pEGFP-C3 -insig2融合基因真核表达质粒的构建、表达及其对下游基因的影响

目的：构建insig 2基因的真核表达质粒, 转染3T3-L1细胞并观察对下游脂肪酸结合蛋白（AP2）mRNA、脂联素mRNA表达的影响.方法：采用RT-PCR法获取小鼠全长insig 2基因, 并克隆入真核表达载体pEGFP-C3中.酶切、测序鉴定后, 经脂质体转染入3T3-L1细胞, 通过荧光显微镜观察及RT-PCR检测其在3T3-L1细胞中的表达及下游基因的变化.结果：成功地构建了pEGFP-C3-insig 2融合基因的真核表达载体, 荧光显微镜观察到pEGFP-C3-insig 2融合蛋白在转染的3T3-L1细胞胞质中的表达, insig 2基因的转录明显上调.转染后24 h、 72 h较0 h AP 2 mRNA和脂联素mRNA的转录水平明显下调.结论：构建了insig 2基因的真核表达质粒, 在转染的3T3-L1细胞中insig 2的过表达可能影响该细胞的脂肪代谢.     

细胞因子信号传导抑制蛋白-1减轻细胞因子诱导胰岛β细胞促凋亡基因的表达

目的 构建稳定表达细胞因子信号传导抑制蛋白－1（SOCS-1）蛋白的细胞,探讨其在胰岛β细胞凋亡中的保护作用。方法 克隆大鼠SOCS-1基因,构建表达载体pEGFP-C1-SOCS1并转染入大鼠胰岛细胞系RINm5F中,构建稳定表达SOCS-1蛋白的细胞。分别用细胞因子IL-1β 、TNF-α、IFN-γ 、IL-1β联合IFN-r、IL-1β联合TNF-α及IFN-γ刺激24h,RT-PCR与Western blot检测凋亡相关指标。结果 成功构建了稳定表达SOCS-1蛋白的细胞。用IFN-γ、IL-1β联合IFN-r、IL-1β联合TNF-α及IFN-γ刺激后,未转染SOCS-1质粒的细胞iNOS转录水平显著升高。在用所有细胞因子刺激后,未转染SOCS-1质粒的细胞caspase-3表达及活性均显著升高。 结论 SOCS-1蛋白能减轻多种细胞因子诱导的胰岛β细胞促凋亡基因的表达。     

人IFN-β基因启动子荧光表达载体的构建及鉴定

目的构建人IFN-β基因启动子萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-IFNB1)及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体(pGE3-IFNB1),并在A549细胞中进行表达验证。方法采用PCR方法扩增出IFN-β启动子区片段,克隆入荧光表达载体pGL3 basic和pGE3 basic,并用脂质体瞬时转染A549细胞,6 h后用汉滩病毒(HTNV)感染转染后的细胞,24 h后检测重组载体在细胞内的表达情况。结果重组载体pGL3-IFNB1和pGE3-IFNB1分别经双酶切鉴定及序列测定证实载体构建正确;且在A549细胞内成功表达。经HTNV刺激后表达明显增加。结论成功构建了人IFN-β启动子荧光素酶报告基因载体(pGL3-IFNB1)及增强型绿色荧光蛋白表达载体(pGE3-IFNB1),为进一步研究病毒诱导产生IFN-β机制提供了有用的工具。     

β-catenin基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的构建β-catenin真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法提取工具细胞NIH3T3的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增β-catenin基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞NIH3T3细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。最后利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-β-catenin在NIH3T3细胞内的定位。结果β-catenin基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为2346 bp,并测序成功。Western blot检测到了GFP-β-catenin融合蛋白表达,分子量约为115kDa。pEGFP-β-catenin在工具细胞NIH3T3细胞中主要定位于细胞膜和细胞质。结论成功构建了β-catenin基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-β-catenin蛋白在NIH3T3细胞中主要定位于细胞膜和细胞质。     

乙型肝炎病毒e抗原对Bewo细胞Toll样受体3表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）对Bewo细胞Toll样受体3（TLR3）表达的影响。方法首先用TLR3配体polyI∶C处理Bewo细胞,观察细胞TLR3 mRNA表达的动力学变化。然后将2μg和8μg HBeAg重组质粒pcDNA3.1（＋）-HBe转染Bewo细胞,48 h后,用TLR3配体polyI∶C处理12 h。最后,用不同浓度的IFN-β处理Bewo细胞12 h。采用实时荧光定量RT-PCR和ELISA分别检测细胞TLR3 mRNA表达及细胞上清IFN-β水平。结果 polyI∶C可显著诱导Bewo细胞TLR3 mRNA表达（P〈0.05或0.001）,且呈时间和剂量依赖性;与对照组相比,转染8μg HBeAg重组质粒组polyI∶C诱导Bewo细胞TLR3表达及IFN-β水平显著下降（P〈0.001）,IFN-β可显著诱导Bewo细胞表达TLR3 mRNA（P〈0.001）,且呈剂量依赖性。结论 HBeAg可能通过下调IFN-β的产生而抑制Bewo细胞TLR3 mRNA的表达,为防治HBV宫内感染提供了新的途径。     

人SNW1基因的克隆、表达及其调控IFN-β表达的初步研究

目的克隆人SNW1基因并构建其真核表达载体,验证SNW1基因的表达和细胞定位,探索SNW1基因对IFN-β转录的调控作用。方法以来自293T细胞的c DNA为模板PCR扩增人SNW1基因并克隆至真核表达载体p CMV-N-Flag上,对重组质粒进行酶切鉴定和测序;通过瞬时转染和免疫印迹验证SNW1在细胞中的表达;通过免疫荧光确定SNW1在细胞内的定位;利用IFNB启动子荧光素酶双报告系统和仙台病毒(Se V)初步检测SNW1对IFN-β转录的调控作用。结果 PCR扩增出约1.6 kb的条带,大小与预期相符;酶切结果表明SNW1成功克隆至PCMV-N-Flag,进一步测序验证SNW1序列正确;Flag-SNW1蛋白大小约Mr70 000,主要定位于细胞核中;在Se V感染条件下过量表达SNW1可以显著增强IFN-β的表达,而过量表达的SNW1对IFN-β的本底表达有一定的抑制作用。结论成功克隆并构建了SNW1真核表达载体,初步显示SNW1对IFN-β的转录具有较强的调控作用。     

Mx1蛋白在颅内感染患者外周血中的表达及其作用初探

通过检测颅内感染患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中Mx1蛋白表达,探讨Mx1蛋白对颅内感染患者可能的免疫学作用及临床价值。应用流式细胞术、ELISA分别检测58例颅内感染患者(病毒性脑膜炎35例、化脓性脑膜炎23例)及16例健康对照组人群PBMC中Mx1蛋白表达及外周血中IFN-α、IFN-β分泌水平。结果显示病毒性脑膜炎组Mx1蛋白表达及IFN-α、IFN-β分泌均高于化脓性脑膜炎组患者及健康对照组人群(P0.01);而化脓性脑膜炎组与健康对照组人群之间无统计学差异(P0.05)。病毒性脑膜炎患者PBMC中Mx1蛋白表达上调,其可能参与了中枢神经系统抗病毒免疫过程,同时会为鉴别病毒性脑膜炎与化脓性脑膜炎提供一定临床帮助。     

单纯疱疹病毒糖蛋白C模拟表位mgC真核表达载体的构建和表达

目的为鉴定单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白C(gC)一个短肽模拟表位mgC基因作为HSVDNA表位疫苗的可能性 ,需构建含此表位的真核载体。方法合成编码该表位的单链DNA ,经不对称PCR扩增后 ,克隆入真核表达载体pcD NA3.1中 ,并在CHO细胞中表达。用RT PCR法鉴定mRNA的表达。结果含mgC基因的真核表达载体在哺乳动物细胞中可以在mRNA水平表达外源蛋白。结论成功地构建了HSVgC中短肽模拟表位mgC基因的真核表达载体 ,为进一步探讨该HSV模拟表位的功能奠定了基础。     

人4-1BB配体基因真核表达载体的构建、表达及其体外抗肿瘤效应

目的： 构建人4-1BB配体（h4-1BBL）全长基因的真核表达载体, 并在肿瘤细胞HT-29中转染表达; 探讨人4-1BBL基因转染的肿瘤细胞体外诱导的抗肿瘤活性.方法： 用RT-PCR从Raji细胞中克隆h4-1BBL全长基因, 测序后, 构建重组真核表达载体pcDNA3.1（-）-h4-1BBL.通过脂质体法以重组载体转染HT-29细胞, 用RT-PCR检测转染细胞中h4-1BBL mRNA的表达; 用流式细胞术检测转染细胞表面h4-1BBL分子的表达.分离外周血单个核细胞（PBMC）, 用抗CD3 mAb扩增T细胞, 并与h4-1BBL基因转染及未转染的HT-29细胞混合培养.用MTT比色法检测CTL的增殖及杀伤活性; 用流式细胞术检测分泌IFN-γ的T细胞.结果： 从Raji细胞中克隆到h4-1BBL全长cDNA, 测序完全正确.构建的h4-1BBL基因真核表达载体在HT-29中获得稳定表达.与未转染的细胞相比较, h4-1BBL基因转染的肿瘤细胞HT-29能更有效地刺激T细胞活化、增殖, 促进IFN-γ分泌, 并能有效地诱导CTL产生针对野生型HT-29细胞的特异性杀伤.结论： 成功地构建pcDNA3.1（-）h4-1BBL重组真核表达载体.4-1BBL基因转染的肿瘤细胞介导的协同刺激信号, 能增强野生型肿瘤细胞的免疫原性, 诱导T细胞产生有效的抗肿瘤免疫应答.     

PolyI:C介导气道平滑肌细胞TLR3和IL-8、Eotaxin的表达

目的:观察PolyI:C对大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)Toll样受体3(TLR3)及炎性细胞因子表达的影响,探讨ASMCs内TLR3表达与气道炎症间的关系。方法:体外培养大鼠ASMCs,传代培养后分为正常对照组和PolyI:C刺激组,PolyI:C刺激组又分为不同的时间点。用RT-PCR法检测细胞TLR3mRNA的表达;Western blot法检测ASMCs中核因子κB(NF-κB)的蛋白含量;ELISA法检测细胞培养上清Eotaxin和IL-8的浓度。结果:与正常对照组相比较,PolyI:C刺激组ASMCs内TLR3mRNA和NF-κB蛋白表达增加(P0.05);ASMCs培养上清液中IL-8和Eotaxin浓度增加(P0.05),并存在时间依赖性。结论:PolyI:C可以上调ASMCs内TLR3的表达,活化NF-κB,增加趋化因子Eotaxin和IL-8的浓度,参与哮喘的气道炎症反应。     

鼠IFN-λ2 CHO细胞系建立及生物学活性的研究

目的 稳定表达鼠IFN-λ2并对其生物学活性进行研究.方法 用水疱口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)刺激小鼠脾脏细胞,克隆mIFN-λ2全长基因,构建真核表达载体PCAGG-EGFP-mIFN-λ2,并在CHO细胞稳定表达,且在小鼠黑色素瘤B16细胞上进行抗病毒活性测定;构建MDBK-Mxp-Luc细胞系诱导Mx1抗病毒蛋白产生.结果 pMD18-T-mIFN-λ2双酶切鉴定,出现582 bp大小的条带,成功构建了PCAGG-EGFP-mIFN-λ2真核表达载体;稳定表达mIFN-λ2 CHO的细胞株分泌的上清中mIFN-λ2蛋白在B16细胞上的抗病毒活性为10~4 AU/ml;mIFN-λ2蛋白诱导鼠Mx1抗病毒蛋白的表达,9～12 h达高峰,24 h后消失(P<0.05).结论 建立了稳定表达mIFN-λ2的CHO细胞株,其分泌型mIFN-λ2蛋白具有明显的抗病毒活性,且与诱导Mx1抗病毒蛋白密切相关.     

真核表达载体pEGFP-claudin-1的构建及其在293T细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中进行表达.方法:用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增claudin-1开放读码框(ORF)基因,将其插入到pEGFP-C3载体的Xho Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点,构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,酶切鉴定并测序.通过脂质体法转染293T细胞,进行荧光检测和Western blot分析.结果:构建了含有claudin-1 ORF的真核表达质粒pEGFP-claudin-1,转染293T细胞后,经荧光可见细胞膜有EGFP-claudin-1 融合蛋白的表达,Western blot检测发现有相对分子质量(Mr)49 000的蛋白条带.结论:成功地构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中表达,为研究claudin-1的功能奠定了基础.     

SA11株轮状病毒VP3基因的克隆表达及致病机制的初步研究

目的克隆、真核表达SA11株轮状病毒VP3基因,对其致病机制进行了初步研究。方法用RT-PCR从SA11株总RNA中扩增出VP3基因,并克隆到真核表达载体pEGFP-C1上,构建重组表达载体pEGFP-C1/VP3,用荧光显微镜及Western blot检测VP3基因在真核细胞(293T细胞)的表达情况。以重组质粒pEGFP-C1/Rb94为对照,用流式、荧光显微镜、Western blot观察VP3蛋白对GFP基因表达的抑制作用。结果在293T细胞中检测到VP3基因的表达;pEGFP-C1/VP3组的流式荧光强度、Western blot的蛋白条带大小均明显弱于pEGFP-C1/Rb94对照组。结论成功构建了pEGFP-C1/VP3真核穿梭表达载体,在真核细胞中有效表达,实验结果提示VP3蛋白可能对宿主细胞大分子蛋白的表达有抑制作用,可能是轮状病毒的一种新的致病机制。     

病毒拟似物Poly(I:C)诱导人卵巢颗粒细胞病毒反应蛋白viperin表达

目的探讨病毒拟似物对人卵巢颗粒细胞病毒反应蛋白表达的影响,明确颗粒细胞在卵巢病毒感染时的反应。方法将原代培养的人卵巢颗粒细胞分为对照组、病毒拟似物Poly(I:C)处理组、卵泡刺激素(FSH)处理组。CCK8法测定细胞增殖活力、real-time PCR法测定干扰素-β(IFN-β)、viperin mRNA表达,Western blot法测定viperin蛋白表达。结果原代接种培养5 d后,FSH可诱导颗粒细胞增殖(P0.05),Poly(I:C)10μg/m L对细胞增殖活力无显著影响。Poly(I:C)刺激后24 h内诱导IFN-β、viperin mRNA表达明显上调,其中IFN-β于刺激后2 h表达水平达到峰值(P0.05),viperin于刺激后8 h达到峰值(P0.05),刺激后24 h,两者mRNA表达水平均回归刺激前水平。Poly(I:C)诱导颗粒细胞viperin蛋白表达,水平随Poly(I:C)浓度上升。结论病毒拟似物能够诱导颗粒细胞表达病毒反应蛋白viperin。     

hCAP基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建hCAP真核表达载体并检测融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:提取工具细胞CV-1的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hCAP基因的cDNA全长,并将其克隆至pEGFP-C1表达载体中。进一步将构建的重组载体进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot。最后利用激光共聚焦显微镜观察pEGFP-hCAP在NIH3T3成纤维细胞内的定位。结果:hCAP基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为3 879 bp,测序证实成功。Western blot检测GFP-hCAP融合蛋白表达,相对分子质量(Mr)约为169 000。pEG-FP-hCAP在NIH3T3细胞中主要定位于细胞周边。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-hCAP,融合蛋白在NIH3T3细胞中主要定位于细胞周边。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体真核表达载体的构建及表达

背景：单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体开放读码框1真核表达载体的构建可以为研究单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体开放读码框1在病毒潜伏复发中的功能奠定基础。 目的：构建含存单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体开放读码框1的真核表达载体,并通过转染非洲绿猴肾细胞(Vero),验证载体的体外表达情况。 方法：根据单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体开放读码框1基因序列设计一对引物,以单纯疱疹病毒Ⅱ型 333标准株基因组为模板PCR法扩增出开放读码框1基因,克隆至真核表达载体上,并进行酶切鉴定以及测序;利用X-fect转染试剂盒将重组质粒pEGFP-C2/潜伏相关转录体开放读码框1转染vero细胞,RT-PCR检测其mRNA水平的表达,并用荧光倒置显微镜观察融合蛋白的表达。 结果与结论：开放读码框1基因的体外扩增目的片段为741 bp,所构建的真核表达载体pEGFP-C2/潜伏相关转录体开放读码框1经双酶切鉴定,与预期大小一致,测序结果与NCBI收录的开放读码框1基因序列一致;重组质粒pEGFP-C2/潜伏相关转录体开放读码框1转染vero细胞后,RT-PCR 验证有目的基因的转录,荧光显微镜观察到融合蛋白在转染的Vero细胞中表达。表明成功构建pEGFP-C2/潜伏相关转录体开放读码框1真核表达载体,并且实现其在非洲绿猴肾细胞(Vero)中的表达。     

人滋养细胞TLR3信号通路活化抑制血管生成因子表达

目的 研究人类妊娠早期滋养细胞Toll样受体3(TLR3)活化对胎盘血管生成相关因子表达的影响,探讨该通路在妊娠期高血压疾病中的作用.方法 以TLR3配体刺激原代滋养细胞和永生化滋养细胞系swan71,不同时间点收集上清液及细胞.ELISA测定培养上清液中sFlt-1和PIGF浓度,real-time PCR法测定上述分子mRNA表达水平.结果 Poly(I∶C)刺激swan71后24、48和120 h,sFlt-1浓度显著高于未处理组(P＜0.05).Poly(I∶C)刺激原代滋养细胞后sFlt-1 mRNA水平升高,PlGF mRNA水平下降(P＜0.05).Poly(I∶C)诱导sFlt-1 mRNA的表达呈时间和剂量依赖性,24 h时效分析见其在处理2h达到峰值,PlGF mRNA则跌至最低水平(P＜0.05).Poly(I∶C)处理8～12 h,TLR3 mRNA水平亦显著升高(P＜0.05).结论 滋养细胞TLR3信号通路激活诱导sFlt-1表达,抑制PlGF表达,导致血管生成障碍,可能参与妊娠期高血压疾病的发生.     

FBXO6基因真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的 构建F盒蛋白6(FBXO6)基因真核表达载体.方法 采用PCR方法合成含有EcoR Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切位点的FBXO6 cDNA全长.分别构建载体pEGFP-C1-FBXO6和pEGFP-C1-anti-FBXO6,采用菌落PCR、双酶切鉴定以及测序证实cDNA片段大小和序列正确.将载体pEGFP-C1-FBXO6和pEGFP-C1-anti-FBXO6分别转染HEK293T细胞,Western blot法检测FBXO6蛋白的表达.结果 pEGFP-C1-FBXO6和pEGFP-C1-anti-FBXO6包含大小、序列正确的FBXO6片段;FBXO6蛋白在转染pEGFP-C1-FBXO6的293T细胞中高表达;在转染pEGFP-C1-anti-FBXO6的HEK293T细胞中表达降低.结论 成功构建FBXO6基因正义真核表达载体pEGFP-C1-FBXO6和反义真核表达载体pEGFP-C1-anti-FBXO6.     

HPV18型E2蛋白高表达对巨噬细胞凋亡及其分泌功能的影响

目的:研究HPV18 E2及其N端(TAD)、C端(DBD)与GFP融合蛋白瞬时高表达对巨噬细胞(MΦ)凋亡及分泌活性的影响,为进一步研究E2蛋白在HPV18致癌机制中的作用奠定实验基础.方法:通过PCR从现有真核表达载体pEGFP-C1/E2上分别扩增出TAD、DBD基因片段,并构建真核表达载体pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD.将3种真核表达载体及pEGFP-C1分别转染MΦ,用倒置荧光显微镜观察它们的表达与定位,并以抗GFP抗体为一抗作Western blot检测它们的表达.通过3种融合蛋白在MФ内的瞬时高表达,在转染48 h后分别检测各组细胞培养基中TNF-α和IL-1β的含量,并收集MΦ经染色以及流式细胞术(FCM)观察检测其凋亡.结果:GFP-E2融合蛋白主要表达于细胞核,细胞质内也有表达,而GFP-DBD融合蛋白仅表达于细胞核内,GFP-TAD仅表达于细胞质.GFP-E2、GFP-TAD融合蛋白在MΦ内高表达后MΦ凋亡率上升,细胞因子TNF-α和IL-1β分泌量增加,且GFP-TAD作用强于GFP-E2.而EGFP-DBD无此作用.结论:HPV18 E2及其TAD与EGFP融合蛋白瞬时高表达可诱导MΦ凋亡并上调其分泌细胞因子TNF-α和IL-1β.     

靶向大鼠TGF-β1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

构建并鉴定靶向大鼠TGF-β1基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,为探索肝纤维化的基因治疗提供有力工具。根据大鼠TGF-β1基因的mRNA序列设计并合成2条编码shRNA的特异性寡核苷酸片段,另选通用阴性对照序列HK,将上述片段退火后分别克隆入线性化质粒载体PGenesil-1.1中,构建出含靶基因片段的shRNA真核表达载体PGenesil-TGF-β1-A、PGenesil-TGF-β1-B及PGenesil-HK,行酶切鉴定及测序分析,并采用脂质体介导法体外转染Hela细胞,荧光显微镜观察转染结果。经酶切和测序鉴定证实,构建的shRNA成功插入到载体,重组质粒的插入序列与设计的靶基因片段完全一致,3种重组质粒均能转染入Hela细胞表达绿色荧光。成功构建出靶向大鼠TGF-β1基因的shRNA真核表达载体,为后续研究抗肝纤维化的基因药物奠定了实验基础。