抗Periostin单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗Periostin单克隆抗体并鉴定其免疫学性能,为后期临床应用奠定基础。方法:表达并纯化Periostin的GST融合蛋白,经过免疫小鼠、细胞融合及亚克隆筛选,制备效价良好的高亲和力单克隆抗体,并用免疫组化实验鉴定其免疫学性能。结果:获得6株杂交瘤细胞株,均能稳定分泌高亲和力抗体,经酶联免疫吸附测定、Western blot和免疫组化实验证实均能特异性识别人的Periostin,显微镜下观察发现Periostin在结直肠癌、乳腺癌等肿瘤患者的组织切片中表达水平显著高于健康人。结论:成功制备了高亲和力、特异性强的抗人Periostin单克隆抗体,为小分子抗体以及抗体人源化制备奠定了基础,进而为治疗人体内组织器官纤维化提供理论依据。     

SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备SARS冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白特异性单克隆抗体(McAb)，为SARS的快速诊断及致病机制的研究提供实验材料。方法 用纯化的重组SARS-CoVN蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合和亚克隆后获得分泌针对N蛋白的杂交瘤细胞株，用Western blot和间接免疫荧光法检测这些细胞株分泌的单克隆抗体特异性，并将N蛋白分3段表达初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。结果 通过细胞融合和3轮克隆化，筛选出分泌抗N蛋白的6个杂交瘤细胞株。Western blot及免疫荧光显示，获得的McAb可与SARS-CoVN蛋白及SARS-CoV发生特异性反应，有4个细胞株分泌的抗体的识别位点位于N蛋白N端，2个位于C端。结论 获得了SARS-CoV特异性单克隆抗体并进行了初步定位，可用于SARS的早期诊断及致病机制研究。     

抗GRP78单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:原核表达GRP78并制备抗GRP78的特异性单克隆抗体(mAb),并初步鉴定相应mAb的特性。方法:从肺癌患者组织中抽提总RNA,RT-PCR获得grp78全长基因,并通过原核重组表达GRP78蛋白;以纯化的GRP78蛋白免疫BALB/c小鼠,成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合,筛选得到分泌特异性抗GRP78的mAb的杂交瘤细胞株;并通过Western blot及免疫组化初步鉴定其特异性。结果:成功构建重组表达质粒PET-28a-grp78并由大肠杆菌表达获得GRP78蛋白,被该蛋白免疫的BALB/c小鼠与Sp2/0细胞融合、筛选,获得3株稳定分泌抗GRP78抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2A1、4B8和4A12。采用其中1株4A12 mAb对3个肺癌患者组织样本进行Western blot检测以及免疫组化分析,结果均显示4A12 mAb能够特异识别肺癌组织表达的GRP78。结论:成功制备了抗GRP78的mAb,并能够特异识别肺癌组织表达的GRP78,为进一步研究GRP78在肿瘤治疗中的作用提供基础。     

抗多菌灵单克隆抗体的制备、纯化及初步鉴定

目的:制备抗多菌灵小鼠单克隆抗体(mAb),并初步鉴定其特性,为快速检测蘑菇、干菇类中残留的多菌灵提供基础。方法:将小分子的多菌灵交联在大分子载体匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)上,KLH交联物用于免疫BALB/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,通过融合,筛选制备抗多菌灵mAb,并通过ELISA方法测定抗体亲和力,检测mAb的交叉反应,及初步竞争抑制检测。结果:通过ELISA筛选出7株稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,其亚型均为IgG1。与同属于苯并咪唑类杀菌剂的苯菌灵和甲基硫菌灵没有交叉反应。竞争抑制检测结果显示MC-3细胞株竞争效果较好。结论:获得1株高特异性、高亲和力、能稳定分泌抗多菌灵抗体的杂交瘤细胞株,为进一步研发多菌灵残留免疫检测技术和产品奠定基础。     

抗人DAF单克隆抗体的制备及鉴定

以初步纯化的人红细胞膜ＤＡＦ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,取免疫小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合,成功地获得３株（ＤＧ３、ＤＧ９和ＤＡ１１）抗人ＤＡＦ单克隆抗体。经间接ＥＬＩＳＡ测定,３株杂交瘤细胞培养上清及腹水的抗体效价分别为１０－３～１０－４及１０－６～１０－７;３株单抗的重链为小鼠ＩｇＧ１亚类,轻链为κ型。结合还原条件下的免疫印迹实验及３株单抗对ＤＡＦ促衰变活性的抑制作用,推测ＤＧ９识别的抗原表位为ＳＣＲ１,而ＤＧ３和ＤＡ１１为ＳＣＲ２至ＳＣＲ４。     

鼠抗人S100A9 天然蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的:探索以白细胞为免疫原的鼠抗人白细胞天然蛋白单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAbs)制备与克隆筛选鉴定方法,制备鼠抗人S100A9 天然蛋白单克隆抗体,并鉴定抗体性质。方法:用健康人外周血白细胞免疫小鼠,利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备mAbs,通过免疫细胞化学法对杂交瘤细胞进行非特异性阳性筛选,有限稀释法进行亚克隆,应用免疫沉淀鄄质谱法进行mAb 特异性鉴定,通过Western blot 进行细胞株筛选,小鼠体内诱生腹水法制备单抗,亲和层析法纯化,ELISA 间接法测定效价及亲和力,Western blot 进行特异性鉴定及交叉反应性分析,免疫组化染色人乳腺癌石蜡切片。结果:获得免疫细胞化学检测阳性多克隆细胞35 孔,分泌鼠抗人S100A9 蛋白单克隆抗体细胞株11 株,优选1 株制备腹水并纯化鉴定抗体,抗体效价为1 3.18 105 ,亚类为IgG1,轻链为kappa 链,抗体纯度达95%以上,亲和力常数3.54 108 L/ mol,与S100A8的交叉反应率为0.12%,与S100A12 和S100A13 几乎无交叉反应,组化染色识别人乳腺癌组织中的S100A9 蛋白。结论:成功制备鼠抗人S100A9 天然蛋白单克隆抗体,该单抗具有高效价、较高亲和力和高特异性,能为其应用于免疫组化检测S100A9蛋白的表达提供依据。     

抗温和气单胞菌单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗温和气单胞菌(Aeromonassobria,As)单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法以灭活的温和气单胞菌免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备抗温和气单胞菌mAb。用间接ELISA法对mAb的特性进行初步鉴定。结果获得6株能稳定分泌抗温和气单胞菌mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1A8、2A8、2F11、3C6、3D11、4G2。经测定杂交瘤细胞培养上清及其诱生的腹水mAb效价分别为1×10-2~1×10-3、1×10-5~1×10-6。6株杂交瘤细胞系所分泌的mAb亚类是2A8、2F11为IgG1,1A8、3D11为IgG2a,3C6为IgG2b,4G2为IgG3。其中mAb3C6经交叉反应试验证明,与弧菌属其他几种细菌均不起反应,特异性强。结论成功地制备了抗温和气单胞菌mAb的杂交瘤细胞株,为该病的免疫学诊断及防治提供了基础。     

抗嗜水气单胞菌单克隆抗体的制备及初步鉴定

嗜水气单胞菌是养殖及野生鱼、虾、蛙、甲鱼等生物常见的细菌性病原体[1],可通过受伤的皮肤及伤口感染,并可通过食物链感染人,造成腹泻、败血症等疾病而严重威胁人类健康,是我国沿海地区人群中最常见的致病性弧菌之一[2].     

抗HIV-1 Tat蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备抗HIV-1 Tat蛋白的单克隆抗体(mAb),并对其进行初步鉴定.方法:通过动物免疫、细胞融合、克隆化制备抗Tat蛋白的mAb,并用ELISA法对所得mAb的特异性、抗原识别表位及相对亲和力等做了初步鉴定.结果:获得了3株抗Tat蛋白的mAb,这3株mAb均能特异识别Tat蛋白.结论:获得了3株杂交瘤细胞系,均可以稳定分泌抗HIV-1 Tat蛋白的mAb,有望为HIV早期检测及HIV抗病毒治疗提供有用工具.     

抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法以重组P6蛋白腹腔免疫BALB/c小鼠,常规细胞融合技术制备杂交瘤细胞株;间接ELISA筛选阳性细胞克隆并检测染色体数目;测定细胞培养上清的mAb效价及特异性,鉴定mAb的免疫球蛋白类、亚类及抗原结合表位。结果获得2株抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的杂交瘤细胞株α2G3和γ2C4,染色体众数分别为103与95;间接ELISA结果证明细胞培养上清最高效价分别为1∶256和1∶512,未出现与其他种类细菌的交叉反应;α2G3为IgG2b、γ2C4为IgM,均为κ型;两者可能识别P6蛋白不同表位。结论成功制备了抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的mAb。     

抗人μ链单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备高效价的鼠源性抗人μ链单克隆抗体(mAb),并建立可用于感染性疾病早期血清学诊断的ELISA捕捉法。方法:以人IgM全分子免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,用间接ELISA法筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗μ链mAb的杂交瘤细胞株。mAb的特性(效价、Ig亚类、特异性及相对亲和力)采用ELISA及Westernblot法鉴定。以纯化的mAb包被建立ELISA捕捉法,并用于可疑乙脑患者标本中特异性IgM抗体的检测。结果:筛选到1株可稳定分泌抗人μ链mAb的细胞株2E5。mAb腹水的ELISA效价为1×10-6,Ig亚类(型)为IgG1(κ),相对亲和力为1×10-5。Westernblot结果显示mAb2E5仅与IgM的μ链结合,Mr为75000。以辛酸硫酸铵法纯化的mAb2E5包被,建立了ELISA捕捉法,用于30份乙脑患者血清IgM的检测,敏感性及特异性良好。结论:成功地制备1株抗人μ链mAb2E5,建立了可用于感染性疾病早期血清学诊断的ELISA捕捉法。     

抗人活化B淋巴细胞单克隆抗体制备及鉴定

自儿童手术摘除的新鲜扁桃体分离人Ｂ淋巴细胞，经ＰＭＡ（佛波醇）激活后得到人活化Ｂ淋巴细胞，用于免疫ＢＡＢＬ／Ｃ小鼠后，取免疫小鼠之脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，融合后细胞于含ＨＡＴ－ＩＭＤＭ完全培养基的２％甲基纤维素半固体培养基选择生长，经细胞酶联免疫吸附（ＣＥＬＩＳＡ）筛选间接免疫荧光流式细胞仪鉴定，获培养上清对活化Ｂ细胞及３Ｄ５细胞株细胞反应阳性，而Ｊｕｒｋａｔ细胞株细胞反应阴必的杂交     

抗HSPC238单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的制备抗HSPC238的单克隆抗体，为HSPC238的功能研究奠定基础。方法以纯化的重组蛋白HSPC238为抗原，免疫BALB／c小鼠，运用杂交瘤技术制备HSPC238单克隆抗体，并用间接ELISA法和Western—blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果成功建立两株稳定分泌抗HSPC238的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为E001和E002。ELISA检测抗HSPC238单克隆抗体的腹水效价为1：12800和1：25600。两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。通过Western—blot实验证实，两株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性HSPC238蛋白。结论成功制备了两株效价高、特异性好的抗HSPC238单克隆抗体，制备的抗HSPC238单克隆抗体可用于HSPC238蛋白的鉴定，为HSPC238蛋白的生物学功能研究奠定了基础。     

人卵泡刺激素β亚基单克隆抗体的制备及鉴定

目的　建立分泌抗人卵泡刺激素 (FSH) β亚基 5 1～ 6 0片段单克隆抗体细胞株 ,并对单抗进行免疫学鉴定。 方法　以人工合成的FSHβ蛋白抗原决定簇多肽为免疫原 ,采用脾内包埋法免疫Balb c小鼠 ,取其脾细胞与SP2 0小鼠骨髓瘤细胞融合 ,杂交瘤细胞用人工合成的人FSHβ亚基 5 1～ 6 0片段包被、间接ELISA法筛选。结果　获得稳定分泌抗人FSHβ片段单抗细胞 1株 (F1C)。ELISA检测腹水效价为 1∶1.6× 10 4 ,与黄体生成素 (LH)、促甲状腺素 (TSH)、人绒毛膜促性腺激素 (hCG)等无交叉反应 ,免疫印迹 (Westernblot)显示该单抗特异性强。结论　本实验所制备的单抗具有良好的灵敏性、特异性和实用性 ,可用于酶免疫检测方法的建立 ,为检测试剂盒的研制及其临床应用提供了有力的依据     

人促甲状腺激素单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备特异性强、灵敏度高的人促甲状腺激素（hTSH）单克隆抗体,为建立高灵敏性和高特异性的hTSH检测方法奠定基础。方法：人工合成人促甲状腺激素（hTSH）上的28个氨基酸,采用戊二醛交联法与牛血清白蛋白（BSA）构建完全抗原。用人工免疫原免疫BALB／c小鼠,利用杂交瘤技术建立分泌抗hTSH单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对得到的单抗进行鉴定。结果：建立了一株杂交瘤细胞4E5,制备了腹水单抗,经鉴定,抗体重链属于IgG1类型,轻链属于K型,McAb腹水ELISA效价达1：1．6×10^5,与促黄体生成激素（LH）、促卵泡激素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）无明显交叉反应,细胞株冻存复苏后抗体分泌稳定。结论：本实验建立的细胞株显示稳定性好,特异性高,McAb腹水效价高,为进一步提高hTSH检测的灵敏性和简便性提供依据。     

pICln蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备特异性的抗plCln蛋白的单克隆抗体(McAb),为plCln的纯化及检测等提供必要的工具.方法:以pICln的合成肽为免疫原,对BALB/c小鼠注射免疫,将免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞NS-1进行细胞融合,用显微镜下挑选单个克隆的克隆化方法克隆化,用间接ELISA检测法进行筛选.单抗的效价、亚型及特异性用ELISA、免疫双向扩散实验和Western blot等检测.结果:获得了稳定的分泌型杂交瘤细胞株大2B7和4A3,2B7培养上清液单抗效价为1:64,属IgGl亚型,其腹水抗体效价及纯化抗体的效价分别为1:1.28×104、1:6.4×103,Westem blot及免疫耗竭实验呈现一条约40 kD)的特异性带,免疫组织化学染色显示在细胞核和细胞质中呈现阳性反应.结论:本次制备的单抗具有特异性、高效价,可应用于plCln蛋白的纯化及检测等研究.     

抗人肝癌单克隆抗体HL2的制备及鉴定

用肝癌细胞株QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721以贯序法免疫BALB/c小鼠,获得一株分泌肝癌单抗的杂交窟株HL_2,其染色体数目为97—105。单抗HL_2系IgG_2b亚类。吸收实验及阻断实验证明HL_2抗原与CEA、AFP、HBsAg、HBcAg及HBeAg无免疫同源性。ABC法和ELISA法说明单抗HL_2与四株肝癌细胞、六例肝癌组织均呈明确阳性反应,除与SGC-7901、H_(128)、K_(562)、Hela细胞株及部分胚胎肝脏,胚胎结肠有较弱性反应外,与肝癌旁组织、正常肝脏、其它肿瘤组织和细胞株、二种正常人细胞及其它胚胎组织无反应。显示了单抗HL_2的特异性较好、阳性率较高,是一个有应用前景的单抗。