活化型肝星状细胞中miRNA-193下调α-平滑肌肌动蛋白的表达

目的:研究活化型肝星状细胞(HSC)中miRNA-193(miR 193)下调肝纤维化相关基因的表达。方法:将大鼠miR-193的前体序列(pre-miR-193)克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和DNA测序鉴定,获得质粒pcDNA3.1-miR-193;通过脂质体转染法将质粒转染到大鼠的活化型肝星状细胞(HSC-T6)中,采用荧光素酶报告基因分析法和免疫印迹检测肝纤维相关基因的表达。结果:构建的真核表达载体pcDNA3.1-miR-193经酶切鉴定及DNA测序显示,目的片段的大小与预期结果一致;荧光素酶报告基因分析法和免疫印迹检测显示,重组质粒转染到活化型H-SC-T6中后,肝纤维化相关基因的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达呈明显下降趋势,而胶原蛋白Ⅰα1和Ⅰα2的下调作用不明显。结论:miR-193能抑制活化型肝星状细胞中肝纤维化相关基囚α-SMA的表达。     

miR-16促进Neuro2a细胞的凋亡

目的 检测过表达miR-16对小鼠Neuro2a细胞周期和凋亡的影响,探讨miR-16在肿瘤发病过程中的可能机制.方法 构建能够在细胞中过表达miR-16的真核表达载体pcDNA3.1-miR-16,利用Real-time PCR验证了表达载体的过表达效应.应用pcDNA3.1-miR-16载体转染Neuro2a细胞,...     

miR-144靶向Bcl-2抑制儿童急性淋巴细胞白血病细胞增殖并促进凋亡的分子机制研究

目的:观察miR-144对儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)CEM/C1细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:运用qRT-PCR法和Western blot法检测非恶性血液病患儿脊髓组织(Normal组)、ALL患儿脊髓组织(ALL组)、CEM/C1细胞(CEM/C1组)、ALL癌细胞珠MOLT-4(MOLT-4组)和CCRF-CEM(CCRF-CEM组)中miR-144、Bcl-2mRNA和Bcl-2蛋白表达水平并比较组间差异;将不同质粒以脂质体法转染至CEM/C1细胞,分为miR-NC组(转染miR-NC)、miR-144组(转染miR-144mimics)、inhibitor NC组(转染inhibitor NC)、miR-144inhibitor组(转染miR-144inhibitor)、si-NC组(转染si-NC)、si-Bcl-2组(转染si-Bcl-2)、miR-144+Vector组(miR-144mimics和pcDNA 3.1共转染)、miR-144+Bcl-2组(miR-144mimics和pcDNA 3.1-Bcl-2共转染),Western blot检测各组细胞中Bcl-2蛋白表达;MTT法检测各组细胞增殖;流式细胞术检测各组细胞凋亡;双荧光素酶报告基因实验检测各组细胞的荧光素酶活性。结果:与Normal组相比,ALL组miR-144表达显著降低,Bcl-2mRNA和蛋白表达均显著升高(P0.01)。与CEM/C1组比较,MOLT-4组和CCRF-CEM组miR-144表达显著升高,Bcl-2mRNA和蛋白表达均显著降低(P0.01)。与miR-NC组相比,miR-144组细胞增殖率降低,凋亡率升高,Bcl-2(WT)细胞的荧光活性降低(P0.01)。与si-NC组相比,si-Bcl-2组细胞增殖率降低,凋亡率升高(P0.01)。与miR-144+Vector组相比,miR-144+Bcl-2组细胞增殖率降低,凋亡率升高(P0.01)。结论:miR-144可抑制儿童ALL癌细胞增殖,促进其凋亡,可能与其能靶向Bcl-2有关,或可为儿童ALL治疗提供新的靶点。     

miR-144通过靶向Atg4a调控卡介苗和雷帕霉素诱导的RAW264.7细胞自噬

目的研究卡介苗(BCG)对RAW264.7细胞中与细胞自噬相关的miRNA(miR-21、miR-181a、miR-155和miR-144)表达的影响,并以miR-144为研究对象,验证miR-144对自噬相关基因Atg4a的靶向调控关系,探究其在结核分枝杆菌感染宿主细胞过程中调控细胞自噬途径的作用机制。方法分别对RAW264.7巨噬细胞进行饥饿处理12 h、50 ng/m L雷帕霉素作用2 h、10 nmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用12 h;BCG刺激RAW264.7巨噬细胞12 h、24 h、48 h后,收集细胞,提取总RNA;利用实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-21、miR-181a、miR-155及miR-144的表达水平;构建p MIR-Report-Atg4a及p MIR-ReportAtg4a mut重组质粒,利用双萤光素酶报告系统、qRT-PCR及Western blot法验证miR-144与Atg4a的靶向作用关系。结果 BCG刺激RAW264.7巨噬细胞后,可使miR-21、miR-155及miR-144表达上调,miR-181a表达下调;经雷帕霉素诱导的细胞自噬,4种miRNA表达量与正常组相比分别上调约64倍、52倍、14倍、1倍;与正常组相比,3-MA处理细胞组,miR-21、miR-144、miR-155、miR-181a的表达量分别下调1.22倍、1.05倍、1.54倍及12.5倍;双萤光素酶报告系统及Western blot法证实,miR-144可靶向作用于Atg4a-3'UTR并抑制其表达。结论 miR-144可靶向抑制自噬相关基因Atg4a的表达,参与调控RAW264.7巨噬细胞的自噬过程。     

miR-142-3p 靶向ATG4c 调控RAW264.7 巨噬细胞自噬

目的:研究miR-142-3p 对自噬相关基因ATG4c 的靶向调控作用,探究miR-142-3p 影响RAW264.7 细胞自噬途径的作用机制。方法:生物信息学软件分析miR-142-3p 的靶基因为ATG4c,构建pMIR-Report-ATG4c 和pMIR-Report-ATG4c mut 重组质粒,双荧光素酶报告系统、qRT-PCR、Western blot 验证miR-142-3p 与ATG4c 的靶向作用;将做不同处理的RAW264.7 细胞分为4 组:正常细胞作为对照、50 ng/ ml 雷帕霉素作用2 h、EBSS 饥饿作用12 h、10 nmol/ L 的3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用12 h 后,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-142-3p 不同干预组中的相对表达情况;将miR-142-3p mimics、miR- 142-3p inhibitor 及miR-142-3p control 分别转染到RAW264.7 细胞中,检测miR-142-3p 和LC3域的相对表达。结果:双荧光素酶报告系统、qRT-PCR、Western blot 验证miR-142-3p 通过靶向作用于ATG4c 的3忆-UTR 抑制其表达;与对照组相比,雷帕霉素和饥饿处理的RAW264.7 细胞miR-142-3p 明显上调,而3-MA 处理组miR-142-3p 明显下调;与miR-142-3p control 组相比,转染miR-142-3p mimics 组中LC3域蛋白表达显著下调,而miR-142-3p inhibitor 组中表达显著上调。结论:miR-142-3p 通过靶向调控自噬相关基因ATG4c,参与RAW264.7 小鼠巨噬细胞自噬的调控。     

雷帕霉素对RAW264.7细胞6种miRNAs表达的影响及miR-20a对ATG16L1的靶向调控作用

目的:探讨雷帕霉素对miR-17-92簇中的6种miRNAs表达的影响,及miR-20a对ATG16L1基因的靶向调控作用。方法:利用qRT-PCR检测雷帕霉素对RAW264.7细胞miR-17-92簇中的miR-20a等6种miRNAs的表达水平;通过双荧光素酶报告系统、Western blot,验证miR-20a对ATG16L1的靶向调控关系。结果:与正常组相比,雷帕霉素组RAW264.7细胞的miR-17、miR-18a、miR-20a表达水平显著上调(P0.05);3-MA组RAW264.7细胞的miR-20a表达水平显著下调(P0.05)。双荧光素酶报告系统结果显示,miR-20a可靶向ATG16L1-3'-UTR,抑制其表达;Western blot结果显示,miR-20a能明显抑制ATG16L1蛋白的表达,说明miR-20a可靶向抑制ATG16L1的表达,参与调控细胞自噬过程。结论:miR-20可靶向抑制Atg16L1的表达,参与调控RAW264.7细胞自噬过程。     

miR-15a在脓毒性休克内皮细胞模型中的表达及作用机制

目的探究miR-15a在脓毒性休克内皮细胞模型中表达的意义及作用机制。方法运用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测健康对照者(n=25),脓毒症患者(n=34)和脓毒性休克患者(n=26)血浆样本中miR-15a的表达水平。在人类脐静脉内皮细胞株HUVEC中转染miR-15a模拟物和miR-15a抑制物后,LPS刺激4 h后,TER(transendothelial electrical resistance)法测定各组HUVEC跨内皮电阻,并计算通透性。构建荧光素酶报告载体pMIR-肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MYLK)的3'UTR,利用荧光素酶活性检测鉴定miR-15a的预测靶基因MYLK。qRT-PCR和Western blot法分别检测MYLK的mRNA和蛋白质的表达水平。结果 miR-15a在脓毒性休克患者血浆中的含量较脓毒症患者显著下降(P0.05)。转染miR-15a模拟物能够抑制LPS作用HUVEC后细胞通透性的升高,而转染miR-15a抑制剂则能促进LPS作用HUVEC后细胞通透性的升高。转染miR-15a模拟物显著抑制荧光素酶的活性(P0.05),并显著下调HUVEC细胞中MYLK的mRNA(P0.05)和蛋白质的表达水平;相反地,转染miR-15a抑制物则显著上调了HUVEC细胞中MYLK的mRNA(P0.05)和蛋白质的表达水平。结论miR-15a能够抑制LPS作用HUVEC后细胞通透性的改变,其可能的作用机制是下调了MYLK的表达。     

Pax-8 基因真核表达载体的构建及其功能的初步研究

目的: 构建大鼠 Pax-8 基因全长序列的真核表达载体pcDNA3.1(+),并将重组质粒转染至心肌细胞系H9c2中进行表达,测定转染后 Pax-8 基因对心肌细胞增殖及凋亡的影响。方法: 酶切pCMV sport6- Pax-8 获得大鼠 Pax-8 全长基因,通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-Pax-8。限制性酶切鉴定和DNA测序鉴定插入片段。将重组质粒经脂质体法转染至大鼠心肌细胞系H9c2细胞中,RT-PCR法及Western blotting法分别检测转染后Pax-8 mRNA及蛋白表达水平。CCK-8法检测细胞增殖;以血清饥饿诱导心肌细胞凋亡,同时进行 Pax-8 质粒转染,流式细胞仪检测细胞凋亡指数,Western blotting法检测活化caspase-3的表达。结果: 成功构建了大鼠pcDNA3.1(+)-Pax-8真核表达载体,且证实转染后心肌细胞的 Pax-8 mRNA 及蛋白表达均明显高于空白对照组(P<0.05)及空质粒组(P<0.05)。转染 Pax-8 基因能提高心肌细胞的增殖能力(P<0.05),明显抑制血清饥饿引起的细胞凋亡(P<0.01),同时下调活化caspase-3的表达(P<0.01)。结论: 通过基因重组技术成功使得 Pax-8 基因在心肌细胞中过表达。 Pax-8 基因可能通过促进心肌细胞增殖及抑制心肌细胞凋亡从而参与胚胎心脏发育的过程。     

miR-508-5P慢病毒过表达载体的构建及对S期激酶相关蛋白2靶向调控作用

目的构建miR-508-5p慢病毒过表达载体,探讨其对SKP2基因的靶向调控作用。方法基于化学法合成miR-508-5p茎环结构RNA,将其克隆入线性化的pSicoR质粒中,经双酶切及测序鉴定,将阳性重组体转染至HEK293T细胞;同时构建与miR-508-5p互补靶基因SKP2的3'非翻译区(3'UTR),将其克隆入线性化的pMIR-Report载体中。通过相对荧光素酶活性、Western blot法及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法验证miR-508-5p与SKP2 3'UTR的靶向调控关系。结果经PCR、酶切及测序结果证明成功构建了pSicoR-miR-508-5p及pMIR-Report-SKP2-3'UTR重组质粒,并通过实验证实miR-508-5p过表达明显抑制SKP2的蛋白表达水平及mRNA相对含量(P0.05);抑制miR-508-5p的表达,则明显上调SKP2的蛋白表达水平及mRNA相对含量(P0.05)。结论成功构建pSicoR-miR-508-5p慢病毒过表达载体,证实通过靶向作用于SKP2-3'UTR的特异序列直接抑制SKP2基因的表达。     

真核过表达载体共转染3个胰岛发育关键基因在小鼠胎肝细胞内的表达*

背景：大量文献表明,向肝脏细胞引入一个多个胰岛发育的关键因子(如Pdx1、MafA及Ngn3)可以使肝细胞向胰岛细胞的方向进行转化。 目的：构建以pcDNA3.1(+)为骨架的质粒载体并共同转染胰十二指肠同源框蛋白(Pdx1)、神经源素3(Ngn3)及V型肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A(MafA)至小鼠胎肝细胞并检测其表达情况。 方法：以基因组或小鼠胰腺cDNA为模板扩增Pdx1、MafA及Ngn3三个目的基因,应用分子生物学技术,将3个目的片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点中,构建小鼠系列真核过表达载体pcDNA3.1(+)-MafA ORF,pcDNA3.1(+)-Pdx-1 ORF,pcDNA3.1(+)-Ngn3 ORF通过Lipofectamine2000介导的脂质体转染小鼠胎肝细胞系BNL CL.2,用反转录PCR以及间接免疫荧光法检测3个目的基因的表达情况。 结果与结论：目的基因克隆正确,反转录PCR,间接免疫荧光法证实了脂质体转染后小鼠胎肝细胞中有Pdx1、Ngn3以及MafA的表达。结果表明,真核过表达载体pcDNA3.1(+)-MafA ORF,pcDNA3.1(+)-Pdx-1 ORF,pcDNA3.1(+)-Ngn3 ORF可成功构建,并能够将Pdx1、Ngn3以及MafA三个基因转至小鼠胎肝细胞进行表达。关键词：胰十二指肠同源框蛋白;神经源素3;V型肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A;脂质体转染;BNL CL.2细胞株;胰岛细胞;基因表达 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.18.018     

miR-21真核表达载体的构建及其活性鉴定

目的:构建miR-21的真核表达载体, 并使其在骨肉瘤MG63细胞中表达, 为研究miR-21对骨肉瘤细胞MG63的作用打下基础.方法:根据miRNA的成熟序列以及附近约200多碱基共433个碱基序列, 设计PCR引物, PCR扩增, 退火后用T4连接到线性化的pcDNA3.1(+)质粒中, 并对重组质粒进行双酶切、菌落PCR及测序分析, 鉴定完全正确的重组质粒转染骨肉瘤细胞MG63, G418(400 mg/L)筛选4周获得miR-21稳定表达细胞系, 用Northern blot及real time RT-RCR法鉴定pcDNA3.1(+)-miR-21可在真核细胞中过表达.结果:成功构建了miR-21的真核表达载体, 并获得稳定转染重组质粒的细胞系.结论:miR-21的真核表达载体在骨肉瘤细胞MG63中稳定高表达, 为进一步研究miR-21在骨肉瘤MG63中的功能及基因调控机制奠定了实验基础.     

miR-181b慢病毒载体的构建及其对HEK-293T细胞MAPK1基因的靶向调控作用

目的构建miR-181b慢病毒过表达载体,探讨其对HEK-293T细胞MAPK1基因的靶向调控作用。方法分别构建p SicoR-miR-181b及pmiR-Report-MAPK1过表达载体,转染HEK-293T细胞后,用实时荧光定量PCR(RTq PCR)法检测MAPK1 mRNA的表达、用Western blot检测MAPK1蛋白的表达及用双荧光素酶报告基因活性验证miR-181b与MAPK1的靶向调控关系。结果成功构建了p SicoR-miR-181b及pmiR-Report-MAPK1重组质粒,miR-181b过表达明显抑制HEK-293T细胞MAPK1蛋白及mRNA表达水平(P0.05),抑制miR-181b的表达后,MAPK1的蛋白及mRNA的表达水平上调(P0.05)。结论成功构建p SicoR-miR-181b慢病毒载体,并证实通过靶向作用MAPK1-3'UTR的特异序列直接抑制MAPK1基因的表达。     

人IL-8正义和反义真核表达载体的构建与表达

目的:构建人IL- 8正义和反义真核表达载体.方法:RT-PCR扩增正义和反义IL- 8基因片段后, 将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+), 通过菌落PCR、双酶切及测序进行鉴定后, 采用脂质体法分别瞬时转染至人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3细胞中, 并用RT-PCR和ELISA法检测细胞转染后IL- 8的表达水平.结果:经验证, 重组人IL- 8正义/反义真核表达载体构建正确.pcDNA3.1(+)-ssIL- 8转染A2780细胞后, 其IL- 8 mRNA及蛋白表达水平均显著增加;而pcDNA3.1(+)-asIL- 8转染SKOV3细胞后, 其IL- 8分泌水平降低.结论:成功构建了人IL- 8正义/反义真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ssIL- 8/pcDNA3.1(+)-asIL- 8, 为后续研究IL- 8在卵巢癌及其他肿瘤中的作用打下基础.     

人sTNFR1真核表达载体构建及体外抑制TNF-α细胞毒效应

目的构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因(sTNFR1)的真核表达载体,研究sTNFR1对TNF-α细胞毒效应的抑制作用。方法以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增人sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3.1(-)重组质粒亚克隆,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1(-)-sTNFR1瞬时转染QSG7701细胞,半定量PT-PCR法检测sTNFR1mRNA的表达,MTT法检测sTNFR1对TNF-α细胞毒效应的抑制作用。结果人sTNFR1基因被正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-);通过与3-磷酸甘油醛(GAPDH)比较,pcDNA3.1(-)-sTNFR1转染的QSG7701细胞中sTNFR1mRNA表达量明显高于空载体对照组和空细胞对照组(P<0.05);pcDNA3.1(-)-sTNFR1瞬时转染QSG7701细胞,TNF-α对其细胞毒性作用受到抑制,当TNF-α浓度为100μg/L时pcDNA3.1(-)-sTNFR1/QSG7701的细胞毒性较QSG7701下降64.8%。结论成功地构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-sTNFR1,TNF-α对瞬时转染pcDNA3.1(-)-sTNFR1/QSG7701的细胞株细胞毒性作用受到抑制。     

miR-107抑制胶质瘤细胞的体外增殖、迁移和侵袭

目的探讨miR-107对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的调控机制。方法运用RT-qPCR检测人正常的星形胶质细胞系NHA、神经胶质瘤细胞系U87、A172、U251中miR-107和FOXK1的表达;将细胞分为miR-NC组(转染miR-NC)、miR-107组(转染miR-107 mimics)、si-NC组(转染si-NC)、si-FOXK1组(转染si-FOXK1)、miR-107+pcDNA3.1组(共转染miR-107 mimics和pcDNA3.1)和miR-107+pcDNA3.1-FOXK1组(共转染miR-107 mimics和pcDNA3.1-FOXK1);用脂质体法分别转染至U87细胞;CCK-8法检测细胞的增殖;Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭;Western blot检测细胞中FOXK1的蛋白表达;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性。结果与正常的星形胶质细胞NHA相比,神经胶质瘤细胞U87、A172、U251中miR-107表达明显下调,FOXK1表达明显上调(P<0.05);过表达miR-107、敲减FOXK1均可抑制U87细胞的增殖、迁移和侵袭;miR-107可抑制野生型FOXK1的细胞荧光活性,并负向调控FOXK1的表达;过表达FOXK1可逆转miR-107对U87细胞增殖迁移侵袭的抑制作用。结论 miR-107抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制可能与靶向负调控FOXK1有关,将可为胶质瘤的诊断和治疗提供靶向治疗的依据。     

miR-144在SKOV-3细胞中的表达及对Beclin-1的调控作用

目的检测雷帕霉素诱导细胞后4种miRNAs的表达情况,并进一步研究miR-144与Beclin-1基因的靶向调控作用。方法对SKOV-3细胞分别进行雷帕霉素(50μg/L,反应2 h)及3-甲基腺嘌呤(10 nmol/L、反应12 h)处理,RT-q PCR检测各组细胞miR-17、miR-20a、miR-144及miR-155的表达;Western blot检测雷帕霉素组Beclin-1蛋白的表达;双荧光素酶报告系统、Western blot及RT-q PCR,验证miR-144与Beclin-1之间的靶向调控关系。结果与正常对照组相比,雷帕霉素组SKOV-3细胞的miR-17、miR-144及miR-155的表达水平显著上调(P0.05);3-MA组SKOV-3细胞的miR-17、miR-20a及miR-144的表达水平显著下调(P0.05);雷帕霉素组Beclin-1的蛋白表达明显低于正常细胞组(P0.05)。miR-144可靶向作用Beclin-1的3'非翻译区(3'UTR),且抑制其表达;miR-144能明显抑制Beclin-1蛋白及mRNA的表达。结论 miR-144可靶向抑制Beclin-1基因的表达,并参与调控SKOV-3细胞自噬的过程。     

血红素加氧酶-1对肝癌细胞细胞周期调控因子的影响

目的 观察血红素加氧酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)对人肝癌细胞HepG2细胞周期调控因子的影响.方法 构建含有野生型和突变型HO-1基因的重组载体pcDNA3.1(+)-wtHO-1和pcDNA3.1(+)-mHO-1G143H.利用脂质体介导的方法将构建好的重组载体转染肝癌细胞系HepG2,以空载体转染作为对照组.通过G418筛选建立稳定表达野生型和突变型HO-1的HepG2肝癌细胞系.经半定量RT-PCR、Western印迹检测转染细胞系中HO-1 mRNA和蛋白的表达水平.在HO-1表达改变的稳转细胞系中,利用Western 印迹检测转染细胞系中P21、P27蛋白表达水平.结果 成功实现了野生型和突变型HO-1在HepG2细胞中的过表达;野生型和突变型HO-1过表达均能诱导抑癌基因p21和p27的表达.结论 HO-1过表达诱导抑癌基因p21和p27的表达与血红素分解产物无关.HO-1可能通过其它机制调节p21和p27的表达.     

乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对病毒自身调控序列的影响

目的 研究双剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体特异性蛋白TPds对病毒自身调控序列的影响.方法 PCR扩增6种HBV启动子/增强子序列,以Kpn Ⅰ及Xho Ⅰ位点克隆于pGL3-basic,分别构建萤火虫荧光素酶重组报告载体pGL3-BCP(含HBV基本核心启动子)、pGL3-CP1601(含增强子Ⅱ的核心启动子)、pGL3-XP(X基因最小启动子)、pGL3-XP1071(含增强子Ⅰ的X基因启动子)、pGL3-SP1(表面抗原大蛋白基因启动子)、pGL3-SP2(表面抗原中蛋白基因启动子).以FuGENE6将TPds表达载体pcDNA3.1/HisC-TPds或空白载体pcDNA3.1/HisC分别与6种HBV启动子/增强子报告载体共转染Huh7细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性,实验重复5次,数据以SPSS11.5软件分析.结果 在一定的质量比值范围内,与pcDNA3.1/HisC空白载体对照相比,pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-CP1601、pGL3-XP1071、pGL3-SP1、pGL3-SP2共转染后,Huh7细胞内萤火虫荧光素酶活性增高,而pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-BCP或pGL3-XP共转染后,胞内荧光素酶活性无变化.结论 TPds蛋白可反式激活HBV启动子SP1、SP2和增强子Ⅰ、Ⅱ,对基本核心启动子和X基因最小启动子无影响.     

过表达miR-21对人晶状体上皮细胞凋亡的调控作用

目的探讨过表达miR-21对人晶状体上皮细胞凋亡的调控作用。方法将miR-21过表达慢病毒载体及空载体慢病毒转染至人晶状体上皮细胞系——LEC B3细胞,并将实验分为Control组(未转染)、miR-21-NC组(转染空载体慢病毒)和miR-21组(转染miR-21过表达慢病毒载体)。荧光显微镜观察慢病毒载体的标签蛋白GFP的表达,RT-qPCR方法检测miR-21的表达情况,流式细胞术检测细胞凋亡,荧光素酶报告基因分析验证miR-21与FasL的靶向关系,Western-blot检测细胞中凋亡相关蛋白FADD、caspase-3、Bcl-2及Bax的表达,试剂盒检测细胞线粒体膜电势的变化情况。结果在荧光显微镜下观察,经慢病毒感染的过表达细胞系和空载体细胞系均出现绿色荧光,而空白细胞组未见绿色荧光。与Control组相比,miR-21组中miR-21的表达水平、Bcl-2表达水平和线粒体膜电位明显升高,而细胞凋亡率、FADD、caspase-3和Bax的表达水平均明显下降,差异均具有统计学意义(P0.05);miR-21-NC组与Control组相比差异无统计学意义(P0.05)。荧光素酶报告基因分析证实miR-21与FasL存在靶向关系。结论 miR-21可以抑制晶状体上皮细胞发生凋亡,既可通过靶向性调控外源性FasL/Fas通路参与caspase-3和FADD介导的细胞凋亡,也可通过线粒体途径对细胞凋亡发挥作用。     

miR-93-5p靶向MICA基因促进宫颈癌细胞活力并上调NK细胞Th1细胞因子表达

为研究miR-93-5p、主要组织相容性复合体Ⅰ类相关基因A(MHC classⅠchain-related gene A, MICA)对宫颈癌细胞增殖及NK细胞Th1细胞因子分泌的影响及机制,采用qRT-PCR法检测人正常宫颈细胞Ect1/E67、人宫颈癌细胞HeLa中miR-93-5p的表达;在miR-93-5p mimics组(转染miR-93-5p mimics)、miR-NC组(转染miR-NC)、pcDNA 3.1-MICA组(转染pcDNA 3.1-MICA)和pcDNA 3.1组(转染pcDNA 3.1)中用脂质体转染HeLa细胞,并与NK细胞共培养;MTT法检测各组细胞增殖率;ELISA检测各组细胞中Th1细胞因子IFN-γ、TNF-α含量;Western blotting检测各组细胞中MICA蛋白的表达量。结果显示,与Ect1/E67细胞相比,HeLa细胞中miR-93-5p的表达水平显著升高(P0.05),且miR-93-5p靶向MICA;抑制miR-93-5p、过表达MICA均可显著下调HeLa细胞的增殖率,上调IFN-γ、TNF-α表达。由此,miR-93-5p可促进宫颈癌细胞增殖,抑制NK细胞杀伤能力,或可为宫颈癌的靶向治疗提供新靶点。