沉默Gli2基因对人肝癌细胞系SMMC-7721体外血管生成的影响

目的探讨胶质瘤相关癌基因2(Gli2)对肝癌细胞SMMC-7721体外血管生成作用及机制。方法设干扰组、对照组和空白组;构建靶向Gli2的shRNA重组慢病毒和阴性对照慢病毒,转染到SMMC-7721细胞,RT-q PCR和Western blot检测沉默效率;用体外血管生成实验检测血管生成能力;用ELISA检测SMMC-7721细胞上清液中VEGF-A、MMP-2分泌水平;用RT-q PCR、Western blot检测细胞内VEGF-A、MMP-2的表达差异。结果 shRNA慢病毒转染率为90%左右,干扰组与对照组和空白组相比Gli2表达降低(P0.05);血管生成能力减弱(P0.05);上清液中VEGF-A含量下降(P0.05);细胞中VEGF-A、MMP-2表达明显降低(P0.05)。结论沉默Gli2的表达能够抑制肝癌细胞SMMC-7721血管生成,其机制可能与VEGF-A、MMP-2的下调有关。     

VCC－1真核表达载体的构建及肝癌细胞SMMC7721稳定转染株的建立及鉴定

目的:构建pcDNA3.1(一)/VCC-1真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC-7721中.方法:以SMMC7721细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增VCC-1基因编码区cDNA,并将扩增的cDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(一)中.重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导人到人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RTPCR及Western blot检测转染前后该细胞株VCC-1基因的表达.结果:pcDNA3.1(一)/VCC-1经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RT-PCR及Westcm blot检测,重组质粒转染株的VCC-1基因的表达水平高于对照组,证实VCC-1基因稳定转染到SMMC-7721细胞中并得到表达.结论:成功地建立了人基因VCC-1的肝癌细胞SMMC-7721稳定转染株,为进一步研究VCC-1的功能奠定了基础.     

人类基因XAPC7真核表达载体的构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达.方法:采用PCR法从pET28b/XAPC7重组质粒中克隆得到XAPC7 cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中.构建好的pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达质粒经酶切鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再应用半定量RT-PCR技术检测转染前后该细胞株XAPC7基因的mRNA表达水平.结果:pcDNA3.1(-)/XAPC7经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RT-PCR检测,重组质粒转染株的XAPC7基因mRNA表达水平高于对照组,证实XAPC7基因已经稳定转染到SMMC-7721细胞中并得到表达.结论:成功地建立了人基因XAPC7的稳定转染细胞株,为进一步研究XAPC7的功能奠定了实验基础.     

RNAi沉默Beclin 1基因对维生素K3损伤人肝癌细胞SMMC-7721的影响

目的： 探讨应用RNAi技术沉默Beclin 1基因对维生素 (vitamin K3,Vit K3)引起的人肝癌SMMC-7721细胞损伤的影响。方法: 应用真核细胞转染技术将Psilencer 3.1-siRNA-Beclin 1重组质粒转入人肝癌SMMC-7721细胞,同时分别设立转染空质粒阴性对照组和转染试剂阴性对照。于48 h后收集细胞,分别提取细胞总RNA及总蛋白,通过RT-PCR和Western blotting检测Beclin 1基因表达。应用40 μmol/L Vit K3作用Beclin 1-siRNA细胞株,Hoechst 33342染色检测细胞凋亡率。结果: 与对照组相比,siRNA重组质粒明显降低Beclin 1 mRNA水平,抑制其蛋白表达。40 μmol/L Vit K3作用人肝癌SMMC-7721细胞Beclin 1 mRNA表达明显高于对照组,细胞凋亡率增加(P<0.01）;而Beclin 1-siRNA细胞株,Beclin 1 mRNA表达显著低于对照组,与40 μmol/L Vit K3作用组相比细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。结论: Psilencer 3.1-siRNA-Beclin 1转染人肝癌SMMC-7721细胞后,可有效抑制Beclin-1 mRNA和蛋白的表达,抑制Vit K3引起的Beclin 1依赖性细胞自噬信号通路的激活,促进细胞凋亡。     

PAK2真核表达载体的构建及在胃癌细胞内的表达与定位

目的 构建PAK2真核表达载体及证实在胃癌细胞内的表达与定位.方法 提取HeLa细胞的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增PAK2全长编码基因,克隆至pcDNA3.1A表达载体中.将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞SGC-7901中,Western blot检测蛋白表达,免疫荧光检测PAK2在胃癌细胞内的定位.结果...     

含人FcγRⅡB基因慢病毒的制备及其在HT-1080细胞中的表达

目的构建FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,并鉴定其在细胞中的表达。方法以人mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒TRE,构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒可诱导质粒Tet分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,分别包装表达病毒和可诱导病毒,分别测定表达病毒和可诱导病毒感染滴度。表达病毒和可诱导病毒共感染HT-1080细胞,经梯度浓度强力霉素(Dox)诱导,实时定量PCR检测FcγRⅡB mRNA表达,免疫荧光染色检测HT-1080细胞FcγRⅡB表达,Western blot法检测FcγRⅡB蛋白表达。结果重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定,测序结果显示插入片段碱基序列与GenBank提供FcγRⅡB基因序列同源性100%。表达病毒滴度达106TU/mL,可诱导病毒滴度达105TU/mL,感染性良好。HT-1080细胞被病毒感染后经Dox诱导表达FcγRⅡB,免疫荧光染色结果显示FcγRⅡB能够在HT-1080细胞中表达;实时荧光定量PCR和Western blot法结果显示FcγRⅡB表达水平与诱导剂浓度正相关。结论成功制备了FcγRⅡB慢病毒,感染HT-1080细胞后可实现FcγRⅡB的诱导表达。     

shRNA下调Paxillin表达对SMMC-7721肝癌细胞增殖、侵袭的影响

目的采用RNA干扰技术转染shRNA下调SMMC-7721肝癌细胞中Paxillin的表达,探讨Paxillin下调对SMMC-7721细胞迁移、侵袭力的影响。方法采用Paxillin shRNA转染肝癌细胞株SMMC-7721,分别设未处理SMMC-7721肝癌细胞组(未处理组)、shRNA Paxillin阴性组(对照组)和shRNA Paxillin组(实验组)。以GAPDH为内参,采用qRT-PCR、Western blot、ELISA法分别检测各组SMMC-7721细胞中Paxillin与FAK的表达;筛选出稳定转染Paxillin shRNA的肝癌细胞株,采用MTT、Transwell侵袭小室法分别检测各组细胞的增殖情况和侵袭力差异。结果 qRT-PCR和ELISA结果均显示Paxillin表达明显下调(P0.05),FAK表达各组间差异无显著性(P0.05);Western blot法检测结果显示实验组Paxillin的相对表达量明显低于未处理组和对照组;成功构建Paxillin稳定表达的SMMC-7721肝癌细胞株;MTT细胞增殖与Transwell细胞侵袭力检测显示Paxillin下调肝癌细胞的增殖、侵袭能力明显低于未处理组和对照组(P0.05)。结论 shRNA干扰技术可以下调Paxillin的表达;Paxillin表达下调抑制SMMC-7721肝癌细胞的增殖、侵袭能力;Paxillin有望成为肝癌复发、转移预测和基因治疗的新靶点。     

丙型肝炎双移位F蛋白抑制肝癌细胞p16、p21的表达

目的:探讨丙型肝炎双移位F(DF)蛋白对肝癌细胞抑癌基因p16、p21转录与表达的影响。方法:PCR扩增HCV1b型DF基因,构建pCDNA3.0/HCV-DF真核表达载体。再转染至肝癌细胞HepG2中,G418筛选稳定表达细胞株,Western blot检测p16、p21蛋白表达及半定量RT-PCR法检测p16、p21基因转录,并以pCDNA3.0空质粒作为阴性对照。结果:重组质粒pCDNA3.0/HCV-DF蛋白在HepG2细胞中稳定表达,pCDNA3.0/HCV-DF转染细胞中p16、p21 mR-NA转录水平和蛋白表达水平较空质粒转染的细胞明显下降。结论:HCV-DF蛋白能够抑制p16、p21表达,提示可能参与肝细胞癌变发生发展。     

TAZ/WWTR1影响肝癌细胞SMMC-7721的侵袭、迁移能力

目的 探讨转录共激活子TAZ/WWTR1对肝癌细胞株SMMC-7721侵袭、迁移的影响,为寻找原发性肝细胞癌的防治提供理论基础.方法 TAZ基因靶向干扰RNA的设计合成:从TAZ的信使RNA(mRNA)中挑选出合适的siRNA靶点序列作为候选,序列通过基因BLAST,得出三对siRNA;TAZ过表达质粒的构建:从SMMC-7721细胞中提取TAZ基因,使用pCMV5-HA为载体构建人TAZ过表达质粒;细胞转染:以LipofectaminTM2000为载体,将TAZ siRNAs转入SMMC-7721细胞中,应用实时RT-PCR和Western blotting检测TAZ的表达情况,筛选出于扰效果最佳的siRNA,并进一步比较转染了TAZ siRNA组与转染了阴性对照组的SMMC-7721细胞侵袭、迁移能力的变化;构建稳定过表达TAZ基因的人肝癌细胞(SMMC-7721)系:用LipofectaminTM2000将TAZ过表达质粒转染入SMMC-7721细胞中,使用G418筛选出稳定高表达TAZ的细胞系,应用Transwell侵袭实验观测TAZ稳定过表达的SMMC-7721细胞的侵袭、迁移能力.结果 三对siRNA均可使TAZ表达下调,其中siRNA-1效果最佳;与阴性对照组相比,转染了TAZ siRNA-1的SMMC-7721细胞的侵袭、迁移能力下降;经过鉴定确定为稳定过表达TAZ的SMMC-7721细胞的侵袭、迁移能力相比于阴性对照组显著升高.结论 本研究通过靶向干扰和稳定过表达TAZ基因的方法证实TAZ能够影响人肝癌细胞株SMMC-7721的侵袭、迁移能力,为揭示原发性肝癌恶性转移的发病甚至启动机制提供一个崭新思路.     

过表达EB病毒潜伏期膜蛋白1(LMP1)的人B淋巴细胞株的建立

目的构建EB病毒潜伏期膜蛋白1(LMP1)基因的真核表达载体,通过电穿孔法转染人B淋巴瘤细胞株Ramos细胞,建立稳定的LMP1表达细胞株。方法扩增带有EcoRⅠ与BamHⅠ酶切位点的LMP1编码基因,克隆至pcDNA3.1-EF1a-mcs-3FLAG-CMV-EGFP真核表达载体,挑取阳性单克隆感受态细胞行PCR以及测序后将重组质粒通过电穿孔法转染Ramos细胞, G418筛选稳定表达LMP1的细胞株, PCR和Western blot法分别检测LMP1 mRNA和蛋白在Ramos细胞中的表达。结果 PCR与测序证实成功构建了LMP1重组质粒,建立了稳定转染的Ramos细胞,且LMP1蛋白可在细胞中成功表达。结论成功建立了稳定表达LMP1的Ramos细胞。     

小鼠BTLA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠BTLA慢病毒表达载体,并对表达产物进行鉴定.方法 以pET-28a-mBTLA质粒为模板,通过PCR技术构建pMD18-T-mBTLA质粒,将小鼠BTLA基因全长编码序列克隆到慢病毒转移载体,通过脂质体转染293T细胞包装成小鼠BTLA慢病毒颗粒.PCR技术和基因测序对重组质粒进行鉴定.荧光显微镜观察重组慢病毒感染293T细胞形态学变化.RT-PCR和Western blot法鉴定BTLA在重组慢病毒感染293T细胞中的表达.50％组织培养感染剂量法(TCID5o法)检测重组慢病毒滴度.结果 成功构建的pMD18-T-mBTLA质粒和pSL6-mBTLA质粒,经双酶切电泳后均出现大小约为1 kb的条带与mBTLA编码序列的大小相符.基因测序并比对分析进一步证实mBTLA编码序列成功整合到质粒载体.病毒上清PCR扩增和293T细胞形态学观察证实Lenti-mBTLA慢病毒包装成功.TCID50法测定Lenti-mBTLA慢病毒滴度为1.3×108 pfu/mL.RT-PCR和Western blot法证实Lenti-mBTLA慢病毒能有效表达mBTLA mRNA和蛋白质.结论 成功构建了表达小鼠BTLA的慢病毒.     

过表达配对相关同源框1( PRRX1) 通过调控Wnt / β-catenin 通路抑制肝癌细胞体内致瘤性

目的:研究慢病毒介导的配对相关同源框1(PRRX1)过表达对肝癌细胞体内致瘤性的影响及相关机制。方法:构建PRRX1过表达的慢病毒载体pLV-PRRX1-IRES2-EGFP,转染HEK293T细胞,获得慢病毒颗粒后,感染肝癌细胞株SMMC-7721,采用Western blot检测感染后细胞株中PRRX1蛋白表达。皮下注射SMMC-7721细胞(对照组、空载体组、PRRX1过表达组及PRRX1过表达+Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939干预组)构建裸鼠肝癌移植瘤模型,其中干预组使用XAV939处理,观察处理后移植瘤体积大小并绘制肿瘤生长曲线;采用HE染色观察各组移植瘤组织病变情况;采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测移植瘤中细胞凋亡情况;采用免疫组化检测移植瘤中细胞增殖相关抗原Ki-67的表达;采用Western blot检测移植瘤中PRRX1以及Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、c-Myc的表达。结果:成功构建PRRX1过表达的慢病毒载体并成功感染肝癌细胞株SMMC-7721,感染后细胞中PRRX1蛋白水平明显升高;与空载体组比较,PRRX1过表达组裸鼠移植瘤生长缓慢,组织坏死加重,细胞凋亡及PRRX1蛋白表达增加,而Ki-67、β-catenin及c-Myc蛋白表达均受到抑制;与PRRX1过表达组比较,XAV939干预进一步促进PRRX1过表达对裸鼠移植瘤的作用效果,但不改变PRRX1的表达。结论:过表达PRRX1能显著降低肝癌细胞体内致瘤能力,其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

人DRR1真核表达载体和稳定转染HEK293细胞株的建立及鉴定

目的:构建人DRR1基因的真核表达载体,通过转染HEK293细胞建立稳定的DRR1表达细胞株.方法:通过改造质粒pIRES,在其MCS1和MCS2中分别引入串联亲和纯化标签和绿色荧光蛋白基因,形成一个新的表达质粒pFSIG.将PCR扩增的DRRl1基因插入pFSIG中进行酶切和测序验证.用重组质粒pFSIG-DRR1转染HEK293细胞,通过G418和绿色荧光检测筛选DRR1稳定表达细胞株.通过Westernblot鉴定FS-DRR1蛋白的表达.结果:酶切、PCR和测序证实成功构建了pFSIG-DRR1表达质粒;建立了稳定转染的HEK293细胞系,Western blot检测证明重组DRR1在该细胞系中成功表达.结论:融合有串联亲和纯化标签的DRR1真核表达载体的构建和稳定表达细胞HEK293株的建立为在生理条件下研究DRR1的相互作用蛋白奠定了基础.     

过表达连接子蛋白40(Cx40)通过引起细胞周期阻滞抑制H9c2大鼠心肌细胞增殖

目的 建立过表达连接子蛋白40(Cx40)的H9c2心肌细胞稳定株，初步探讨慢病毒载体介导的Cx40蛋白过表达对H9c2细胞增殖的影响及其相关机制。方法 采用实时定量PCR从H9c2细胞株扩增Cx40基因片段，与慢病毒载体质粒pLVX-IRES-Puro连接，获得重组pLVX-Flag-Cx40表达载体。通过与包装质粒共转染人胚肾HEK293T细胞，获得携带Flag-Cx40的重组慢病毒颗粒。感染的H9c2细胞经嘌呤霉素(puromycin)筛选出稳定表达株(H9c2-Flag-Cx40细胞)。采用Western blot法检测Cx40蛋白表达情况；通过CCK-8法检测Cx40对H9c2细胞增殖的影响；流式细胞术检测细胞周期的变化；实时定量PCR检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的mRNA表达；Western blot法检测cyclin D1蛋白表达；免疫共沉淀(Co-IP)实验检测H9c2细胞Cx40和Yes相关蛋白(YAP)的相互结合情况；分离胞质、胞核蛋白，利用Western blot法检测Cx40对YAP细胞定位的影响。结果 测序结果显示成功构建重组pLVX-Flag-...     

小鼠抗人Shisa 样蛋白1(SSL1)多克隆抗体的制备和应用

目的制备抗Shisa样蛋白1(SSL1)的多克隆抗体,并探讨其在SMMC-7721肝癌细胞中的定位。方法通过反转录PCR从HepG2肝癌细胞中克隆人SSL1基因,将其插入到pET-28a中构建pET28a-SSL1原核表达载体,导入大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)诱导融合蛋白大量表达,通过Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白;然后,利用纯化的蛋白免疫雌性昆明小白鼠, Western blot法鉴定抗体特异性,免疫荧光细胞化学染色法观察SSL1在SMMC-7721亚细胞中的表达,并用高尔基体荧光探针Golgi-Tracker Red对高尔基复合体进行标记以明确SSL1在SMMC-7721亚细胞中的定位。结果成功扩增SSL1基因,构建重组原核表达质粒pET28a-SSL1,经诱导获得较高纯度的SSL1蛋白,制备了抗SSL1多克隆抗体。免疫荧光染色结果显示, SSL1主要在SMMC-7721细胞的细胞质中表达, Golgi-Tracker Red标记结果表明, SSL1主要定位于SMMC-7721细胞的高尔基体上。结论成功制备了有较高特异性的小鼠抗SSL1多克隆抗体,并确定SSL1定位于SMMC-7721细胞的高尔基体。     

小鼠IL-10重组慢病毒载体的构建和病毒包装

目的:构建小鼠IL-10重组慢病毒表达载体并进行包装,为进一步研究IL-10基因修饰树突细胞在哮喘免疫耐受中的作用提供实验基础。方法:小鼠IL-10基因片段经PCR扩增后,与酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,获得PGC-LV-IL-10重组慢病毒并转化细菌感受态细胞。克隆菌落行PCR鉴定,对阳性的重组质粒进行测序并转入293T细胞,荧光显微镜下观察GFP表达并行Western blot鉴定。将重组质粒与慢病毒包装系统一同转染293T细胞进行病毒包装,Real-time定量PCR法检测病毒滴度。结果:DNA测序结果及Western blot鉴定证实成功构建小鼠IL-10重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为2×108TU/ml。结论:成功构建并包装小鼠IL-10重组慢病毒表达载体。     

基于辛德毕斯病毒载体的重组丙肝病毒颗粒的制备与鉴定

目的 利用自主研发的辛德毕斯病毒载体构建含有丙型肝炎病毒( HCV)结构蛋白E1E2的重组病毒颗粒.方法 将编码HCV包膜糖蛋白的E1 E2基因克隆至辛德毕斯病毒载体,构建重组质粒pBR-XJE1E2和pVA-XJE1E2,转染BHK-21细胞后获得重组丙肝病毒颗粒.并通过RTPCR、间接免疫荧光和Western Blot方法鉴定表达E1E2蛋白的重组病毒颗粒.结果 酶切、PCR和测序分析表明重组质粒构建成功.RT-PCR、间接免疫荧光和Western-Blot鉴定结果表明重组质粒转染细胞后能包装出表达E1E2的丙肝病毒颗粒.结论 以辛德毕斯病毒载体为基础构建的重组质粒可在真核细胞中包装出重组丙肝病毒颗粒,这为进一步研究其在动物体内免疫反应奠定了基础.     

P53 shRNA对肝癌细胞增殖的影响

 目的 观察用RNA干扰（RNAi）下调SMMC-7721人肝癌细胞系P53表达后对细胞增殖及P21蛋白表达的影响。方法 设计合成P53基因的短发夹RNA（shRNA）,并构建pGPU6/GFP/Neo-P53 shRNA重组质粒。重组质粒转染SMMC-7721细胞,经G418抗性筛选获得阳性克隆。克隆形成实验观察细胞的增殖,RT-PCR法及Western blot法分别检测P53、P21的mRNA及蛋白表达。BALB/c裸鼠皮下注射SMMC-7721细胞,建立移植瘤模型,瘤部位多点注射pGPU6/GFP/Neo-P53 shRNA,观察瘤体积变化和瘤重。结果 P1、P2、P3三条P53 shRNA均可明显降低P53 mRNA水平（P<0.05, P<0.05, P<0.01）;干扰P53表达明显升高SMMC-7721细胞克隆形成率（P<0.05）,P21 mRNA和蛋白的表达均随着P53的沉默而显著降低（P<0.05）。P53 shRNA明显增加裸鼠移植瘤的体积和重量（P<0.05）。结论 shRNA干扰P53基因可抑制P53和P21蛋白表达,使癌细胞恶性增殖。     

NNMT真核表达载体的构建并转染SMMC7721肝癌细胞株

目的构建peDNA3．1（-）／NNMT（尼克酰胺-N-甲基化酶）真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法采用PCR法从PGEX4T-1／NNMT重组质粒中克隆得到NNMT cDNA全长序列,并将扩增的eDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（-）中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT—PCR检测转染前后该细胞株NNMT基因的mRNA表达水平。结果真核表达载体构建成功．经RT-PCR检测,重组质粒转染株的NNMT基因mRNA表达水平高于对照组,证实NNMT基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论成功建立了人基因NNMT的稳定转染细胞株,为进一步研究NNMT的功能奠定了基础。