Rig-I蛋白C端Helicase结构域的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

目的:为Rig-I蛋白结构与模式识别功能的深入研究提供灵敏、高效的免疫学检测试剂。方法:PCR法克隆小鼠Rig-I基因Helicase区编码序列(726～2240bp,编码241～746位氨基酸),构建带组氨酸标签的原核表达载体pET15b-mRig-I-H,阳性克隆经酶切、测序鉴定后转化E.coliBL21进行诱导表达。目的蛋白电泳分离并割胶纯化后免疫家兔制备抗血清。抗血清用ELISA、Western blot、细胞免疫荧光方法进行鉴定。结果:目的蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,制备的抗Rig-I抗体效价达到1∶100000,Western blot、细胞免疫荧光结果显示该抗体能够有效地对细胞内Rig-I蛋白的表达水平进行检测。结论:成功地对mRig-I-H进行了原核表达、纯化,抗mRig-I-H的多克隆抗体具有较高的特异性,为进一步研究Rig-I尤其是Helicase区的结构与功能奠定了坚实的基础。     

Syncytin蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

目的克隆人syncytin基因并在大肠杆菌中表达,并用表达后的融合蛋白制备syncytin蛋白多克隆抗体。方法 PCR扩增人syncytin基因编码区的DNA片段,将其克隆入原核表达质粒pET30a(+),转化大肠杆菌BL21,诱导产生syncytin-His融合蛋白。采用割胶回收的方法纯化目的蛋白,免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。通过ELISA、Western-Blot和免疫组织化学等方法来检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功表达并纯化了syncytin-His融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白主要以包涵体形式存在;ELISA法测定抗体效价为1:10 000;Western-Blot和免疫组织化学结果显示所制备的抗体能特异性识别syncytin蛋白。结论成功制备和鉴定了人syncytin多克隆抗体,多克隆抗体特异性强和效价高,为下一步研究Syncytin的生物学功能奠定了基础。     

人NYD-SP28基因原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建人NYD-SP28基因原核表达载体,表达其原核蛋白,制备其多克隆抗体,以探讨其在精子发生中的作用。方法:以原始质粒为模板,用PCR法扩增人的NYD-SP28基因开放阅读框全长,将其克隆到原核表达质粒pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a-NYD-SP28。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导原核蛋白的表达,纯化蛋白以免疫小鼠,制备多克隆抗体,用ELISA法测定抗体的滴度。结果:成功构建了用于原核蛋白表达的重组质粒,并在BL21菌中表达NYD-SP28原核蛋白,用亲和层析Ni柱进行纯化得到NYD-SP28原核蛋白。用纯化的NYD-SP28蛋白免疫小鼠2个月后,得到相应的多克隆血清抗体,经ELISA检测,滴度达到1/10万。结论:成功构建人NYD-SP28原核表达载体,并获得了高纯度的NYD-SP28蛋白及鼠抗NYD-SP28多克隆抗体,为进一步研究NYD-SP28的功能奠定了基础。     

QKI蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:获得原核表达的RNA结合蛋白QKI-7蛋白,并制备其兔抗QKI多克隆抗体。方法:将成功插入QKI-7编码区cDNA的PET32b( )原核表达载体用热休克法转化BL21(DE3)感受态细菌,以IPTG诱导6×His-QKI-7融合蛋白的表达,分别经金属鳌合柱、反向柱和强阴离子交换柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,应用纯化的融合蛋白,分别以弗氏佐剂、聚丙烯酰胺凝胶、NC膜作为佐剂免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并以Western blot进行检测。结果:经表达并纯化的QKI-7蛋白纯度达到95%以上,应用纯化的融合蛋白以弗氏佐剂作为佐剂免疫新西兰大白兔后获得高滴度,特异性的抗QKI的多克隆抗体。结论:成功地表达并纯化了QKI-7蛋白,并制备了高滴度、高特异性的抗QKI多克隆抗体。采用弗氏佐剂作为免疫佐剂进行免疫的效果优于聚丙烯酰胺凝胶和NC膜。     

小鼠脂多糖应答蛋白LRP的大肠杆菌表达及其兔抗血清抗体的制备

目的：原核表达小鼠脂多糖应答蛋白并制备兔抗mLRP抗血清.方法：参考GenBank中已登录的人lrp-cDNA序列,对小鼠的同源表达序列标签（EST）序列进行拼接,预测mlrp cDNA序列.用设计的引物,进行RT-PCR,从脂多糖刺激的NIH3T3细胞中扩增mlrp的cDNA序列,克隆入pTAT载体中,构建mlrp的原核表达载体.以其转化在大肠杆菌中诱导表达后,将获得的His-TAT-mLRP融合蛋白免疫家兔,用丙酮沉淀全菌蛋白吸附法制备纯化的抗mLRP血清,用Western blot鉴定抗体的特异性.结果：预测的mlrp cDNA的长度为1 905 bp.将克隆获得的1 554 bp大小的mlrp-cDNA编码区序列插入pTAT质粒中,在大肠杆菌中表达出His-TAT-mLRP融合蛋白.以其免疫家兔,制备了特异性兔抗mLRP的血清.结论：mlrp的原核表达及特异性兔抗mLRP血清的制备,为进一步研究mLRP的功能奠定了基础.     

猪新基因BCL-G_L的克隆与原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:克隆猪的BCL-GL基因,进行原核表达,并制备出其多克隆抗体。方法:以提交NCBI的人的BCL-GL基因序列为种子序列,对猪的ESTs数据库进行比对拼接,得到contig序列。根据这个序列设计克隆引物,以猪脾脏总RNA反转录得到的cDNA为模板,PCR得到克隆序列。克隆序列经测序验证后,连接到原核表达载体pET-32a,构建成重组表达载体pET32a-BCL-GL,然后将重组载体转化到大肠杆菌BL21进行诱导表达。经His-标签融合蛋白纯化试剂盒纯化得到纯化蛋白制备豚鼠多克隆抗体。结果:抗体ELISA效价为1∶800,Western blot反应特异性良好。结论:成功地克隆了猪BCL-GL基因,并进行了原核表达,制备了特异性豚鼠抗BCL-G血清,为进一步研究其功能奠定基础。     

PEG10基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

肝癌是我国主要恶性肿瘤之一,其死亡率在所有肿瘤中居第二位.近年来随着诊疗手段的不断提高,肝癌的预后有所改善,但生存率仍很低.     

HIV-1蛋白酶基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的为了研究HIV-1蛋白酶的生物学活性,制备HIV-1 PR蛋白及其特异性抗体。方法用PCR方法扩增编码PR的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,并表达HIV-1 PR蛋白,用His抗体为一抗做Western blot鉴定目的蛋白。以纯化的目的蛋白为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),免疫细胞化学法检测抗体滴度及其特异性。结果原核表达载体pET28 a(+)-PR成功构建,并可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到的PR蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定正确。用纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论得到纯化的HIV-1PR蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白PR,为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。     

F10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：表达F10蛋白，并制备兔抗F10多克隆抗体。方法：利用PCR方法扩增F10基因片段，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后连接人pET-GST原核表达载体，构建的pET-GST／F10融合重组表达质粒转化大肠杆菌B121，经IPTG诱导表达蛋白，并以亲和层析的方法进行纯化。表达产物用SDS—PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。以纯化的F10蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔抗F10的多克隆抗体，并以ELISA法检测抗体效价。结果：经酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的F10读码框。SDS—PAGE电泳分析显示pET—GST／F10诱导后表达一相对分子质量（Mr）约为61000的融合蛋白，与预期结果相符。目的蛋白纯化后的纯度达90％以上，Western blot证实该蛋白是GST／F10的融合蛋白。将纯化的GST／F10融合蛋白免疫家兔，得到的兔抗F10抗体效价达1：20000。结论：成功构建了人F10基因原核表达载体，并获得了高纯度的F10重组蛋白及兔抗F10抗体，为下一步研究F10基因功能奠定了实验基础。     

Autotaxin多克隆抗体的制备

目的:表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的Autotaxin(58-157位氨基酸)融合蛋白,制备抗Autotaxin的多克隆抗体。方法:构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)重组表达质粒,转入BL21大肠杆菌,IPTG诱导蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化的蛋白免疫家兔,制备抗Autotax-in的多克隆抗体。ELISA检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性,并用于免疫组化实验。结果:在大肠杆菌中高表达Autotaxin(58-157)-His6融合蛋白,经亲和纯化后免疫家兔,获得了特异性的抗Autotaxin抗血清。结论:成功构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)表达质粒,原核表达获得高纯度的目的蛋白,制备出高效价的特异性抗Autotaxin多克隆抗体。     

人DcR3融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:制备DcR3融合蛋白及其多克隆抗体,并鉴定其特异性。方法:将亚克隆构建的pET28a( )/DcR3重组表达质粒转化入大肠杆菌(E.coli)BL21菌株,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析蛋白产物,将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定。结果:pET28a( )/DcR3重组表达质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为33000的目的蛋白,表达量约占菌体蛋白总量的38%,纯化后的目的蛋白纯度达98%。Western blot显示纯化蛋白与抗DcR3单克隆抗体(mAb)具有良好的反应性。纯化后多克隆抗体效价达1.28×10-6。结论:DcR3蛋白在E.coli中得到高效表达,成功制备高纯度DcR3蛋白及高效价抗DcR3多克隆抗体,为研究DcR3在组织中的表达、分布,研制ELISA试剂盒以检测恶性肿瘤及自身免疫性疾病等患者血清DcR3表达水平提供实验基础。     

MASP-2的EGF和SP功能区蛋白表达及其多克隆抗体制备

目的:克隆并原核表达甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MASP-2)的EGF、SP功能区蛋白,制备其多克隆抗体,初步分析两个功能区蛋白的免疫原性.方法:从人胎肝组织提取总RNA,反转录得到cDNA作为模板分别扩增MASP-2的EGF、SP片段基因,再分别连接至pGEX-6P-2表达载体诱导表达GST融合蛋白;分离纯化融合蛋白后免疫适龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体,Western blot法检测抗体特异性,间接ELISA检测抗体效价.结果:成功构建pGEX-6P-2-EGF和pGEX-6P-2-SP,并表达GST-EGF、GST-SP两种融合蛋白;制备出两种目的片段的多克隆抗体,特异性高,与其他蛋白无交叉反应,间接ELISA测定EGF抗体效价大于1∶32000,SP抗体效价大于1∶40000.结论:获得了MASP-2的EGF、SP两个功能区蛋白的多克隆抗体,特异性强,效价高.     

人BTLA分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:表达并纯化重组人BTLA(hBTLA)分子胞外区,制备和鉴定兔抗hBTLA多克隆抗体,为进一步实验研究奠定基础。方法:采用特异性引物扩增hBTLA胞外功能区DNA,经酶切、连接构建原核表达载体pET28a-hBTLA。将构建的重组表达质粒转化入E.coliBL21(DE3)菌株,采用IPTG诱导表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对抗体进行纯化、效价测定及特异性鉴定。结果:序列测定证实构建的pET28a-hBTLA重组表达载体含有hBTLA编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为15720的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯化后的目的蛋白达到电泳纯。双向琼脂扩散法检测抗体效价为1∶16,ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Western blot分析显示抗体能特异性结合重组hBTLA蛋白。结论:成功构建了hBTLA蛋白的原核表达载体,获得高纯度的融合蛋白,制备高效价、高特异性的多克隆抗体。     

G蛋白偶联受体56胞外端融合蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的:制备G蛋白偶联受体56(G protien-coupled recepter 56,GPR56)的高效抗体,为其功能及分子机制的深入研究提供灵敏、高效的免疫学检测工具。方法:以肝癌细胞株MHCC-97H的cDNA为模板,利用PCR技术扩增GPR56 N端序列(661~1 073 bp),并构建重组表达载体pGEX4T-1-GPR56N。阳性克隆经酶切、测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。表达产物经Western blot初步鉴定后,用GST磁珠分离纯化,纯化后蛋白与免疫佐剂混合直接免疫家兔制备抗血清。阳性血清用ELISA、Western blot、免疫组织化学等技术对细胞或组织中的GPR56进行鉴定和分析。结果:成功构建重组表达载体pGEX4T-1-GPR56N,GPR56N与GST的融合蛋白(GST-GPR56)在原核系统中进行了高效的可溶性表达,制备的兔抗人GPR56抗体经Western blot和免疫组织化学分析结果表明,该抗体可同时对人源性和鼠源性的GPR56进行特异性检测。结论:成功对GPR56蛋白N端序列进行了原核表达和纯化,制备的抗GPR56多克隆抗体具有较高的特异性,为GPR56功能及分子机制的深入研究奠定了坚实的基础。     

人TLR2胞外区基因的原核表达及其抗体的制备

目的: 在原核系统中表达人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的融合蛋白并制备多克隆抗体.方法: 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2胞外区基因, 将其克隆到表达载体pET-32a( )上构建重组原核表达质粒, 并在大肠杆菌中诱导表达, 目的融合蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化, 用SDS-PAGE和 Western blot进行鉴定.用纯化的蛋白免疫新西兰白兔, 制备多克隆抗体, 采用Western blot对抗体进行鉴定, 并用ELISA分析抗体活性.结果: 成功构建了pET-32a( )-TLR2重组表达质粒并在大肠杆菌中进行表达, 获得了纯化重组蛋白, 重组蛋白免疫白兔后能够有效地刺激抗体产生, 并具有良好的免疫活性.结论: 成功地获得人TLR2胞外区基因的融合蛋白, 制备的多克隆抗体为进一步研究TLR2胞外区的功能和生物活性奠定基础.     

人Fkbp19的多克隆抗体的制备

目的:制备针对人Fkbp19的多克隆抗体,为进一步研究Fkbp19基因的功能奠定基础。方法:利用鉴定正确的重组原核表达载体pET21a-Fkbp19,在大肠杆菌BL21-DE3中诱导表达,应用Ni-NTA亲和层析法获得纯度较高的原核表达蛋白,并免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot及免疫荧光的方法检测抗体对乳腺癌细胞中内源性Fkbp19蛋白的识别能力。结果:成功地在大肠杆菌中实现了His-Fkbp19融合蛋白的表达,经纯化后免疫家兔得到了高滴度的多克隆抗体,该抗体可以用Western blot的方法检测内源性Fkbp19蛋白。结论:所制备的多克隆抗体可以用于Fkbp19的Western blot检测。     

结核分枝杆菌调节蛋白RelA的原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆编码结核分枝杆菌调节基因RelA并在大肠杆菌中表达,纯化后制备兔抗RelA的抗体。方法:利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增RelA基因,构建重组表达质粒pET-32a(+)-RelA;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行镍离子亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Westem blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性;以表达的RelA蛋白免疫家兔,制备抗RelA的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果:扩增了RelA基因,克隆于表达载体pET-32a(+)中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确。经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)为120 000的目的蛋白;纯化的RelA免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶6 400以上,且具有良好的特异性。结论:已成功构建RelA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗RelA抗体,效价及特异性均良好,为进一步研究RelA蛋白在结核病中的致病机制奠定了基础。     

果蝇硒蛋白D-SelK原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆编码果蝇硒蛋白D-SelK结构基因并在大肠杆菌中表达,纯化后制备兔抗D-SelK的抗体。方法:利用PCR从pGM-T-D-SelK质粒中扩增D-SelK基因,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-D-SelK,以重组质粒转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,通过变性、电泳纯化D-SelK蛋白,SDS-PAGE和Westem blot方法鉴定目的蛋白的表达;以表达的D-SelK蛋白免疫家兔,制备抗D-SelK的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果:扩增了D-SelK基因,克隆于表达载体pGEX-6p-1中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确。经诱导在大肠杆菌中表达出目的蛋白,纯化后免疫家兔,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶51 200以上,且具有良好的特异性。结论:已成功构建D-SelK基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗D-SelK抗体,效价及特异性均良好,这为进一步研究功能特异性的D-SelK提供了有效的手段。     

人精子肌动蛋白样蛋白7a蛋白在大肠杆菌系统的表达纯化及多克隆抗体制备

目的 在大肠杆菌系统表达并纯化人精子肌动蛋白样蛋白7a(ACTL7a)的N段(1-70),制备兔抗ACTL7a多克隆抗体.方法 构建重组表达质粒pGEX-6p-1-ACTL7a(1-70),以重组质粒转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性重组菌,IPTG诱导目的蛋白表达,通过镍离子金属螯合树脂和谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B树脂两次亲和纯化和分子筛分离目的蛋白;以表达的ACTL7a(1-70)蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗ACTL7a的多克隆抗体.ELISA检测抗体效价,Western blot法鉴定抗体特异性,免疫荧光组织化学技术检测ACTL7a在曲精小管细胞的表达.结果 经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达出目的蛋白ACTL7a(1-70),纯化后免疫新西兰大白兔,成功获得抗血清.血清效价达到1∶160000以上,且具有良好的特异性.结论 成功构建了ACTL7a基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达,经纯化获得高纯度的目的蛋白;制备出兔抗ACTL7a抗体,效价及特异性均良好.     

11型HPV E7蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的构建人11型乳头瘤病毒(HPV 11)E7蛋白的原核表达载体,表达纯化后制备抗HPV11E7蛋白的多克隆抗体。方法构建pGEX-4T2-HPV11E7原核表达载体,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠杆菌表达可溶性融合蛋白GST-HPV11E7,纯化获取11型HPVE7蛋白。将HPV11E7蛋白免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的多克隆抗体,用蛋白G琼脂糖纯化获得IgG型多克隆抗体。Western blot法及免疫荧光染色检测该抗体的效价及特异性。结果 SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导6 h后可表达出高水平可溶性GST-HPV11E7融合蛋白。纯化后免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的血清,纯化获得了IgG型多克隆抗体。Western blot及免疫荧光染色结果显示,兔抗HPV11E7 IgG具有效价高和特异性强的特点。结论成功表达了HPV11E7蛋白并制备了效价较高、特异性较好的IgG型兔抗HPV11E7蛋白多克隆抗体。