不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的重组表达及免疫保护作用研究

目的 研究不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)重组外膜蛋白P6的理化性质和对小鼠的免疫保护作用.方法 利用PCR技术,以NTHi基因组为模板,扩增出编码外膜蛋白P6的基因片段;构建pET-32a-P16重组质粒;转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,并对表达条件进行了优化.通过阴离子交换和凝胶过滤层析对蛋白进行纯化.经SDS-PAGE、Western blot等对蛋白的理化性质进行初步分析,继而免疫BALB/c小鼠,用同源菌经腹腔攻击,比较免疫组和对照组小鼠死亡率.结果 实现了该蛋白在大肠杆菌中的高效表达,产物表达形式为可溶性表达,纯化后蛋白纯度可达95%,收率可达5 mg/g(蛋白/湿菌),相对分子质量(M_r)为14 145.848,Western blot证实重组P6蛋白能与菌源提纯P6蛋白免疫小鼠后的抗血清发生特异性反应.动物实验结果表明重组P6蛋白在小鼠体内能诱生高滴度的抗体,显示免疫组小鼠存活率明显高于对照组(P<0.01).结论 重组NTHi外膜蛋白P6的原核表达产物为可溶性蛋白,在小鼠体内能诱生高效价抗体,在小鼠感染模型中具有保护作用,为NTHi疫苗的研发提供了基础资料.     

抗人DAF单克隆抗体的制备及鉴定

以初步纯化的人红细胞膜ＤＡＦ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,取免疫小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合,成功地获得３株（ＤＧ３、ＤＧ９和ＤＡ１１）抗人ＤＡＦ单克隆抗体。经间接ＥＬＩＳＡ测定,３株杂交瘤细胞培养上清及腹水的抗体效价分别为１０－３～１０－４及１０－６～１０－７;３株单抗的重链为小鼠ＩｇＧ１亚类,轻链为κ型。结合还原条件下的免疫印迹实验及３株单抗对ＤＡＦ促衰变活性的抑制作用,推测ＤＧ９识别的抗原表位为ＳＣＲ１,而ＤＧ３和ＤＡ１１为ＳＣＲ２至ＳＣＲ４。     

层粘连蛋白特异性受体--整合素α6亚单位胞外区单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备针对整合素α6胞外区的单克隆抗体并鉴定其生物学特异性。方法：利用整合素α6 cDNA构建可表达整合素α6胞外区的原核表达载体，在大肠杆菌中表达GST－整合素α6胞外区融合蛋白。融合蛋白经凝胶分离纯化后免疫Balb/C小鼠，取其脾细胞，用传统杂交瘤技术与小鼠骨髓瘤细胞融合及次黄嘌呤，氨基喋呤与胸苷选择性培养。单克隆杂交瘤上清经ELISA双筛后，分析其亚类及进行免疫细胞化学鉴定。结果：经ELISA双筛，获得了一株能稳定分泌对整合素α6胞外区的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其分泌抗体亚类为IgG1。免疫细胞化学显示此单抗在人肝癌细胞系BEL－7402呈强阳性反应。结论：通过原核表达产物制备并纯化了针对整合素α6胞外区的单克隆抗体，对分离纯化α6亚单位、研究其生物学作用及鉴定正常和疾病状态下是否表达整合素α6及其水平具有重要意义。     

抗Periostin单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗Periostin单克隆抗体并鉴定其免疫学性能,为后期临床应用奠定基础。方法:表达并纯化Periostin的GST融合蛋白,经过免疫小鼠、细胞融合及亚克隆筛选,制备效价良好的高亲和力单克隆抗体,并用免疫组化实验鉴定其免疫学性能。结果:获得6株杂交瘤细胞株,均能稳定分泌高亲和力抗体,经酶联免疫吸附测定、Western blot和免疫组化实验证实均能特异性识别人的Periostin,显微镜下观察发现Periostin在结直肠癌、乳腺癌等肿瘤患者的组织切片中表达水平显著高于健康人。结论:成功制备了高亲和力、特异性强的抗人Periostin单克隆抗体,为小分子抗体以及抗体人源化制备奠定了基础,进而为治疗人体内组织器官纤维化提供理论依据。     

抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗抗CD3 ScFv单克隆抗体并研究其生物活性.方法：分离纯化后的抗CD3 ScFv蛋白免疫BALB/c小鼠,采用传统杂交瘤技术制备抗抗CD3 ScFv单克隆抗体;采用ELISA和Western blot鉴定其亚类和抗原结合特异性;采用FACS测定抗抗CD3 ScFv单克隆抗体对Jurkat细胞特异活性.结果：成功筛选出一株能稳定分泌抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的杂交瘤细胞株（10B7）,其分泌的抗体亚类为IgG1.该抗抗CD3 ScFv单克隆抗体直标后可特异性结合抗CD3 ScFv蛋白和抗CD3抗体.结论：文中所研制的抗抗CD3 ScFv单克隆抗体具有与抗CD3抗体、抗CD3 ScFv蛋白特异结合的活性,在肿瘤导向治疗中抗CD3/抗肿瘤双特异抗体的亲和层析纯化、药代动力学监测等方面具有广泛的应用前景.     

抗人活化B淋巴细胞单克隆抗体制备及鉴定

自儿童手术摘除的新鲜扁桃体分离人Ｂ淋巴细胞，经ＰＭＡ（佛波醇）激活后得到人活化Ｂ淋巴细胞，用于免疫ＢＡＢＬ／Ｃ小鼠后，取免疫小鼠之脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，融合后细胞于含ＨＡＴ－ＩＭＤＭ完全培养基的２％甲基纤维素半固体培养基选择生长，经细胞酶联免疫吸附（ＣＥＬＩＳＡ）筛选间接免疫荧光流式细胞仪鉴定，获培养上清对活化Ｂ细胞及３Ｄ５细胞株细胞反应阳性，而Ｊｕｒｋａｔ细胞株细胞反应阴必的杂交     

抗多菌灵单克隆抗体的制备、纯化及初步鉴定

目的:制备抗多菌灵小鼠单克隆抗体(mAb),并初步鉴定其特性,为快速检测蘑菇、干菇类中残留的多菌灵提供基础。方法:将小分子的多菌灵交联在大分子载体匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)上,KLH交联物用于免疫BALB/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,通过融合,筛选制备抗多菌灵mAb,并通过ELISA方法测定抗体亲和力,检测mAb的交叉反应,及初步竞争抑制检测。结果:通过ELISA筛选出7株稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,其亚型均为IgG1。与同属于苯并咪唑类杀菌剂的苯菌灵和甲基硫菌灵没有交叉反应。竞争抑制检测结果显示MC-3细胞株竞争效果较好。结论:获得1株高特异性、高亲和力、能稳定分泌抗多菌灵抗体的杂交瘤细胞株,为进一步研发多菌灵残留免疫检测技术和产品奠定基础。     

抗GRP78单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:原核表达GRP78并制备抗GRP78的特异性单克隆抗体(mAb),并初步鉴定相应mAb的特性。方法:从肺癌患者组织中抽提总RNA,RT-PCR获得grp78全长基因,并通过原核重组表达GRP78蛋白;以纯化的GRP78蛋白免疫BALB/c小鼠,成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合,筛选得到分泌特异性抗GRP78的mAb的杂交瘤细胞株;并通过Western blot及免疫组化初步鉴定其特异性。结果:成功构建重组表达质粒PET-28a-grp78并由大肠杆菌表达获得GRP78蛋白,被该蛋白免疫的BALB/c小鼠与Sp2/0细胞融合、筛选,获得3株稳定分泌抗GRP78抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2A1、4B8和4A12。采用其中1株4A12 mAb对3个肺癌患者组织样本进行Western blot检测以及免疫组化分析,结果均显示4A12 mAb能够特异识别肺癌组织表达的GRP78。结论:成功制备了抗GRP78的mAb,并能够特异识别肺癌组织表达的GRP78,为进一步研究GRP78在肿瘤治疗中的作用提供基础。     

抗HSPC238单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的制备抗HSPC238的单克隆抗体，为HSPC238的功能研究奠定基础。方法以纯化的重组蛋白HSPC238为抗原，免疫BALB／c小鼠，运用杂交瘤技术制备HSPC238单克隆抗体，并用间接ELISA法和Western—blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果成功建立两株稳定分泌抗HSPC238的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为E001和E002。ELISA检测抗HSPC238单克隆抗体的腹水效价为1：12800和1：25600。两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。通过Western—blot实验证实，两株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性HSPC238蛋白。结论成功制备了两株效价高、特异性好的抗HSPC238单克隆抗体，制备的抗HSPC238单克隆抗体可用于HSPC238蛋白的鉴定，为HSPC238蛋白的生物学功能研究奠定了基础。     

鼠抗人c-Kit单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:鼠抗人c-Kit单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定.方法:利用PCR技术获得人c-Kit的胞外免疫球蛋白区编码序列, 并将其亚克隆至原核表达载体pQE30, 构建出重组表达质粒pQE30-hKitD4-5.测序鉴定正确后转化M15, 经IPTG37℃诱导4 h后, SDS-PAGE显示融合蛋白(表达产物)以包涵体形式存在.用镍柱对融合蛋白进行纯化, 将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合, 经流式细胞术(FCM)分析和多次克隆化培养, 筛选出特异分泌鼠抗人c-Kit分子mAb的杂交瘤细胞株.采用Western blot、 Ig亚型快速定性试纸法、 FCM等对mAb的生物学特性进行鉴定.结果:成功表达及纯化了人c-Kit重组蛋白, 并获得1株持续、稳定分泌鼠抗人c-Kit mAb的杂交瘤细胞株, 命名为SRJ1.ELISA和Western blot、 FCM结果显示了该株mAb 能够识别Kasumi白血病细胞株表面表达的天然的c-Kit分子, 并与人正常外周血细胞无交叉反应.值得注意的是, Kasumi细胞含有一个不被SRJ1识别的亚群, 虽然其表达c-Kit(Ab81 mAb的结合正常).结论:成功构建了原核表达载体pQE30-Kit4-5, 并获得高纯度的人pQE30-Kit4-5重组蛋白;成功制备了1株特异性的鼠抗人c-Kit mAb杂交瘤.其所分泌的抗体能特异地识别人c-Kit分子, 并且可能成为区分细胞表面表达不同c-Kit分子的潜在检测工具.     

抗人重组SCF单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定

本研究利用ＰＥＸ３１Ｂ作为载体，在大肠杆菌表达出重组人ＳＣＦ融合蛋白。用该蛋白作为抗原，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过鼠－鼠杂交瘤技术，成功地获得４株分泌抗人重组ＷＳＣＦ单克隆抗体的杂交瘤细胞系。经检测，它们所分泌的抗体亚类均为ＩｇＧ１，免疫印迹试验和抗体特异性鉴定证实，４株单抗均能特异性地识别可溶性ＳＣＦ。抗ＳＣＦ单抗杂交瘤细胞系的建立，为深入研究ＳＣＦ的生物学特性、功能以及ＳＣＦ产品的纯化，提供了     

抗人心肌肌凝蛋白轻链单克隆抗体的制备和鉴定

从人心脏中提取心肌肌凝蛋白轻链（ＣＭＬＣ１），免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与Ｓｐ２／０骨髓瘤细胞做常规融合，获得了２２株分泌抗ＣＭＬＣ１单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经对其中某些株作ＩｇＧ分型、核型、腹水效价、表位和亲和常数测定，表明所获单克隆抗体的质量良好，为建立分析轻链的方法奠定了基础。     

抗人P185~(erbB_2)单克隆抗体的制备及特性分析

目的制备可特异识别 P185 erb B2 胞外区的单抗 ,选出亲和力较高并具有抑瘤作用的克隆。方法以高表达 erb B2 的人乳腺癌细胞系 SKBR3免疫 BABL / c小鼠 ,用纯化的重组 DNA表达的 P185胞外区蛋白作为抗原 ,以间接 EL ISA方法筛选阳性克隆。结果获得 10株稳定分泌抗 P185胞外区单抗的杂交瘤细胞株。 4株为 Ig G1、1株为 Ig G3、5株为 Ig M,分别可识别 P185胞外区 3个不同表位 ,且只与天然形式的 P185胞外区特异结合。其中 4株 Ig G1类抗体可明显抑制 SKBR3及 SKOV3细胞增殖。免疫组化实验可使 SKBR3及 SKOV3细胞膜特异性染色 ,且可检出乳腺癌、卵巢癌等石蜡切片标本中 erb B2 高表达的阳性细胞。结论所获单抗可特异识别 P185胞外区抗原 ,具有肿瘤诊断、判断预后及人源化改造后用于治疗的应用潜力。     

抗Doppel蛋白(叠朊蛋白)单克隆抗体细胞系的建立及其初步鉴定

鼠Ｄｏｐｐｅｌ蛋白（叠朊蛋白）是一种新发现的朊蛋白样糖蛋白（ＰｒＰ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ），糖基化前的分子质量（Ｍｒ）约为１５　０００，在幼年动物的小脑与成年动物的睾丸和心脏有高水平的表达，其编码基因（Ｐｒｎｄ）位于相应朊蛋白基因（Ｐｒｎｐ）下游１６　ｋｂ处（人的则在下游２７　ｋｂ处），与Ｐｒｎｐ编码蛋白ＰｒＰ的Ｃ端２／３序列有２４％的同源性，共编码１７９个氨基酸［１］，含２个糖基化位点，并由糖基磷脂酰肌醇（ＧＰＩ）锚定于细胞膜表面［２］。虽然Ｄｏｐｐｅｌ蛋白的功能目前尚不十分清楚，但已…     

抗乳腺癌单克隆抗体MG_2的制备及其鉴定

用人乳腺癌组织及腋窝淋巴结转移癌单细胞悬液对BALB/c小鼠进行初次免疫,3周后改用人乳腺癌组织提取的抗原再次免疫。末次免疫后3d取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP 2/0进行融合,,经筛选及克隆化培养,建立了1株分泌抗人乳腺癌单克隆抗体MG_2。免疫组化染色表明MG_2与乳腺癌产生强阳性反应,而乳腺纤维腺瘤、良性增生及非乳腺来源肿瘤以及正常组织则为阴性或弱阳性着染。初步证明单抗MG_2对乳腺癌具有一定的特异性与敏感性,因而可为乳腺癌的放免显像及免疫导向治疗提供一个新的较理想的载体。     

抗阿莫西林单克隆抗体的制备、纯化与鉴定

目的: 制备抗阿莫西林小鼠单克隆抗体(mAb),并初步鉴定其特性,为快速检测动物原性食品中残留的阿莫西林提供基础.方法: 将小分子的阿莫西林交联在大分子载体牛血清白蛋白(BSA)和匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)上,KLH交联物用于免疫BALB/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,通过融合,筛选制备抗阿莫西林mAb,并通过ELISA方法测定抗体亲和力,检测单抗与氨苄西林和头孢唑啉的交叉反应.结果: 通过ELISA筛选出5株可以稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,其亚型4株为IgG1/κ,1株为IgG2a/κ.亲和力在2.1×109~4.7×109.这5株mAb与氨苄西林的交叉反应为100%,与头孢唑啉没有交叉反应.结论: 获得5株特异性好、亲和力高、能稳定分泌抗阿莫西林抗体的杂交瘤细胞株,同时因为与氨苄西林的交叉反应为100%,这使得进一步研发动物源性食品中阿莫西林和氨苄西林残留的免疫检测技术和产品成为可能.     

抗硝基酪氨酸单克隆抗体的制备与鉴定

硝基酪氨酸 (nitrotyrosine ,NT)为活性氮 (reactivenitrogenspecies,RNS)对蛋白酪氨酸残基氧化修饰的产物 ,是体内RNS形成的重要生物标记物[1,2 ] 。目前 ,NT的检测主要采用HPLC、HPLC EC及GC MS等方法 ,需要大型仪器和专业人员操作 ,并需进行样品的预处理 ,费时费力 ;而且样品的处理过程还会人为地产生NT ,影响检测结果的准确性[3 ,4] 。免疫学技术为检测NT开辟了一条新的途径 ,将NT与载体蛋白的连接物作为免疫原 ,制备针对NT的mAb ,然后用于ELISA、Westernblot、免疫组化染色和免疫电镜研究。用ELISA法定量测定NT时 ,…     

抗人肝癌单克隆抗体HL2的制备及鉴定

用肝癌细胞株QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721以贯序法免疫BALB/c小鼠,获得一株分泌肝癌单抗的杂交窟株HL_2,其染色体数目为97—105。单抗HL_2系IgG_2b亚类。吸收实验及阻断实验证明HL_2抗原与CEA、AFP、HBsAg、HBcAg及HBeAg无免疫同源性。ABC法和ELISA法说明单抗HL_2与四株肝癌细胞、六例肝癌组织均呈明确阳性反应,除与SGC-7901、H_(128)、K_(562)、Hela细胞株及部分胚胎肝脏,胚胎结肠有较弱性反应外,与肝癌旁组织、正常肝脏、其它肿瘤组织和细胞株、二种正常人细胞及其它胚胎组织无反应。显示了单抗HL_2的特异性较好、阳性率较高,是一个有应用前景的单抗。     

抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗人绒毛膜促性腺激素(HCG)的单克隆抗体(mAb).方法:利用从人工流产刮宫物中提取的HCG免疫BALB/c小鼠, 取其脾细胞同NS-1小鼠骨髓瘤细胞融合, 采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞株, 并对mAb的亚型、亲和力及特异性进行鉴定.结果:共获得26株能稳定分泌抗HCG特异性mAb的杂交瘤细胞株.mAb的亚类均为IgG1, 亲和力介于1.14×108～2.0×108 mol/L之间, 其中4株mAb与HCG的β亚基有较强的反应, 而与黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)均无交叉反应.结论:成功获得4株鼠抗人HCG mAb的杂交瘤细胞株, 其分泌的mAb能特异识别人HCG的β亚基, 可用于早孕、肿瘤等诊断的进一步研究.