IL-12增强结核病患者中性粒细胞吞噬和杀伤结核杆菌的活性

目的:观察IL-12对结核病患者外周血中性粒细胞(PMN)对结核分枝杆菌(M.tb)吞噬和杀伤功能的影响.方法:结核病患者和正常人外周血与异硫氰酸荧光素( FTTC)标记的M.tb共同孵育不同时间后,用流式细胞术(FCM)检测PMN对M.tb的吞噬率;结核病患者和正常人外周血均加入2'7’二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作用,同时加或者不加M.tb共同孵育不同时间后,用FCM检测PMN的活化率并计算活性氧(ROS)产生量;不同浓度IL-12预先作用外周血后,再用上述方法检测PMN对M.tb吞噬率,活化率及产生ROS的变化.结果:结核病患者和正常人PMN对M.tb吞噬率,PMN活化率和ROS产生均随时间延长而增加,但结核病患者5 min吞噬率(51.82±6.93)％高于正常人(47.20±4.26)％(P＜0.05);IL-12预先作用后,结核病患者和正常人PMN吞噬率、PMN活化率和ROS的产生均随浓度增大而显著增加,两者之间无显著性差异.结论:结核病患者外周血PMN对M.tb的吞噬功能以及ROS产生与正常人无显著性差异,仅早期吞噬率较高.IL-12略增强PMN吞噬和产生ROS的反应能力.     

Annexin A3抑制顺铂诱导人卵巢上皮癌细胞凋亡

目的 进一步探讨annexin A3能否通过凋亡途径调节卵巢癌细胞对顺铂敏感性.方法 运用反转录病毒载体构建及目的细胞感染技术,获得annexin A3稳定上调和稳定下调卵巢癌细胞系,运用annexin V/碘化丙啶分析方法和免疫印迹法检测细胞凋亡率、细胞内caspase蛋白裂解水平和annexin A3表达水平.结果 顺铂敏感细胞annexin A3表达水平上调后,60μg/mL顺铂诱导细胞凋亡率由68.72%±1.01%下调至29.13%±2.61%(P<0.05);高浓度顺铂诱导caspase和PARP蛋白裂解.相反,顺铂耐药细胞内mumxin A3水平下调后,凋亡率由35.05%±3.06%上升至76.73%±6.42%(P<0.05),低浓度顺铂诱导caspase和PARP蛋白裂解.此外,annexin A3还能够显著抑制卵巢癌细胞内P38 MAPK磷酸化.结论 Annexin A3能通过抑制细胞凋亡调节卵巢癌细胞对顺铂的敏感性.     

调控中性白细胞凋亡有关因素的体外实验

目的:用体外实验观察多种因素(包括亚砷酸钠、TNF-α、IL-6及烧伤血清、创伤血清)对中性白细胞(PMN)凋亡的影响,为探索一种新的保护组织免遭继发性损害的方法提供依据。方法:分离纯化人外周血PMN,与亚砷酸钠(Ars)、TNF-α、IL-6及烧伤血清、创伤血清作用后,测定凋亡比例、CD 11 b表达、呼吸爆发、胞质Ca²⁺浓度的改变。结果:Ars浓度与PMN凋亡呈剂量依赖关系,激活的PMN却对Ars失敏;IL-6使PMN凋亡延迟(与24 h对照相比,P＜0.05),抑制CD 11 b表达(与24 h对照相比,P＜0.01);烧伤血清和创伤血清的作用较IL-6更为明显。结论:发现PMN激活后对Ars失敏,其机理不清;CD 11 b表达升高与PMN凋亡增多呈正相关;IL-6、烧伤血清、创伤血清能延迟PMN凋亡,部分恢复PMN的功能。     

模拟失重对IL-2诱导的人NK细胞生物活性的影响

目的明确模拟失重对白细胞介素2(IL-2)诱导的人自然杀伤(NK)细胞活性的影响。方法回转细胞模拟失重条件培养人NK细胞,CCK-8法检测NK细胞增殖活性、异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡率、ELISA检测γ干扰素(IFN-γ)产生水平,反转录PCR检测NK细胞IL-12β1和IL-12β2受体mRNA水平。结果与正常重力组相比,模拟失重培养24 h和48 h后,IL-2诱导的NK细胞增殖水平分别下降13.6%和31%,凋亡率分别增加8%和19%,IFN-γ分泌水平分别降低25.2%和47.8%,杀伤活性分别下降7%和18%,IL-12刺激IL-2预处理NK细胞产生IFN-γ的水平分别降低21.8%和58.8%,同时,NK细胞IL-12β1和IL-12β2受体mRNA水平显著降低。结论模拟失重抑制IL-2诱导的NK细胞增殖、IFN-γ产生和杀伤活性,并进一步通过下调IL-12受体mRNA表达抑制IL-12诱导的IFN-γ产生。     

布鲁菌S2株感染巨噬细胞与树突状细胞的比较

目的 比较猪布鲁菌S2菌株感染巨噬细胞和树突状细胞(DC)的特点.方法 采用瑞氏-吉姆萨染色法观察细胞形态并计算吞噬率;用ELISA法测定细胞培养上清中的IL-12和TNF-α以及与T细胞共培养上清中IFN-γ和IL-4的含量;用annexin-V-FITC/PI双染,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 感染S2菌株1h后巨噬细胞的吞噬率为(43.6±4.8)％,显著高于DC的吞噬率(13.08±2.36)％ (P ＜0.05);正常巨噬细胞凋亡率为(3.09±1.21)％感染S2菌株后6、12和24h的凋亡率分别为(19.89±1.36)％、(22.73±2.21)％和(42.44±3.12)％,明显高于DC感染后相同时间点的凋亡率(P＜0.05),正常DC凋亡率为(1.82±0.01)％,DC感染S2菌株6、12、24h凋亡率分别为(3.76±0.13)％、(7.87±0.56)％和(9.08±0.23)％.巨噬细胞在感染S2菌株后24、48 h分泌的IL-12均明显低于DC分泌IL-12的量(P＜0.05);24、48、72 h分泌的TNF-α量均明显低于DC(P ＜0.01);在24、48、72 h与T细胞共培养分泌的IFN-γ含量均明显低于DC(P＜0.01).结论 巨噬细胞吞噬猪布鲁菌S2菌株的能力高于DC,猪布鲁菌S2感染后巨噬细胞的凋亡率高于DC,感染S2菌株后DC的活化及提呈抗原并激活T细胞的能力强于巨噬细胞.     

白细胞介素17A体外刺激角质形成细胞株对角蛋白17表达的影响

目的观察白细胞介素17A(IL-17A)对体外培养的人永生化角质形成细胞株HaCaT分泌角蛋白17(K17)及信号转导和信号转录激活因子3(STAT3)信号通路的影响。方法 RPMI1640培养液培养的HaCaT细胞随机分为空白对照组、IL-17A(50μg/L)刺激孔(诱导组)和IL-17A(50μg/L)+10μmol/L STAT3抑制剂白皮杉醇(抑制剂组)。收集培养的HaCaT细胞,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测HaCaT细胞增殖;采用流式细胞术(FCM)检测HaCaT细胞凋亡;采用RT-PCR检测HaCaT细胞K17mRNA表达水平;采用Western blot法检测HaCaT细胞K17和磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白表达水平。结果诱导组、抑制剂组和空白对照组HaCaT细胞增殖差异有统计学意义(F=8.47,P=0.006),诱导组HaCaT细胞增殖高于空白对照组和抑制剂组(均P0.05);诱导组、抑制剂组和空白对照组HaCaT细胞凋亡率差异有统计学意义(F=26.48,P=0.001),诱导组HaCaT细胞凋亡率(5.96%±0.68%)低于空白对照组(15.34%±1.32%)和抑制剂组(15.62%±1.26%)(均P0.05);诱导组、抑制剂组和空白对照组HaCaT细胞K17 mRNA表达差异有统计学意义(F=10.25,P=0.001),与空白对照组和抑制剂组比较,诱导组的HaCaT细胞K17 mRNA表达明显升高(均P0.05);3组HaCaT细胞K17和p-STAT3蛋白表达差异有统计学意义(F分别为11.62和9.86,P=0.001和0.003)。与空白对照组和抑制剂组比较,诱导组的HaCaT细胞K17和p-STAT3蛋白表达明显升高(均P0.05)。结论 IL-17A能够上调体外培养的HaCaT细胞K17的表达,其调控机制可能是通过激活STAT3来实现,表明IL-17A在银屑病中所发挥的作用可能与K17有关,为银屑病的发病机制研究和治疗提供了新的思路。     

烫伤后IL-6和IL-1α对大鼠外周血中性粒细胞凋亡的影响

目的:研究严重烫伤后血IL-6和IL-1α对中性粒细胞(PMN)凋亡的影响。方法:复制30%体表面积Ⅲ度烫伤大鼠模型;分离PMN,TUNEL荧光标记,流式细胞仪分析细胞凋亡;PMNcaspase3活性以荧光免疫吸附酶法测定;血清IL-6和IL-1α水平以酶联免疫法测定。结果:血清IL-6水平(μg/L)在伤后各组(3、6、12、24、48h依次分别为9.14±1.16、12.49±1.14、3.01±0.75、1.41±0.28和1.56±0.43)和IL-1α水平(ng/L)在伤后3、6、12h组(90.08±8.39、320.93±14.48和47.84±5.19)均分别显著高于伤前对照组IL-6(0.24±0.07)和IL-1α(27.65±4.86)水平(P<0.05);伤后各组PMN凋亡率(%)按时点依次为9.89±2.00、4.98±1.35、1.31±0.72、2.49±1.87和6.88±1.13显著少于伤前组13.66±3.88(P<0.05);PMNcaspase-3的活性测定结果与PMN的凋亡表现相一致。结论:大鼠烫伤后外周血PMN凋亡明显延迟;IL-6和IL-1α等细胞因子是重要的影响因素,减少细胞内caspase-3的激活可能是其机制之一。     

Fas在缺氧心肌细胞中的表达及其意义

目的:利用体外培养心肌细胞缺氧模型,观察不同缺氧时间心肌细胞凋亡的发生及与Fas表达的关系.方法:原代培养乳鼠心肌细胞,随机分为对照组、缺氧1 h、2 h、3 h、4 h组,构建心肌细胞缺氧模型,应用膜联蛋白-Ⅴ与溴化丙啶双染法与Hoechst 33258染色法检测缺氧心肌细胞凋亡,应用免疫组化法检测Fas在心肌细胞上表达.应用West-ern blot检测Fas在心肌细胞表达.结果:膜联蛋白-Ⅴ与溴化丙啶双染法检测发现对照组、缺氧1 h、2 h、3 h和4 h组细胞凋亡率分别为(0.20±0.15)%,(4.32±0.56)%,(6.32±1.22)%,(8.32±1.19)%,(5.01±1.56)%(P<0.05);Hoechst 33258染色显示,与对照组比较,缺氧1 h、2 h、3 h和4 h组细胞的凋亡率明显升高;免疫组化与对照组比较,缺氧1 h、2 h、3 h、4 h组阳性细胞数明显升高(P<0.05),缺氧3 h组最高,缺氧4 h组略下降;Western blot检测结果提示对照组与4 h组Fas表达减弱,缺氧1 h、2 h和3 h组Fas表达上调.结论:缺氧可诱导心肌细胞的凋亡,缺氧时间延长引起凋亡率逐渐上升,至4 h时凋亡率开始下降,Fas表达量的变化趋势与凋亡率的变化趋势一致,Fas可能介导了缺氧诱导的心肌细胞凋亡.     

内质网应激诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞系凋亡

目的探讨内质网应激(ERS)致雌激素受体阴性(ER-)人乳腺癌MDA-MB-231细胞系凋亡及钙激活中性蛋白酶2(calpain2)在凋亡效应中的作用。方法实验设空白对照组(DMEM)、对照组(DMEM+DMSO)和实验组,用不同浓度衣霉素(TM)诱导乳腺癌细胞不同时间,MTT法和流式细胞术检测细胞增殖抑制率及凋亡率;Western blot法检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)表达量,以GRP78表达最高点确定ERS模型建立,检测凋亡相关蛋白caspase4和CHOP表达以及calpain及其内源性抑制酶calpastatin的表达,用ERS抑制剂(4-PBA)和calpain抑制剂(calpeptin)分别预处理细胞2 h,观察对上述效应的影响。结果 9、12和18μmol/L TM诱导ERS对该细胞增殖有明显抑制效应,抑制率分别为33.88%±1.32%、51.51%±8.85%和55.77%±2.61%,细胞凋亡率分别为9μmol/L TM组16.70%±0.46%和12μmol/L TM组28.1%±1.09%,与对照组相比有明显差异(P0.05);9μmol/L TM诱导细胞24 h的GRP78表达上调最高(P0.01);ERS还可明显上调caspase4、CHOP和calpain表达,下调calpastatin表达(P0.01或P0.05),上述效应均能被4-PBA和calpeptin减弱或阻断(P0.05)。结论 ERS可诱导MDA-MB-231细胞凋亡,calpain2参与调控凋亡发生。     

莫西沙星对脂磷壁酸诱导的人肺泡巨噬细胞凋亡及炎症因子释放的影响

目的 探讨脂磷壁酸(LTA)对人肺泡巨噬细胞(AM)凋亡及炎症因子释放的影响和莫西沙星(MXF)对其反应的抑制作用.方法 收集、提纯及体外培养人AM,LTA刺激4h后,加或不加MXF与其共孵育,于各实验终点用MTT法计算细胞相对活力,光学显微镜观察细胞形态,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR法检测TLR2、IL-1β、IL-8及TNF-α的mRNA水平,ELISA检测IL-8蛋白水平,验证RT-PCR.结果 LTA对AM有细胞毒性,并呈浓度递增关系(P＜0.05),MXF对AM活力无影响(P＞0.05),且可抑制LTA的毒性作用(P＜0.05).LTA促进AM凋亡(P＜0.05),此作用可被MXF抑制(P＜0.05).LTA上调AM中TLR2、IL-1β、IL-8及TNF-α的mRNA表达(P＜0.05),各峰值时间及峰值分别为:12 h(3.56±0.03)、6 h(46.63±7.06)、12 h(28.07±1.24)、3 h(2.34±0.50),上调24 h IL-8蛋白水平,上述效应可被MXF抑制.结论 LTA对人AM有细胞毒性,促进AM凋亡,上调AM中TLR2及炎症因子IL-1β、IL-8及TNF-α的表达,MXF抑制LTA诱导的AM炎症及凋亡,可能在革兰氏阳性菌肺炎中发挥杀菌、抗炎、保护宿主AM免疫活性的作用.     

人参皂苷单体Rh2抑制人白血病KG1-α细胞增殖并促进其凋亡

目的研究人参皂苷单体Rh2对人白血病细胞KG1-α增殖、凋亡的影响。方法取对数生长期的KG1-α细胞,分别用不同浓度的人参皂苷单体Rb1、Rg1、Rh2诱导,另设空白对照组,阳性对照用阿糖胞苷。运用CCK-8法检测各单体对细胞增殖的影响,筛选出最强作用单体。用筛选出的皂苷单体诱导KG1-α细胞,用annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测人参皂苷单体对细胞凋亡的影响,PI染色流式细胞术检测对细胞周期的影响,Western blot法检测人参皂苷单体处理的KG1-α细胞中P53、P21、cylin D1、cleaved caspase-3的表达。结果 CCK-8实验结果显示人参皂苷Rh2、Rb1、Rg1、阿糖胞苷的IC50分别为(75、207、268、1058)μmol/L;与对照组相比,经人参皂苷Rh2诱导24、48 h后,annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术结果表明凋亡率由(5.37±0.02)%,分别增加至(8.37±0.015)%、(33.22±1.67)%(P0.05);同样处理,细胞周期检测结果显示:G0/G1期由(26.78±3.14)%,分别上升至(29.26±2.31)%、(44.77±2.26)%;S期由(65.43±2.22)%,分别下调至(51.46±0.57)%、(48.29±1.80)%;Western blot结果显示,cleaved-caspase 3、P53和P21在75μmol/L Rh2处理后表达上调,而cyclin D1表达下调。结论人参皂苷Rh2可抑制KG1-α细胞的增殖,促进细胞凋亡。     

BMS-345541对人骨肉瘤细胞MG63凋亡及其作用机制

目的研究BMS-345541对人骨肉瘤细胞MG63凋亡的影响及其可能的机制。方法以0、2、4、6、8、10μmol/L BMS-345541处理MG63细胞24、48 h后,用CCK-8法检测细胞存活率。用0、2、4、8μmol/L药物作用细胞24 h后,以PI染色法观察细胞凋亡情况、流式细胞仪检测细胞凋亡。以同样浓度作用细胞48 h,Western-blot检测cleaved Caspase-3蛋白表达情况。结果 (4-10)μmol/L的BMS-345541均可抑制MG63细胞的增殖,其抑制效应呈剂量-时间依赖性,48 h最低存活率只有(0.412±0.024)(P0.05)。PI染色荧光显微镜观察结果发现:随药物浓度增高,相同视野下正常细胞数逐渐降低,凋亡细胞数逐渐增高。流式细胞仪分析:0、2、4、8μmol/L的作用BMS-345541 24 h后,凋亡率分别为(5.2±0.78)%、(5.82±0.82)%、(8.86±1.71)%、(11.01±2.69)%,与对照组相比,8μmol/L组差异有统计学意义(P0.05)。Western blot结果显示MG 63细胞中的cleaved caspase-3蛋白表达量上调,与对照组相比,2、4、8μmol/L组差异均有统计学意义(P0.05)。结论 BMS-345541可抑制MG63细胞增殖,并诱导其发生凋亡,其作用机制可能与cleaved caspase-3表达上调有关。     

登革病毒Ⅱ型引起原代HDMECs通透性变化机制的初步研究

目的:了解登革病毒Ⅱ型(Dengue virus Type 2,DENV-2)感染原代人真皮微血管内皮细胞(Primary Human dermal micro-vascular endothelial cells,p HDMECs)引起细胞通透性改变的机制。方法:用103TCID50的DENV-2感染p HDMECs;于4、8、12、24、48 h Real time-PCR、免疫荧光法及流式细胞术检测DENV-2 NS1部分序列及蛋白;Transwell法检测细胞通透性;Real time-PCR和双抗体夹心ELISA法检测IL-6和IL-8的变化;流式细胞术检测24、48、72 h细胞凋亡。结果:DENV-2感染的p HDMECs病毒NS1基因相对表达上调,但未检测到病毒NS1蛋白;DENV-2感染的p HDMECs通透性在24、48 h显著升高;p HDMECs被感染72 h后凋亡也无明显变化;IL-6和IL-8 mRNA分别在8、24 h相对表达上调[IL-6:(2.49±0.5)倍,P0.05;IL-8:(6.82±1.69)倍,P0.05];对照组和感染组分泌的IL-6于8 h分别为(869.6±50.7)、(1 248.8±86.9)pg/ml,P0.05;IL-8于48 h分别为(967.6±156.6)、(1 331.0±86.3)pg/ml,P0.05。结论:DENV-2能感染p HDMECs;p HDMECs被DENV-2感染后,细胞的通透性增加与凋亡无关,与促炎性细胞因子IL-6和IL-8明显上调关系密切。     

抑制Hedgehog信号通路对前列腺癌DU125细胞增殖及凋亡的影响

目的研究Hedgehog(Hh)信号通路阻断剂环王巴明对前列腺癌Dul45细胞增殖及凋亡的影响。方法体外培养DU145细胞,以10、50、100μmol/L的环王巴明作用24 h,MTT法检测环王巴明对DU145细胞增殖的影响,流式细胞技术检测环王巴明对DU145细胞凋亡的影响,RT-PCR检测环王巴明对DU145细胞Gli-1 m RNA表达的变化,Westernblot检测环王巴明对DU145细胞Gli-1蛋白表达的变化。结果 MTT检测结果表明10μmol/L环王巴明组(85.01±2.61)%、50μmol/L环王巴明组(76.71±3.13)%和100μmol/L环王巴明组(69.10±4.11)%细胞活性较空白对照组(99.97±0.21)%降低(P0.05);流氏细胞技术检测结果表明10μmol/L环王巴明组(15.12±0.21)%、50μmol/L环王巴明组(24.97±0.24)%和100μmol/L环王巴明组(31.26±0.26)%细胞总凋亡率较空白对照组(2.56±0.28)%升高(P0.05);RT-PCR检测结果表明10μmol/L环王巴明组(0.69±0.06)%、50μmol/L环王巴明组(0.69±0.06)%和100μmol/L环王巴明组(0.69±0.06)%Gli-1m RNA表达水平较空白对照组(0.92±0.11)%降低(P0.05);Western blot检测结果表明10μmol/L环王巴明组(0.79±0.06)%、50μmol/L环王巴明组(0.59±0.05)%和100μmol/L环王巴明组(0.41±0.04)%Gli-1蛋白表达水平较空白对照组(0.94±0.11)%降低(P0.05)。结论 Hedgehog信号通路阻断剂环王巴明可以抑制DU145细胞增殖、诱导DU145细胞凋亡,其作用机制可能与下调GLi-1表达有关。     

抑制Hedgehog信号通路对脑胶质瘤U87细胞增殖及凋亡的影响

目的研究Hedgehog(Hh)信号通路阻断剂环王巴明对脑胶质瘤U87细胞增殖及凋亡的影响。方法体外培养U87细胞,以10、50、100μmol/L的环王巴明作用24h,MTT法检测环王巴明对U87细胞增殖的影响,流式细胞技术检测环王巴明对U87细胞凋亡的影响,RT-PCR检测环王巴明对U87细胞Gli-1 mRNA表达的变化,Western blot检测环王巴明对U87细胞Gli-1蛋白表达的变化。结果 MTT检测结果表明10μmol/L环王巴明组(85.11±2.61)%、50μmol/L环王巴明组(76.81±3.13)%和100μmol/L环王巴明组(69.20±4.11)%细胞活性较空白对照组(99.87±0.21)%降低(P0.05);流氏细胞技术检测结果表明10μmol/L环王巴明组(15.22±0.21)%、50μmol/L环王巴明组(24.87±0.24)%和100μmol/L环王巴明组(31.36±0.26)%细胞总凋亡率较空白对照组(2.66±0.28)%升高(P0.05);RT-PCR检测结果表明10μmol/L环王巴明组(0.68±0.06)%、50μmol/L环王巴明组(0.48±0.06)%和100μmol/L环王巴明组(0.30±0.06)%Gli-1mRNA表达水平较空白对照组(0.92±0.11)%降低(P0.05);Western blot检测结果表明10μmol/L环王巴明组(0.78±0.06)%、50μmol/L环王巴明组(0.58±0.05)%和100μmol/L环王巴明组(0.40±0.04)%Gli-1蛋白表达水平较空白对照组(0.94±0.11)%降低(P0.05)。结论Hedgehog信号通路阻断剂环王巴明可以抑制脑胶质瘤U87细胞增殖、诱导U87细胞凋亡,其作用机制可能与下调GLi-1表达有关。     

脂多糖预处理人脐带间充质干细胞的条件培养基对人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨脂多糖预处理人脐带间充质干细胞(hUCMSC)的条件培养基对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和凋亡的影响。方法本实验按随机数字表法将HUVEC分为对照组、条件培养基组和预处理条件培养基组。首先使用100 ng/mL脂多糖的内皮细胞培养基刺激3组HUVEC12 h后,对照组更换为原培养基,条件培养基组更换为hUCMSC的条件培养基,预处理条件培养基组更换为脂多糖预处理hUCMSC的条件培养基。分别于培养24、48、72 h时点采用MTT法测定HUVEC的增殖活性;台盼蓝排除染色法检测细胞增殖的数量,流式细胞仪检测细胞的增殖周期,Hoechst染色和流式细胞仪定性定量检测细胞凋亡的情况。方差分析统计分析比较数据。结果 MTT测定结果示:培养24 h时,对照组、条件培养基组和预处理条件培养基组细胞吸光度值为0.46、0.52和0.56;培养48 h时,3组的吸光度值为0.35、0.46和0.51;培养72 h时,3组的吸光度值为0.21、0.38和0.47;在3个时间点上,条件培养基组、预处理条件培养基组的吸光度值均高于对照组,且预处理条件培养基组的细胞量高于条件培养基组。台盼蓝染色计数的结果与MTT的结果趋势类似。培养24 h时,对照组、条件培养基组和预处理条件培养基组的细胞数量为(4.554±0.103)×10~3、(5.251±0.091)×10~3、(5.585±0.038)×10~3个;培养48 h时,3组的细胞数量分别为(3.465±0.087)×10~3、(4.659±0.116)×10~3、(5.347±0.099)×10~3个;培养72 h时,3组的细胞数量是(2.079±0.127)×10~3、(4.063±0.052)×10~3、(4.950±0.104)×10~3个;在3个时间点上,条件培养基组、预处理条件培养基组细胞的数量均显著高于对照组,差异有统计学意义(P值均小于0.05),且预处理条件培养基组的细胞数量显著高于条件培养基组,差异有统计学意义(P值均小于0.05)。流式细胞仪检测细胞增殖周期(G2/M+S期)的结果示:培养24 h时,3组细胞处于G2/M+S期的比例是(17.07±1.15)%,(22.52±1.61)%和(26.19±2.25)%;培养48 h时分别是(13.46±1.74)%,(18.67±2.07)%和(24.58±2.54)%;培养72 h时分别是(8.73±1.61)%,(14.31±1.93)%和(18.43±2.02)%;在培养的各个时间点上,条件培养基组、预处理条件培养基组细胞处于增殖周期的比例均显著高于对照组,差异有统计学意义(P值均小于0.05),预处理条件培养基组细胞处于增殖周期的比例显著高于条件培养基组,差异有统计学意义(P值均小于0.05)。Hoechst染色结果和流式细胞仪检测细胞凋亡结果趋势类似,具体为:培养24 h时,对照组、条件培养基组和预处理条件培养基组细胞的凋亡率分别为(30.78±3.20)%、(23.21±1.72)%和(17.69±1.81)%;培养48 h时分别为(26.02±2.06)%、(20.04±1.83)%和(15.03±1.56)%;培养72 h时分别为(22.41±1.63)%、(15.27±1.14)%和(11.25±1.07)%;在培养24、48、72 h时间点,3组中对照组细胞的凋亡率最高,而条件培养基组和预处理条件培养基组细胞的凋亡率显著低于对照组,差异均有统计学意义(P值均小于0.05),预处理条件培养基组细胞的凋亡率显著低于条件培养基组,差异均有统计学意义(P值均小于0.05)。结论脂多糖预处理hU CMSC的条件培养基发挥了显著促进HUVEC增殖活性和抑制HUVEC凋亡的作用。     

STAT3抑制剂Stattic激活ERK通路诱导THP-1细胞IL-8的产生及细胞凋亡

目的观察信号转导子与转录激活子3(STAT3)抑制剂Stattic对THP-1细胞产生白细胞介素8(IL-8)和细胞凋亡的影响,并探讨其机制。方法采用(0、 1、 5、 10、 15、 20)μmol/L Stattic处理THP-1细胞0、 1、 3、 6、 12、 24h,实时荧光定量PCR检测细胞IL-8、 IL-6、 IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA水平, ELISA检测细胞培养上清液IL-8蛋白水平,流式细胞术检测THP-1细胞的凋亡, Western blot法检测细胞STAT3、细胞外信号调节激酶(ERK)的蛋白磷酸化水平;采用(0、 1、 5、 10)μmol/L的ERK通路选择性抑制剂U0126预处理THP-1细胞,反转录PCR检测U0126对Stattic诱导THP-1细胞表达IL-8 mRNA水平的影响。结果 (10～20)μmol/LStattic显著上调IL-8在THP-1细胞中的mRNA和蛋白表达,仅(15、 20)μmol/LStattic能诱导THP-1细胞凋亡; Stattic处理THP-1细胞1、 3、 6、 12、 24 h,均显著上调IL-8的mRNA水平,以3 h时最为明显,在6 h以后呈时间依赖性上调IL-8的蛋白水平并诱导THP-1细胞凋亡;Stattic呈浓度和时间依赖性抑制STAT3磷酸化,时间依赖性地诱导ERK磷酸化,在(1、 5、 10、 15、 20)μmol/L时均显著诱导ERK磷酸化。另外, U0126显著抑制Stattic诱导的IL-8 mRNA表达。结论 STAT3抑制剂Stattic通过激活ERK信号通路诱导THP-1细胞凋亡和IL-8产生。     

心肌缺血再灌注损伤中白介素-17A诱发心肌细胞凋亡的作用机制

目的探讨心肌缺血再灌注损伤小鼠心机组织中白细胞介素-17A(IL-17A)的表达及其对心肌细胞凋亡的影响机制。方法采用结扎小鼠左冠状动脉前降支(LAD)法进行心肌缺血再灌注损伤模型构建;伊文思蓝(Evan’s blue)和2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色与心肌损伤标记物肌酸激酶(CK)、肌钙蛋白T(c TnT)血清含量检测小鼠心肌损伤情况;Western blot检测心肌缺血再灌注(I/R)后3 h、24 h、72 h不同时间点心肌组织IL-17A的表达水平,TUNEL染色和Caspase 3活力检测进一步反映细胞凋亡情况;原代分离培养心肌细胞,不同质量浓度(10、20、40、80 ng/ml)IL-17A处理细胞24 h,TUNEL染色检测细胞凋亡率、Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase 3、Bax、Bcl-2及PI3K/Akt通路蛋白表达变化。结果 I/R后心肌梗死区与缺血区(I/AAR)比率显著增加(P0.05),而心肌缺血区与左心室的比率(AAR/LV)无明显变化,且心肌损伤标记物肌酸激酶(CK)、肌钙蛋白T(cTnT)血清含量也明显增加;与Sham组(假手术组)相比,I/R后3 h、24 h、72 h时间点心肌组织IL-17A表达显著增加,心肌细胞凋亡率和Caspase 3活性亦明显增加;不同浓度IL-17A能够促进原代心肌细胞凋亡,诱导Caspase 3、Bax表达,抑制Bcl-2及PI3K/Akt通路蛋白表达。结论心肌缺血再灌注损伤小鼠IL-17A明显增加,高表达的IL-17A可能通过抑制PI3K/Akt通路来诱导心肌细胞凋亡。     

硫化氢对人PMN凋亡及P53/Bcl-2表达的影响

目的:研究硫化氢(H2S)对人中性粒细胞(PMN)凋亡及P53、Bcl-2表达的影响,以进一步探讨H2S抗脂多糖性肺损伤作用的机制。方法:采用体外分离和培养人血PMN。实验分3组,对照组:培养基中加入无菌生理盐水10mL/L;脂多糖(LPS)组:培养基中加入LPS100μg/L;LPS+硫氢化钠(NaHS)组:先LPS前1h向培养基中加入(1×10-5、1×10-4、1×10-3)mol/LNaHS。各组于24h后采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的DNA原位末端标记技术(TUNEL)检测PMN凋亡情况;采用流式细胞术检测PMN中P53及Bcl-2蛋白的表达。结果:与对照组比较,LPS组PMN凋亡百分率和DNA断裂百分率均显著减少(均P0.05);与LPS组比较,LPS+NaHS(1×10-5)组PMN凋亡百分率和DNA断裂百分率均有所升高,但无显著差异(均P0.05),LPS+NaHS(1×10-4)组及LPS+NaHS(1×10-3)PMN凋亡百分率和DNA断裂百分率均明显增加,并呈剂量依赖性(均P0.01)。与对照组比较,LPS组P53蛋白表达量显著减少(P0.05);与LPS组比较,LPS+NaHS(1×10-5)组P53蛋白表达量无明显变化(P0.05),LPS+NaHS(1×10-4)组及LPS+NaHS(1×10-3)组P53蛋白表达量明显增多,并呈剂量依赖性(均P0.01);各组Bcl-2蛋白表达量无明显变化(P0.05)。PMN中P53蛋白表达量与凋亡百分率的相关分析结果显示二者具有明显正相关关系(r=0.75,P0.01)。结论:NaHS促进PMN凋亡的机制可能与其上调P53蛋白的表达有关,而与Bcl-2蛋白无关。     

高糖预处理影响单核细胞对热灭活金黄色葡萄球菌刺激的反应

目的 观察高糖状态下热灭活金黄色葡萄球菌(HKSA)诱导的人单核细胞株THP-1凋亡特点,以及表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞介素(IL)-1β mRNA和IL-1β蛋白分泌规律.方法 体外培养THP-1单核细胞,分别以5.5 mmol/L葡萄糖(LG)和25.0 mmol/L葡萄糖(HG)培养12h～8d.将HG和LG培养6d的单核细胞加入HKSA.分别于HKSA加入前和加入后2～48 h提取单核细胞,检测细胞凋亡、IL-1β蛋白、iNOS和IL-1β mRNA表达.细胞凋亡采用Annexin V与PI双染法,流式细胞技术检测;IL-1β蛋白分泌采用ELISA法检测;提取细胞总RNA,反转录生成cDNA后采用实时定量逆转录聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)法,检测iNOS和IL-1β mRNA表达情况.结果 (1)高糖刺激THP-1单核细胞12 ～48 h后IL-1β蛋白、iNOS和IL-1β mRNA表达较刺激前显著增加(P＜0.05),iNOS和IL-1β mRNA表达在24 h达最高值,IL-1β蛋白分泌48 h达高峰.细胞凋亡在高糖刺激48 h～4 d较刺激前显著增加(P＜0.05).(2)两组细胞加入HKSA后6～48 h表达iNOS和L-1β显著高于刺激前(P＜0.01),24h达高峰,48 h表达下降;IL-1β蛋白分泌在48 h达最高值.两组细胞凋亡率在加入HKSA后12h、24h、48 h逐渐增加(P＜0.01).单核细胞加入HKSA前和加入HKSA后12h,高糖组与低糖组比较,高糖组IL-1β蛋白、iNOS和IL-1β mRNA表达均低于低糖组,凋亡率高于低糖组(P＜0.05).结论 高糖和HKSA对单核细胞分泌IL-1β蛋白、表达iNOS和IL-1β mRNA的影响与刺激时间有关;单核细胞处于持续高糖状态时,高糖可以增加细胞凋亡率,降低IL-1β蛋白分泌、iNOS和IL-1β表达.