技术的发展为外周神经损伤提供了新的治疗方法[1],尤其在较长的外周神经缺损中可以解决自体神经移植供源不足的问题。近些年研究表明,施万(Schwann)细胞在外周神经发育和促进外周神经的再生和修复中起着重要的作用[2-3]。施万细胞作为外周神经组织工程中重要的种子细胞之一,但是自体来源的施万细胞数量和增殖能力有限,不能满足组织工程化的需要,因此获得充足的细胞用于移植成了问题的关键。骨髓间充质干细胞(bone     

大鼠骨髓内皮祖细胞促进神经胶质瘤生长

目的:探讨骨髓内皮祖细胞( EPCs)对神经胶质瘤的作用,为深入研究神经胶质瘤提供基础资料.方法:建立荷瘤裸鼠动物模型,裸鼠设计同体对照,实验组注射胶质瘤C6细胞与大鼠EPCs的等比混合细胞悬液,对照组注射C6细胞悬液,每隔2d观测并记录肿瘤生长情况;第27天处死动物,剥离肿瘤,观测肿瘤大小和质量,H-E及免疫组织化学显色,检测肿瘤组织内含CD31阳性细胞的管腔样结构的数目,反映肿瘤组织内微血管密度(MVD);免疫荧光观测EPCs是否参与神经胶质瘤血管新生.结果:细胞接种后第9天肉眼观察裸鼠皮下肿物,实验组肿物大小为(0.1±0.029)cm3,对照组(0.09±0.024)cm3,两组差异无统计学意义;之后肿瘤逐渐增大,第15天时实验组肿瘤(0.21±0.042)cm3大于对照组(0.17±0.026)cm3;第27天时处死动物,实验组肿瘤质量(17.56±1.30)g大于对照组(11.24±1.16)g.H-E染色显示,两组神经胶质瘤细胞较为密集,局部有血管样结构.免疫组织化学显色结果显示,实验组MVD值(30±1.2)个/视野多于对照组(18±1.01)个/视野.免疫荧光显示,肿瘤组织局部有大鼠骨髓EPCs.结论:骨髓EPCs能促进C6胶质瘤生长.     

Fasudil联合骨髓源神经干细胞对EAE小鼠的神经保护作用

目的:探讨Rho激酶抑制剂法舒地尔(fasudil)联合骨髓源神经干细胞(bone marrow-derived neural stem cells,BM-NSCs)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠的神经保护作用。方法:32只雌性C57BL/6小鼠(8~10周龄),用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)免疫,制备EAE,随机分为对照(dd H_2O)组、fasudil组、BM-NSCs组和fasudil+BM-NSCs组,并分别给予相应处理。免疫后检测小鼠临床症状和相关神经营养因子的表达,Image-Pro Plus 6.0软件进行阳性细胞计数,Graph Pad Prism 5软件统计分析。结果:与dd H_2O组比较,fasudil+BM-NSCs处理组明显延迟小鼠的平均起病时间,降低最高临床评分,并缓解EAE小鼠的临床症状;fasudil组、BM-NSCs组和fasudil+BM-NSCs组中脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、神经生长因子、神经营养因子3和睫状神经营养因子阳性细胞数均有不同程度的增加,其中,fasudil+BM-NSCs组上述神经营养因子的表达明显多于dd H_2O组、fasudil组和BM-NSCs组(P0.01)。结论:Fasudil联合BM-NSCs通过协同和叠加效应促进神经营养因子表达,改善中枢神经系统微环境,发挥神经保护作用,从而缓解EAE的临床症状。     

神经干细胞联合骨髓间充质干细胞移植对小鼠脊髓损伤的修复作用

目的:研究神经干细胞(NSCs)联合骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对小鼠脊髓损伤(SCI)的作用.方法:分别培养与鉴定绿色荧光蛋白(eGFP)转基因小鼠的NSCs与tdTomato红色荧光蛋白转基因小鼠的BM-SCs;将两种细胞进行Transwell共培养,并用免疫荧光染色观察巢蛋白(nestin)和神经元特异性烯...     

bFGF促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经胶质样细胞转分化

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)在体外诱导为神经源性细胞的可行性,并探讨其作用机制。方法从Wistar大鼠骨髓中获得rMSCs,纯化培养传代后用不同浓度的bFGF诱导,经MTT法检测bFGF对rMSCs生长的影响;用倒置光显微镜、透射电镜、免疫组化和RT-PCR等方法鉴定诱导后细胞行为改变与snail mRNA表达。结果bFGF对rMSCs具有促增殖作用,在倒置光显微镜和透射电镜下可见到有神经胶质样细胞形成,免疫组化证明GFAP的表达较对照组显著增高(P<0.01)。RT-PCR结果表明,诱导组细胞snail mRNA明显表达。结论bFGF促进rMSCs转分化为GFAP阳性的神经胶质样细胞,转录因子Snail可能与转化过程有关。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓中的非造血干细胞,在体外一定条件下可向神经细胞分化。本实验通过密度梯度离心获取人骨髓中的单个核细胞,贴壁培养纯化BMSCs,并用脑源性神经营养因子(BDNF)、forskolin(FSK)和多巴胺(DA)联合对BMSCs进行诱导,电子显微镜观察诱导后细胞是否具有成熟神经元的超微结构特点;免疫细胞化学和RT-PCR检测DA能神经元分化过程中的标志物酪氨酸羟化酶(TH)的表达以及转录因子Nurr1、Ptx3、和Lmx1b的表达。结果显示:诱导2周后,电镜下可见细胞浆中有大量密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些游离核糖体,以及神经丝。RT-PCR结果显示NSE(neuron specific enolase)、Nurr1、Ptx3、Lmx1b和TH的mRNA均有表达;免疫细胞化学表明诱导2周后TH阳性细胞的表达较诱导3d后明显提高。上述结果表明BDNF、FSK和DA可以在体外诱导人BMSCs定向分化为DA能神经元。     

体外诱导恒河猴骨髓基质细胞分化为神经细胞的分化条件

目的比较血清维甲酸(retinoic acid,RA)、胶质细胞源神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)及脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)等在不同浓度诱导条件下使恒河猴骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells)诱导分化为神经干细胞(NSCs)及成熟神经细胞的分化条件。方法用Nestin、CD133抗体免疫细胞化学染色,鉴定NSCs;用NSE、β-tublin鉴定神经元;用GFAP鉴定神经胶质细胞,膜片钳检测分化成熟细胞的电生理特性。结果培养第8天多数细胞表现出Nestin及CD133抗原阳性,即为NSCs细胞;诱导后3天即有神经元样细胞出现,此后神经元样细胞逐渐增多,膜片钳检测发现这些细胞具有类似神经细胞的电生理特性。同时,与其他培养条件相比较,低浓度血清(2．5％) RA GDNF组诱导分化效能最高。结论应用RA GDNF及配合使用低浓度血清能够高效诱导骨髓源NSCs向成熟神经细胞分化。     

骨髓基质细胞对中脑神经干细胞分化为神经元的诱导作用

目的:观察成年大鼠骨髓基质细胞诱导新生大鼠中脑神经干细胞分化为神经元的机制。方法:采用骨髓基质细胞和神经干细胞共培养方法,通过显微镜观察神经干细胞的分化状态;使用免疫组织化学技术,分析神经元在神经干细胞后代中所占的比例。结果:(1)骨髓基质细胞可诱导神经干细胞分化为高比例神经元;(2)骨髓基质细胞可促进神经元的存活。结论:骨髓基质细胞可提供神经干细胞分化为神经元和促进神经元存活的信号物质。     

大鼠骨髓间质干细胞用肾上腺素类激素诱导为神经细胞的研究

目的:体外诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经细胞。方法:SD大鼠股骨骨髓细胞体外扩增。用肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素注射液分别加入无血清L-DMEM诱导MSC分化为神经细胞。免疫细胞化学鉴定有神经元烯醇化酶(NSE)、神经干细胞标志物巢蛋白(nestin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达。结果:大鼠骨髓间质干细胞在体外扩增5-22代,对照组不加任何诱导剂,有53%的神经样细胞。加入肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素诱导1-5h,约70%MSC形态转变为典型的神经样细胞。免疫细胞化学显示诱导出的神经样细胞NSE、nestin、GFAP表达阳性。继续培养5d后对照组神经样细胞逐渐凋亡。肾上腺素类各组虽存活6d,但细胞正常形态改变,部分细胞死亡漂浮。一瓶MSC在正常培养至第7代时,自发出现约50%的神经细胞,传至第13代,有约60%的神经细胞(66.5%±6.4%)。结论:骨髓本身可能存在着神经干细胞。大鼠骨髓间质干细胞用肾上腺素类诱导可分化为多种形态的神经细胞。     

混合培养对骨髓基质细胞转分化为神经元的影响

目的　研究神经干细胞(NSCs)与骨髓基质细胞(BMSCs)混合培养对骨髓基质细胞转分化为神经元的 影响。　方法　将BMSCs传代培养2d,10μg LbFGF预诱导过夜,DAPI标记后加入到已贴壁分化2d的NSCs中,神 经元培养基混合培养7d后进行神经元特异性烯醇化酶(Nse)染色。对照组于BMSCs传代2d后,一组加bFGF处理 过夜,另一组不加,神经元培养基培养7d后NSE染色。　结果　实验组中部分BMSCs呈NSE染色强阳性,比例为 (13.38±5.79)%,对照组呈NSE阴性　结论　NSCs与BMSCs混合培养可诱导BMSCs转分化为神经元。     

骨髓神经组织定向干细胞性组织工程化神经移植修复坐骨神经损伤

目的:为临床周围神经损伤的组织工程化神经替代治疗提供可靠的实验依据。方法:采用体外成功构建的骨髓神经组织定向干细胞(NTCSCs)组织工程化神经,桥接缺损10mm的大鼠坐骨神经。通过术后行为学、神经功能指数分析(SFI)、神经电生理功能检查和HRP逆行追踪,以及对移植至支架的标记细胞在体内的存活、增殖及分化的形态学观察,综合评价损伤神经的功能恢复情况。结果:(1)SFI及神经电生理功能检查显示,NTCSCs组织工程化神经移植能明显促进神经传导功能及运动功能的恢复。(2)HRP逆行追踪结果显示NTCSCs组织工程化神经移植能明显促进神经纤维再生。(3)免疫荧光双标结果显示移植到体内的NTCSCs,从4周到12周,其细胞数显著增加,体内的NTCSCs细胞能分化成少量NSE阳性细胞,但大部分分化成S-100阳性细胞。结论:该骨髓神经组织定向干细胞性组织工程化神经能够有效的促进损伤坐骨神经的功能恢复。     

腺病毒介导的EGFP基因在大鼠骨髓间质干细胞中的高效表达

目的:研究复制缺陷型腺病毒感染骨髓间质干细胞介导外源基因表达的可行性及感染效率。方法: 在体外低密度扩增大鼠骨髓间质干细胞(rMSC), 用细菌同源重组法构建巨细胞病毒(CMV)驱动的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因腺病毒载体(pAd-EGFP), 用293包装细胞制备腺病毒, 用EGFP重组腺病毒感染rMSC, 观察重组腺病毒携带基因在MSC中的感染和表达情况, 用细胞计数法和流式细胞仪分析感染效率。用血清撤离加入β-巯基乙醇诱导Ad-EGFP感染的rMSC向神经样细胞定向分化。结果:Ad-EGFP可高效感染rMSC, 感染率为(36±2)%, 而脂质体法转染质粒pTrack-GFP在rMSC转染效率非常低且不易成功;Ad-EGFP感染后的不同扩增代数的rMSC在受到β-巯基乙醇的诱导分化后在荧光显微镜下呈典型的突触形式。免疫组化鉴定发现这些诱导细胞表达神经元特异烯醇化酶(NSE), 表明腺病毒介导外源基因转染后rMSC仍具有分化为神经样细胞的潜能。结论:腺病毒载体具有较高的介导外源基因表达于rMSC的效率, 腺病毒载体介导的EGFP基因能够示踪rMSC分化为神经样细胞的过程。     

胶质细胞源性神经营养因子对猴骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响

背景：鉴于骨髓间充质干细胞体外分化为神经样细胞的最终研究目的,是将诱导后的细胞移植入体内参与损伤神经系统的修复过程,因此,保证移植细胞的活性显得十分重要。 目的：探讨胶质细胞源性神经营养因子对隐丹参酮体外诱导猴骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的保护作用。 方法：以隐丹参酮为诱导剂诱导第8代猴骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,应用流式细胞仪检测不同时段诱导细胞的凋亡百分比(每间隔0.5 h为1组,共12组)。选择细胞凋亡百分比较高的一个时段,观察添加不同质量浓度胶质细胞源性神经营养因子(0-100 μg/L,共11组)对诱导细胞凋亡的影响。 结果与结论：诱导后细胞凋亡百分比逐渐升高,约4 h时达到峰值,维持约1 h后下降(P < 0.05)。 随着胶质细胞源性神经营养因子质量浓度由0 μg/L提高到30 μg/L,细胞凋亡百分比逐渐下降(P < 0.05),当胶质细胞源性神经营养因子质量浓度超过30 μg/L后,细胞凋亡水平受胶质细胞源性神经营养因子质量浓度影响不再显著。结果可见胶质细胞源性神经营养因子在隐丹参酮体外诱导猴骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞过程中具有保护作用。     

骨髓神经组织定向干细胞的分离培养鉴定

目的:为临床中枢神经系统疾患的细胞移植及组织工程修复周围神经提供一种应用广泛、可来源于自体、无免疫排斥和伦理道德等问题的移植用种子细胞。方法:采用DMEM/F12(1∶1)无血清神经干细胞培养液,通过先贴壁、后悬浮的方法从大鼠骨髓中分离、培养单克隆生长的神经组织定向干细胞(neural tissue-committed stem cells,NTC-SCs),通过免疫细胞化学检测NTCSCs细胞球CXCR4和Nestin蛋白,以及细胞球自然分化后神经元β-TublinⅢ、MAP2ab以及神经胶质细胞CNPase、GFAP等蛋白的表达。结果:NTCSCs细胞球表达神经干细胞标志蛋白Nestin和组织定向干细胞标志蛋白CXCR4;NTCSCs细胞球在含15%胎牛血清的DMEM培养液中可自然分化,免疫荧光显示神经元和神经胶质蛋白β-TublinⅢ、MAP2ab、CNPase、GFAP等标志物阳性。结论:本研究提供了一种操作简便、成本低廉的NTCSCs的分离培养方法,NTCSCs作为种子细胞为脑、脊髓等神经系统疾患和创伤的修复和治疗提供了广阔的应用前景。