免疫复合物刺激的人嗜中性粒细胞信号转导过程与FcrR的关系

关于用趋化肽FMLP 刺激人嗜中性粒细胞的信号转导已有广泛深入的研究。FMLP与嗜中性粒细胞的作用可以导致嗜中性粒细胞趋化性、酶分泌和O_2~-生成。嗜中性粒细胞上FcrR 介导的这些反应需要有一种对百日咳毒素敏感的g 结合蛋白的参与,其结果是生成1,4,5三磷酸肌醇[Ins(1,4,5)P_3]和甘油二酯(DAG),分别导致[Ca~(25)]i的升高以及蛋白激酶C 活化和NADPH 氧化酶的激活。     

杀菌性/通透性增加蛋白的基础及临床研究进展

杀菌性/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeabili-ty increasing protein,BPI)存在于人或哺乳动物中性粒细胞(PMN)嗜天青颗粒中,是机体抵抗细菌侵袭的具有抗菌作用的多肽家族的重要一员。需要说明的是尽管内源性抗菌物质存在于从原核细胞、植物和昆虫到哺乳动物的整个进化过程中,但是哺乳动物的抗菌物质只有少数在体内实验中证实确实有效。正因为     

杀菌/通透性增加蛋白N端片段在原核细胞中的表达及其临床应用的初步探讨

目的：构建编码杀菌，通透性增加蛋白(BPI)N端片段基因原核表达载体，并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法：采用RT-PCR技术，从人外周血中性粒细胞的总RNA中扩增BPI蛋白N端片段cDNA编码区基因，DNA序列分析鉴定；将测序证实的BPI蛋白N端片段编码区基因PCR产物直接克隆于原核表达载体pBAD／Thio-TOPO中，再次测序鉴定；通过在大肠杆菌中以L-阿拉伯糖进行诱导表达，然后以SDS-PAGE、Westerm blot对表达的重组蛋白进行分析。重组蛋白经初步纯化处理后，进行生物学活性检测。结果：RT-PCR扩增出一个835bp的DNA片段，DNA测序表明为所需目的基因。限制性内切酶酶切和DNA序列分析表明，BPI蛋白N端片段正确克隆到大肠杆菌表达载体pBAD／Thio-TDPO中，SDS-PAGE和Wester blot结果表明在大肠杆菌中成功表达了BPI蛋白N端片段。对该蛋白进行初步活性测定显示其可与BPI单克隆抗体结合并具有杀灭耐药铜绿假单胞菌的活性。结论：成功构建了BPI蛋白N端片段编码区基因原核表达载体，并在大肠杆菌中进行了表达，表达的重组蛋白具有一定的生物活性。     

抗人BPI23单克隆抗体的制备和鉴定

目的 采用杂交瘤技术制备抗人BPI23单克隆抗体,并对其应用进行初步分析。方法 免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按常规方法融合;用间接ELISA法和Western - blot筛选分泌抗体的杂交瘤细胞株;阳性克隆用有限稀释法亚克隆3次获得稳定分泌抗人BPI23单克隆抗体的杂交瘤细胞株;扩增杂交瘤细胞注入小鼠腹腔后制备腹水;纯化腹水中的单抗并对抗体类型进行鉴定;用Western-blot分析抗体的特异性;用间接ELISA法测抗体效价;将分离纯化的正常人外周血中性粒细胞和单个核细胞制成涂片,用抗人BPI23单克隆抗体进行免疫染色。结果 获得3个（1B4、9C12和2H11）稳定分泌抗人BPI23单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型分别为κ型IgM、κ型IgG1和κ型IgG1;抗体效价分别为1.28×105、1.28×105和4.1×106,纯化后抗体含量分别为0.208g/L、2.03g/L和3.88g/L;3种纯化抗体均能与本实验制备的人BPI23和市售人BPI55标准品特异性结合,而不能与小鼠BPI25和人LBP结合;在免疫组化实验中,1B4、9C12和2H11单抗均能与人中性粒细胞中的BPI特异性结合。结论 成功制备了人BPI23特异性单克隆抗体,为BPI检测试剂盒的研制奠定了基础。     

中性粒细胞的功能及其与器官移植关系的研究进展

中性粒细胞是一种多核白细胞,也是急性炎症反应的主要参与者[1,2]。它们是首先到达炎症部位的白细胞,通过多种机制消除病原体[3-5]。实验数据和临床研究表明[6],中性粒细胞对于感染的消除是至关重要的,血液中中性粒细胞的减少会导致严重的免疫缺陷。一般认为,中性粒细胞寿命短,在鼠和人体中分别为1.5小时和8小时[7]。但最近研究表明,中性粒细胞在小鼠中可达12.5小时,人体中     

自身免疫肝病患者抗中性粒细胞胞浆抗体的检测及临床意义

探讨抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplastic antibodies,ANCA)对自身免疫肝病的临床意义。应用间接免疫荧光法和斑点法检测149例自身免疫性肝病患者[自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)患者57例,原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)患者42例,不明原因肝损患者50例]的ANCA和抗可提取性核抗原抗体(extract-able nuclear antigen,ENA),进而用ELISA法分析60例ANCA阳性的自身免疫肝病患者的ANCA抗原谱。以200例健康献血员为正常对照。结果ANCA在AIH、PBC、不明原因肝损中的阳性率分别为81%、40%、30%,其中非典型性pANCA的阳性率依次为70%、40%、28%。AIH组与PBC组及AIH组与不明原因肝损组间非典型性pANCA的阳性率有显著性差异(P<0.01),但PBC组与不明原因肝损组间差异不显著(P>0.05)。各疾病组ANCA抗原谱如下:AIH组中,乳铁蛋白3%阳性,MPO 11%阳性,组织蛋白酶G和BPI的阳性率分别为11%、17%;PBC组中,弹性蛋白酶和组织蛋白酶G阳性率均为5%,BPI的阳性率为16%;不明原因肝损组中,BPI阳性率为17%。大多数自身免疫性肝病患者非典型性pANCA为阳性(28%~70%),且伴有特征性自身抗体。注重非典型性pANCA的检测对明确诊断自身免疫肝病及其分类有很大的帮助。     

激活素A对小鼠中性粒细胞活性的调控作用

目的:通过检测中性粒细胞激活素受体表达以及细胞活性,阐述激活素A调控中性粒细胞的作用。方法:分离小鼠腹腔中性粒细胞;通过免疫荧光细胞化学染色及流式细胞术检测中性粒细胞激活素ⅡA型受体(ActRⅡA)表达;激活素A刺激后,Western blot检测中性粒细胞Smad3表达;检测呼吸爆发、NO分泌及吞噬能力的变化以确定中性粒细胞活性。结果:分离的小鼠腹腔中性粒细胞纯度大于90%;免疫荧光细胞化学染色显示中性粒细胞可以表达ActRⅡA,流式细胞术检测结果显示Gr-1与ActRⅡA双阳性细胞约41.1%;激活素A刺激后,中性粒细胞p-Smad3表达上调,ROS及O2-产生升高(P0.05),NO分泌增加(P0.01),流式细胞术检测结果显示激活素A还可以明显促进中性粒细胞对荧光微球的吞噬(P0.01)。结论:中性粒细胞可以表达激活素受体及其信号传导蛋白,激活素A对中性粒细胞活化及功能具有重要的调节作用。     

流行性脑脊髓膜炎患儿血浆HNE α_1-AT及Fn含量的变化

中性粒细胞的活化产物粒细胞弹性蛋白酶(NE),以及α_1-抗胰蛋白酶(α_1-AT)和纤维结合蛋白(Fn)与感染,休克、烧伤等发病关系密切。本文测定流行性脑脊髓膜炎(流脑)患儿治疗前后血浆中上述三个指标的变化,为阐明发病原理和疗效机理积累资料。以从人中性粒细胞中提取出的人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE),为抗取制备兔抗HNE之抗体,酶联测定法测HNE含量,以单扩散法测定α_1-AT及Fn含量。测定值以均值±标准误((?)±SE)表     

分子伴侣性自噬参与LAMP-2抗体诱导中性粒细胞胞外捕网形成

目的探讨分子伴侣性自噬在LAMP-2抗体诱导中性粒细胞胞外捕网(NETs)形成的作用及机制。方法采用PolymorphprepTM方法分离健康志愿者和抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎(AAV)患者外周静脉血中的中性粒细胞,直接离体或LAMP-2抗体刺激健康人外周血中性粒细胞,通过自噬阻断剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)和放线菌酮(CHX)进行干预,免疫荧光观测NETs的形成,免疫荧光法和免疫印迹法检测分子伴侣自噬相关蛋白LAMP-2A、Hsc70的表达。结果与正常中性粒细胞组相比,AAV患者中性粒细胞LAMP-2A表达增加(P=0.002 3);LAMP-2抗体可诱导中性粒细胞LAMP-2A、Hsc70蛋白表达明显上调(P<0.01),CHX能明显降低LAMP-2抗体引起的LAMP-2A、Hsc70蛋白表达(P<0.000 1);与3-MA组相比,CHX组能明显减少LAMP-2抗体诱导的NETs形成(P<0.000 1)。结论 LAMP-2抗体可诱导人中性粒细胞分子伴侣性自噬增强及NETs形成,放线菌酮可抑制此过程,提示分子伴侣性自噬可能参与了NETs的形成。     

杀菌性/通透性增加蛋白(BPI)模拟肽兔体内拮抗内毒素作用的研究

目的:观察杀菌性/通透性增加蛋白(BPI)模拟肽对内毒素(LPS)血症大白兔的治疗作用。方法:以LPS250μg·KG~(-1)剂量静脉注射攻击日本大白兔制造兔内毒素血症模型,分别于LPS攻击后20秒内静脉注射不同剂量的BPI模拟肽;于LPS攻击前及攻击后不同时间内分别静脉注射5mg·kg~(-1)和10mg·kg~(-1)的BPI模拟肽,并观察BPI模拟肽对LPS攻击所致兔体温、中性     

肺炎链球菌表面蛋白A诱导人中性粒细胞生产CXCL8的机制

目的 研究肺炎链球菌表面暴露的毒性表面蛋白A(PspA)促进CXCL8分泌的可能机制.方法 使用炎症相关的信号分子NF-KB、p38MARK、ERK、JNK的抑制剂预处理人嗜中性粒细胞后,观察PspA对CXCL8分泌作用的影响.从受PspA刺激的人嗜中性粒细胞中分别提取细胞总蛋白和细胞核提取物,用ELISA法测定p38MAPK蛋白的活力和NF-κB的浓度的改变,并且采用Western blot方法进一步验证PspA对p38MAPK和IkB-α蛋白磷酸化水平的影响.结果 使用NF-κB,p38MARK的抑制剂预处理人嗜中性粒细胞后,可以扭转PspA促中性粒细胞分泌CXCL8的现象;而ERK,JNK的抑制剂无此效果.另一方面,PspA可以上调中性粒细胞中的P38 MAPK蛋白的含量和NF-κB的浓度,也可以提高p38MAPK和NF-kB通路抑制蛋白IkB-α的磷酸化水平.结论 肺炎链球菌PspA诱导人体中性粒细胞释放CXCL8受p38蛋白和NF-kB途径的调控.     

肺炎链球菌表面蛋白C诱导人嗜中性粒细胞分泌IL-8的机制研究

目的研究肺炎链球菌表面暴露的毒性表面蛋白C(PspC)促进IL-8分泌的可能机制。方法使用炎症相关的信号分子NF-κB,p38MARK,ERK,JNK的抑制剂预处理人嗜中性粒细胞后,观察PspC对IL-8分泌的影响。从受PspC刺激的人嗜中性粒细胞中分别提取细胞总蛋白和细胞核提取物,用ELISA法测定p38MAPK蛋白的活力和NF-κB的浓度,并且采用Western blot方法验证PspC对p38MAPK和IκB-α蛋白磷酸化水平的影响。结果使用NF-κB及p38MARK的抑制剂预处理人嗜中性粒细胞后,可以扭转PspC促中性粒细胞分泌IL-8的现象;而ERK和JNK的抑制剂无此效果。同时,PspC可以上调中性粒细胞中的P38MAPK蛋白的含量和NF-κB的浓度,也可以提高p38MAPK和NF-κB通路的抑制蛋白IκB-α蛋白磷酸化水平。结论肺炎链球菌PspC诱导人体中性粒细胞释放IL-8受p38MAPK和NF-κB途径的调控。     

中性粒细胞比值和C-反应蛋白预测急性胰腺炎严重程度的意义

目的：探讨中性粒细胞比值与C-反应蛋白预测急性胰腺炎严重程度的意义。方法采集80例急性胰腺炎患者的外周血液标本,分为轻症型急性胰腺炎组和重症急性胰腺炎组。分别检测各组患者中性粒细胞比值和C-反应蛋白水平。评估中性粒细胞比值和C-反应蛋白与急性胰腺炎严重程度之间的关系。结果轻症型急性胰腺炎组和重症急性胰腺炎组患者中性粒细胞比值和C-反应蛋白水平比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结果分析对比60例急性胰腺炎患者中性粒细胞比值和C-反应蛋白的受试者血清标本,C-反应蛋白较中性粒细胞比值在预测急性胰腺炎严重程度的诊断中具有更大的价值。结论 C-反应蛋白在预测急性胰腺炎的严重程度中优于中性粒细胞比值。     

白蛋白对脂多糖诱导中性粒细胞胞外诱捕网生成的抑制作用

目的探讨白蛋白对脂多糖(LPS)诱导人外周血中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)生成的抑制作用及机制。方法分离人外周血中性粒细胞,分别培养于无白蛋白和含生理浓度白蛋白的培养体系中,加入LPS刺激,同时使用钙离子(Ca~(2+))以及自噬调节剂干预,采用sytox green染色法检测NETs,采用Fluo-4 AM染色法检测胞内Ca~(2+)水平,免疫荧光法检测NETs相关蛋白髓过氧化物酶(MPO)、弹性蛋白酶(NE)和瓜氨酸化组蛋白H3(cit-H3)以及自噬体相关蛋白LC3B的表达。结果 LPS可诱导中性粒细胞释放NETs,白蛋白可抑制NETs生成;白蛋白可降低LPS刺激下中性粒细胞胞内Ca~(2+)浓度和自噬水平。Ca~(2+)载体可增强中性粒细胞自噬水平并促进LPS诱导的NETs生成,Ca~(2+)螯合剂可降低自噬水平并抑制NETs生成。自噬激动剂可显著增强NETs,自噬抑制剂则显著抑制NETs。结论白蛋白对LPS诱导中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)生成具有抑制作用,其作用机制可能与减少中性粒细胞Ca~(2+)内流进而抑制自噬有关。     

流体切应力对中性粒细胞内Ca2+的影响

流体切应力是中性粒细胞的重要功能环境 ,但以往的研究很少涉及力学作用对中性粒细胞的影响。我们利用旋转粘度仪提供的流体切应力作用于分离的中性粒细胞 ,采用Fura 2 /AM与细胞内游离Ca2 结合 ,检测其荧光强度 ,研究不同力学条件下细胞内游离Ca2 浓度的变化情况 ;另外 ,分别以f MLP和TNF两种刺激因子作用中性粒细胞 ,使之激活 ,与此同时考察流体力学作用对中性粒细胞激活程度的影响。结果显示 :定常剪切流 ,切变率由低变高时 ,中性粒细胞内的游离Ca2 水平先是显著下降 ,切变率达到一定程度后 ,[Ca2 ]i逐渐回升 ,并且会超过静止时的水平 ;两种刺激因子在静态下激活中性粒细胞均可使游离Ca2 大幅度上升 ,同时给予定常流作用 ,在较低切变率作用下 ,这一上升被明显抑制 ,当切变率升高到一定程度后 ,[Ca2 ]i回复到静态激活水平甚至更高。正弦振荡剪切作用于中性粒细胞 ,[Ca2 ]i随最大切变率增大而升高 ,当激活剂和剪切流同时作用时 ,[Ca2 ]i随最大切变率升高而下降 ,逐渐接近最大切变率相同时的单纯振荡切应力作用的水平。由此我们认为 :体内不同血流环境将影响中性粒细胞的 [Ca2 ]i,在不同循环部位的血管血流中 ,流体切应力对中性粒细胞的 [Ca2 ]i有着不同的调节作用。     

慢性乙型肝炎患者中性粒细胞中乙型肝炎病毒的检测和分析

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)能否感染慢性乙肝患者中性粒细胞并在中性粒细胞复制增殖。方法以中性粒细胞分离液分离、纯化中性粒细胞,PCR检测中性粒细胞内HBV-DNA。结果慢性乙型肝炎患者治疗前中性粒细胞内HBV-DNA阳检率为30.95%(13/42),其中"大三阳"、"小三阳"患者中性粒细胞内HBV-DNA阳检率分别为52.94%(9/17)和16.00%(4/25);阿德福韦酯治疗后中性粒细胞内HBV-DNA阳检率为9.52%(4/42),其中"大三阳"、"小三阳"患者中性粒细胞内HBVDNA阳检率分别为17.65%(3/17)和4.00%(1/25),慢性乙型肝炎各组治疗前后阳检率相比均有统计学意义(P0.05)。结论 HBV可感染患者中性粒细胞形成肝外隐匿感染;阿德福韦酯对潜伏或隐匿于中性粒细胞内的HBV具有较好的抑制作用。     

系统性红斑狼疮患者外周血中性粒细胞自噬和胞外诱捕网形成增加

目的 探究中性粒细胞自噬、凋亡和胞外诱捕网(NET)形成在系统性红斑狼疮(SLE)中的作用。方法 收集36例女性SLE患者(SLE组)和同期32例健康体检者为对照，Western blot法检测SLE患者和健康体检者中性粒细胞微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、自噬相关基因5(ATG5)、 P62、 B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)、 Bcl2相关X蛋白(BAX)的蛋白表达；流式细胞术检测中性粒细胞LC3B的蛋白表达；ELISA检测血浆髓过氧化物酶(MPO)水平。体外分离培养中性粒细胞，分别用100 nmol/L雷帕霉素和10μg/mL脂多糖(LPS)处理6 h, Western blot法检测中性粒细胞LC3B、 ATG5、 P62、 Bcl2和BAX的蛋白表达，ELISA检测培养上清中MPO水平，Sytox^TMGreen染色结合荧光光度法检测培养上清中NET形成的荧光强度变化。结果 与健康对照组比较，SLE组中性粒细胞自噬、凋亡水平和NET形成均显著增加，中性粒细胞自噬与凋亡、 NET分别正相关；雷帕霉素诱导中性粒细胞自噬活化，但对凋亡和NET形成无明显影响；L...     

中性粒细胞CD64的表达对重症手足口病患儿的诊断价值

目的:探讨中性粒细胞CD64的表达对重症手足口病患儿的诊断价值。方法:选择在我院住院的手足口病初诊患儿共134例,其中重症组为52例,普通组为82例,应用流式细胞术测定中性粒细胞CD64,同时测外周血C反应蛋白(CRP)、白细胞及分类。结果:重症组CD64水平为(14.11±9.08)平均荧光强度(MFI),明显高于一般感染组(10.75±3.88)MFI(P<0.05),以CD64≥10.5MFI为阳性标准,CD64在重症组的阳性率为51.9%,普通组患儿为10.9%,两者阳性率有统计学差异(P<0.01)。结论:中性粒细胞CD64的表达适用于重症手足口病感染病情的监测,而且还可作为抗生素应用的依据。     

结核杆菌抗原激活MEK-ERK信号通路延迟中性粒细胞自发性凋亡的作用

探讨结核杆菌抗原(Mtb-Ag)对中性粒细胞自发性凋亡的影响。取健康成人外周血分离中性粒细胞,加Mtb-Ag培养24 h,或用Mek抑制剂PD98059预处理30 min,Annexin V染色流式细胞术观察细胞凋亡;并用Western blot印迹法检测Mek活化情况。与中性粒细胞体外培养24 h后自发凋亡(55%±6%)相比,加入Mtb-Ag(1.125 mg/ml)后,中性粒细胞凋亡率(31%±3%)明显降低;并且Mtb-Ag可诱导Mek的激活;而PD98059(50μmol/L)预处理可阻断Mtb-Ag的抑制凋亡作用。Mtb-Ag对中性粒细胞自发凋亡有抑制作用,这一作用涉及Mek-Erk途径。     

CXC类趋化因子GROα、ENA-78及NAP-2在大鼠哮喘中的表达及意义

目的 观察大鼠哮喘生长相关癌基因α(GROα)、内皮中性粒细胞激活肽78(ENA-78)和中性粒细胞激活蛋白2(NAP-2)的表达,探讨中性粒细胞(NEU)参与哮喘发病机制的可能作用.方法 大鼠随机分成哮喘组和对照组,流式细胞术测定血ENA-78的表达,免疫组织化学法测定支气管GROα蛋白和血NAP-2蛋白的表达水平.结果 哮喘组GROα、ENA-78和NAP-2蛋白的表达水平[分别为0.138 ±0.009(A值)、97.65±13.99(平均荧光指数,MFI)、0.198±0.016(A值)]高于对照组[分别为0.077±0.010(A值)、50.79±8.66(MFI)、0.079±0.015(A值)],P均<0.01.结论 大鼠哮喘GROα、ENA-78和NAP-2的表达水平增加,它们可能参与了哮喘的气道炎症过程.NEU可能通过增加合成CXC类趋化因子促进炎症细胞在气道中聚集.