过表达Sprouty2分子促进HEK293T细胞增殖与存活北大核心CSCD

目的构建表达人Sprouty 2(SPRY2)基因的重组表达载体pDC315/hSPRY2,转染人胚肾(HEK)293T细胞表达目的蛋白,初步探讨其对HEK293T细胞增殖与存活的影响。方法构建hSPRY2重组腺病毒表达载体,体外转染HEK293T细胞,以Western blot法检测目的蛋白的表达,以CCK-8法检测SPRY2对HEK293T细胞增殖或去血清条件下细胞存活的影响。结果成功构建重组表达载体pDC315/hSPRY2,在转染的HEK293T细胞中检测到目的蛋白hSPRY2的表达,转染pDC315/hSPRY2组HEK293T细胞的增殖率及存活率均明显高于对照组即转染pDC315/EGFP组(P<0.05)。结论成功构建了hSPRY2重组表达载体,过表达hSPRY2可促进HEK293T细胞的增殖与存活。     

人CD7 cDNA在HEK293细胞中的表达

目的 建立表达人白细胞分化抗原CD7蛋白的哺乳动物细胞模型,为深入研究CD7的功能奠定基础。方法 采用PCR方法扩增CD7 cDNA,将目的片段定向克隆于真核表达载体pcDNA3,限制性内切酶酶切分析重组质粒并进行序列测定;通过电穿孔法将重组真核表达载体pcDNA3/CD7转染于人胚肾293细胞（HEK293）,经G418筛选得到抗性克隆;利用FCM检测CD7分子在HEK293细胞的表达。结果 得到了含CD7全长cDNA的重组真核表达载体pcDNA3/CD7。FCM分析表明：转染了pcDNA3/CD7的HEK293细胞表达人CD7蛋白。结论 为深入研究CD7的作用机制提供了条件。     

过表达泛素偶联酶E2C对293T细胞增殖的影响

目的:构建稳定过表达人类泛素偶联酶E2C(UBE2C)的293T人胚肾细胞株,初步探讨其对293T细胞增殖的影响。方法:采用脂质体法将已成功构建的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒转入293T人胚肾细胞株中,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株;用Western blot技术检测并鉴定UBE2C基因在293T细胞中的表达情况;用MTT法检测UBE2C对293T细胞增殖的影响。结果:Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的UBE2C蛋白表达水平明显高于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。MTT法检测结果显示转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的增殖速度明显快于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。结论:成功建立稳定过表达UBE2C的293T细胞株,过表达UBE2C可促进293T细胞的增殖。     

过表达整合素连接激酶促进心脏c-Kit~+细胞的存活和增殖

目的:探讨整合素连接激酶(ILK)过表达对心脏c-Kit~+细胞存活和增殖的影响,以及移植ILK过表达的心脏c-Kit~+细胞改善心肌梗死(MI)大鼠心功能的作用。方法:从新生SD大鼠分离培养心脏c-Kit~+细胞,构建含人ILK全长的腺病毒载体并感染心脏c-Kit~+细胞。感染48 h后,应用细胞计数和CCK-8法测定细胞活力和增殖,并通过Western blot法检测c-Kit~+细胞中增殖相关蛋白cyclin D1和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。40只8周龄SPF级大鼠经冠状动脉结扎建立MI模型,结扎15 min后于梗死区及梗死边缘区分3点通过心肌注射移植心脏c-Kit~+细胞。采用随机数字表法将大鼠分为假手术组(sham组)、心梗+生理盐水注射组(MI组)、心梗+感染空载体的c-Kit~+细胞注射组(Ad-null-c-Kit~+cell组)和心梗+感染携带ILK腺病毒载体的c-Kit~+细胞注射组(ILKc-Kit~+cell组),每组10只。术后2周,免疫组化法检测梗死区和梗死边缘区c-Kit的表达;术后4周,通过血流动力学检测心脏功能。结果:过表达ILK促进了心脏c-Kit~+细胞的存活和增殖(P0.05)。过表达ILK的心脏cKit+细胞中cyclin D1和PCNA的表达明显增加(P0.05)。细胞移植2周后,ILK-c-Kit~+cell组心肌组织中c-Kit表达明显增加(P0.05);细胞移植4周后,ILK-c-Kit~+cell组大鼠心功能改善比Ad-null-c-Kit~+cell组更明显(P0.05)。结论:过表达ILK通过提高cyclin D1和PCNA的表达,促进了心脏c-Kit~+细胞的存活和增殖。ILK-c-Kit~+细胞移植能更好地改善MI大鼠的心功能。     

人趋化因子受体CCR6在HEK293细胞内的稳定表达及其功能分析

目的:构建稳定表达人趋化因子受体6(CCR6)的HEK293细胞株。方法:将CCR6基因和Gα16质粒共转到HEK293细胞中,并挑取稳定表达CCR6基因的HEK293细胞克隆。采用体外趋化实验、钙流实验、RT-PCR、Western blot及免疫荧光染色法,检测CCR6在HEK293细胞表面的表达。结果:经上述实验证实,CCR6基因和Gα16质粒共转染的HEK293细胞上,可稳定表达CCR6,且具有生物学活性。结论:成功地在HEK293细胞表面稳定表达具有生物学活性的CCR6,为研究CCR6的生物学功能及筛选CCR6的拮抗剂奠定了基础。     

人CD23基因的扩增及其在HEK 293T细胞的高效表达

目的建立一个有效表达CD23的系统。方法采用RT-PCR方法,从外周血淋巴细胞中扩增人的CD23cDNA基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3·1B上,构建成pcDNA3·1/CD23质粒表达载体;将pcDNA3·1/CD23质粒转染HEK293T细胞,通过流式细胞仪和Westernblot检测CD23在细胞中的表达情况。结果扩增的CD23cDNA序列与文献报道的一致;通过构建表达载体和转染细胞实现了CD23cDNA在293T细胞膜上的表达。转染效率达80%以上,并获得了较高水平的表达。结论扩增CD23cDNA基因,经过转染HEK293T细胞,实现了CD23在HEK293T细胞的高效表达。     

FBXO6基因真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的 构建F盒蛋白6(FBXO6)基因真核表达载体.方法 采用PCR方法合成含有EcoR Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切位点的FBXO6 cDNA全长.分别构建载体pEGFP-C1-FBXO6和pEGFP-C1-anti-FBXO6,采用菌落PCR、双酶切鉴定以及测序证实cDNA片段大小和序列正确.将载体pEGFP-C1-FBXO6和pEGFP-C1-anti-FBXO6分别转染HEK293T细胞,Western blot法检测FBXO6蛋白的表达.结果 pEGFP-C1-FBXO6和pEGFP-C1-anti-FBXO6包含大小、序列正确的FBXO6片段;FBXO6蛋白在转染pEGFP-C1-FBXO6的293T细胞中高表达;在转染pEGFP-C1-anti-FBXO6的HEK293T细胞中表达降低.结论 成功构建FBXO6基因正义真核表达载体pEGFP-C1-FBXO6和反义真核表达载体pEGFP-C1-anti-FBXO6.     

人FAT10蛋白过表达诱导饥饿状态下HEK 293细胞发生凋亡

目的:采用flag标记的人FAT10蛋白研究人FAT10蛋白对HEK293细胞的影响。方法:将FAT10基因片段克隆到载体pcDNA3-flag上,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,用脂质体转染HEK293细胞,用Western blotting方法检测外源性FAT10正常培养状态和饥饿状态下的HEK293细胞中的表达情况;并用XTT法和DNA ladder法观察正常培养和饥饿状态下HEK293细胞的凋亡情况。结果:重组质粒在HEK293细胞中高效表达,但在正常培养状态下和饥饿状态下表达情况不同。饥饿状态下,过表达FAT10的HEK293细胞存活率显著低于对照细胞,并且出现DNA ladder现象。结论:成功构建了带Flag标签的FAT10真核表达质粒,可在HEK293细胞中高效表达;FAT10过表达促进饥饿状态的HEK293细胞发生凋亡。     

小鼠FasL基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建含有小鼠Fas Ligand(FasL)基因的重组真核表达载体,并检测FasL蛋白在其稳定转染的HEK293细胞中的表达情况,为构建表达小鼠Fas L的树突状细胞(DC)模型,深入研究DC联合T细胞防治移植物抗宿主病(GVHD)的新方法奠定基础。方法从小鼠脾脏中提取RNA并逆转录为cDNA,以该cDNA为模板扩增FasL基因,插入pcDNA3.1(+)载体中构建pcDNA3.1(+)-FasL重组质粒,利用脂质体将其转染HEK293细胞,用G418筛选稳定表达细胞系,Western blot确定重组蛋白的表达。结果通过酶切及测序证实FasL序列正确插入表达载体pcDNA3.1(+),Western blot检测证实转染重组质粒的细胞能正确表达FasL蛋白,G418筛选后能够得到稳定表达FasL的抗性细胞株即FasL-HEK293。结论重组质粒pcDNA3.1(+)-FasL和稳定表达FasL的HEK 293细胞成功构建,为后续FasL-DC细胞的研究打下了坚实基础。     

HEK293T细胞表达的单核细胞趋化蛋白1促进巨噬细胞迁移

目的构建巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)真核表达载体,转染人胚肾HEK293T细胞,验证其对巨噬细胞的趋化作用。方法小鼠基因组DNA作模板,用PCR法获得MCP-1启动子区基因片段,插入p FLAGCMV1载体。用双酶切法和测序鉴定正确后,将构建好的病毒载体转染HEK293T细胞,用Western blot法检测MCP-1的表达,用Transwell~(TM)实验检测转染后细胞分泌的MCP-1对巨噬细胞的趋化作用。结果重组载体酶切鉴定在相应位置有目的片段,转染单核细胞趋化因子重组载体后的HEK293T细胞有MCP-1表达,转染后HEK293T细胞分泌的MCP-1明显增加巨噬细胞的迁移。结论HEK293T细胞表达的MCP-1明显增强巨噬细胞的迁移。     

Sirt2基因的克隆及其在HEK293中的表达

目的:克隆大鼠Sirt2 基因, 构建其真核表达载体并在HEK293细胞中表达.方法:利用RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增出包含Sirt2编码区的cDNA片段, 产物纯化后T-A克隆连接至pMD20-T载体.以此为模板, 将该基因编码区克隆入真核表达载体pcDNA3.1myc-his(-)中, 转染HEK293细胞检测其表达.结果:测序证实所克隆的Sirt2编码区cDNA正确地插入pcDNA3.1myc-his(-)中, 经免疫荧光检测证实其在HEK293细胞中得到表达.结论:成功克隆了大鼠Sirt2 cDNA, 构建了其真核表达载体, 并在HEK293细胞中得到有效表达, 为进一步研究大鼠Sirt2的功能奠定了基础.     

Salusin-a基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:研究增强型绿色荧光蛋白真核表达载体Salusin-a(pEG-FP-Salusin-a)的构建及在人胚胎肾细胞系293细胞(HEK293)中的表达。方法:提取人单核细胞系THP-1细胞Salusin-a的mRNA,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增Salusin-a基因,克隆入pEGFP-N3载体,双酶切、菌落PCR及测序鉴定pEGFP-Salusin-a质粒。用脂质体转染pEGFP-Salusin-a入HEK293细胞,分为转染细胞组、质粒对照组和空白对照组,检测分析各组荧光蛋白和Salusin-a基因的表达。结果:成功构建pEGFP-Salusin-a质粒,并转染HEK293,细胞转染效率86%,转染细胞组和质粒对照组绿色荧光蛋白的表达明显高于空白对照组(P0.05);转染细胞组Salusin-amRNA的表达明显高于质粒对照组和空白对照组(P0.05)。结论:重组pEGFP-Salusin-a质粒能转染HEK293细胞并表达Salusin-a,为Salusin-a基因功能的进一步研究提供了实验基础。     

过表达MIPU1降低阿霉素所致人胚胎肾HEK293细胞的凋亡

目的 探讨过表达MIPU1对阿霉素(Doxorubicin,DOX)所致细胞凋亡的影响及其可能的分子机制,为预防DOX抗肿瘤治疗过程中的毒副作用提供新的思路.方法 1)MTT实验观察DOX处理下过表达MIPU1对细胞存活率的影响;2)Hoechst染色和流式细胞术分析过表达MIPU1对DOX所致细胞凋亡的影响;3)RT-PCR和Westernblot分析过表达MIPU1对DOX所致Bcl-2、P53和Bax在mRNA水平和蛋白水平上表达变化的影响.结果 过表达MIPU1后,细胞存活率明显升高(P＜0.05vs pEGFP+ DOX),凋亡率显著下降(P＜0.01 vs pEGFP+ DOX),P53和Bax的表达显著下降(P＜0.05 vs pEGFP+ DOX),而Bcl-2的表达则明显增多(P＜0.05 vs pEGFP+ DOX).结论 过表达MIPU1能降低DOX引起的HEK293细胞凋亡,可能与抑制P53和Bax的表达同时促进Bcl-2的表达有关.     

pRluc-hKOR-pcDNA3.1 真核重组质粒的构建及在HEK293细胞中的表达

目的： 构建与海肾荧光素酶(renilla luciferase,Rluc)融合的人κ型阿片受体（kappa opioid receptor, KOR）的真核表达载体,用于生物发光共振能量转移法检测人KOR与其它受体间的相互作用。方法: 以质粒pcDNA3.1-hKOR为模板,PCR方法扩增人KOR。扩增的人KOR用NotⅠ和XhoⅠ双酶切,同时用这2种酶双酶切质粒pRluc-pcDNA3.1。然后将这2种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10。挑取菌落培养,提取质粒,然后进行酶切鉴定,最后进行测序。将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾（human embryonic kidney 293,HEK293) 细胞,免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察。结果: 扩增出了1条约1.2 kb的片段,与预期的人KOR大小相符,质粒酶切结果显示重组质粒 pRluc-hKOR-pcDNA3.1被切成2条片段,其中1条为pRluc-pcDNA3.1载体大小,另1条为目的片段大小。经测序鉴定,序列与GenBank (NM_000912)中的序列高度同源。共聚焦显微镜观察显示,阿片受体主要表达在细胞膜上。结论: 构建成功了pRluc-hKOR-pcDNA3.1重组真核表达载体,此表达载体可用于检测人KOR与其它受体之间的相互作用。     

过表达prohibitin促进NB4-R1急性早幼粒细胞白血病维甲酸耐药细胞凋亡

目的构建人prohibitin基因真核过表达载体,探讨上调prohibitin对NB4-R1急性早幼粒细胞白血病维甲酸耐药细胞凋亡的影响。方法 PCR钓取目的基因prohibitin,与pEGFP-N1-3FLAG真核载体定向连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将阳性重组载体pEGFP-N1-3FLAG-prohibitin转染NB4-R1细胞,以实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法检测过表达效果,annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测prohibitin过表达对NB4-R1细胞凋亡的影响。结果 PCR筛选及测序比对,证明成功构建了prohibitin基因过表达载体;对NB4-R1细胞转染率可达70%以上;qRT-PCR结果显示转染pEGFP-N1-3FLAG-prohibitin过表达载体组(OE)prohibitin mRNA表达水平较空白对照组(CON)和阴性对照组(NC)分别上调(1.64±0.37)倍和(1.58±0.43)倍(P0.05),Western blot结果显示OE组prohibitin蛋白表达水平较CON组和NC组分别上调(1.91±0.33)倍和(1.99±0.37)倍(P0.05);流式细胞术结果表明CON组、NC组和OE组NB4-R1细胞凋亡率分别为(5.88±0.43)%、(6.63±0.46)%和(28.22±1.33)%,OE组较CON组和NC组细胞凋亡率分别增加了(3.80±0.24)倍和(3.39±0.30)倍(P0.05)。结论过表达prohibitin可诱导NB4-R1细胞凋亡。     

NLRP3过表达对非小细胞肺癌不同细胞系生物学行为的影响

目的 探讨慢病毒介导的NLRP3过表达对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞和NCI-H460细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响,并比较两种细胞系生物学行为的差异,探索NLRP3成为药物开发新靶点或潜在调节因子的可能性.方法 设计并构建NLRP3过表达慢病毒载体,用过表达慢病毒载体和阴性对照慢病毒载体分别感染人NSC...     

过表达P2x7受体引发小胶质细胞的炎症反应

目的研究嘌呤受体P2x7在小胶质细胞炎症反应中的作用。方法通过分子克隆的方法构建pCDNA3.1-P2x7重组质粒,构建成功后经测序确认质粒序列无误,通过Lipo2000转染小胶质细胞株BV-2细胞,采用PCR方法测定BV-2细胞内P2x7的表达,Westernblot法测定P2x7和Cox-2的蛋白表达。结果细胞经重组质粒转染成功后,pCDNA3.1-P2x7组P2x7和Cox-2蛋白表达水平分别为（4.21±0.13）%和（2.60±0.05）%,高于pCDNA3.1组的（2.61±0.05）%和（1.62±0.04）%,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论通过过表达P2x7受体,能引起小胶质细胞的激活,提示可进一步引发炎症反应。     

利用Aag2细胞过表达体系筛选埃及伊蚊对DENV2易感相关免疫基因

埃及伊蚊Aedes aegypti是登革病毒的主要传播媒介,埃及伊蚊感染登革Ⅱ型病毒(dengue virus typeⅡ,DENV2)后产生先天免疫反应的相关研究,有助于进一步理解埃及伊蚊感染DENV2的过程和机制.本研究通过埃及伊蚊和Aag2细胞感染DENV2进行转录组分析,与未染毒的蚊虫和细胞进行对比,筛选出12...     

过表达miR-10b促进肺癌细胞系A549增殖

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者肺癌及癌旁组织中miR-10b(miR-10b)表达水平及miR-10b是否通过调控锌指转录蛋白基因(KLF4)对肺癌细胞系A549恶性化的影响。方法 40例NSCLC患者病理切片,原位杂交检测肺癌及癌旁组织中miR-10b的表达量;对肺癌细胞系A549转染miR-10b mimics后,CCK-8法检测肺癌细胞增殖;real-time PCR及Western blot检测KLF4 mRNA及蛋白水平;软琼脂克隆形成实验检测过表达miR-10b对A549细胞的肿瘤恶性化程度的影响。结果肺癌细胞A549及肺癌组织中miR-10b的表达量分别高于正常肺上皮细胞16HBE及癌旁组织;过表达miR-10b模拟物的A549细胞中,KLF4蛋白水平显著下降(P0.05);过表达的miR-10b可显著增加A549细胞的增殖速度及在软琼脂内的成瘤性。结论 miR-10b在不同类型细胞及组织中具有分布差异性、可能是通过抑制KLF4的表达促进肺癌细胞增殖及恶性化。     

CRNDE过表达促进人肝癌细胞系HepG2增殖和迁移

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)结直肠差异性表达基因(CRNDE)对HepG2细胞增殖和迁移能力的影响及作用机制。方法构建CRNDE过表达质粒,进行慢病毒包装后感染HepG2细胞。实验分别设置阴性对照组(LV5/NC)和CRNDE过表达组(LV5/CRNDE)。应用2.5μg/mL嘌呤霉素干预4~5周,筛选出CRNDE过表达HepG2细胞系;CCK8和细胞划痕实验检测细胞的增殖及迁移能力变化;real-time PCR和Western blot检测两组细胞E-cadherin、N-cadherin、Bax和Bcl-2 mRNA及蛋白表达变化。结果与LV5/NC组相比,LV5/CRNDE组CRNDE表达显著升高(P<0.01),且LV5/CRNDE组细胞的增殖和迁移能力均显著提高(P<0.01);同时,LV5/CRNDE组细胞E-cadherin和Bax表达均明显降低(P<0.01),而N-cadherin和Bcl-2表达则明显升高(P<0.01)。结论CRNDE可通过促进N-cadherin和Bcl-2表达,抑制E-cadherin和Bax表达,进而增强HepG2细胞的增殖和迁移能力。