结核分枝杆菌Rv0901基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其细胞作用

目的对结核分枝杆菌Rv0901基因的功能进行研究。方法以PCR扩增Rv0901基因编码序列,定向克隆人穿梭表达质粒pMV261获得重组穿梭表达质粒,将重组质粒电穿孔进入耻垢分枝杆菌,构建重组Rv0901基因的耻垢分枝杆菌,对重组耻垢分枝杆菌进行诱导表达,用SDS-PAGE检测表达结果。比较耻垢分枝杆菌和重组耻垢分枝杆菌对THP-1细胞的不同作用。结果成功构建重组穿梭表达质粒及重组Rv0901基因的耻垢分枝杆菌,重组菌诱导THP-1细胞的凋亡率高于耻垢分枝杆菌,其感染THP-1细胞后细胞的存活率低于耻垢分枝杆菌的感染,重组菌感染THP-1细胞后细胞培养液中NO(一氧化氮)的产生高于耻垢分枝杆菌的感染。结论Rv0901基因可能与结核毒力存在一定关系。     

结核分枝杆菌肝素结合血凝素在结核病免疫应答中的研究

目的 探讨结核分枝杆菌肝素结合血凝素(HBHA)的免疫应答作用及其在结核病诊断中的应用价值.方法 选取PPD(-)健康对照、PPD(+)潜伏感染者、肺结核患者,分离外周血单个核细胞,用大然HBHA刺激,培养4 d后收集细胞培养上清,ELISA方法检测上清中的IFN-γ.同时用ELISA方法检测各组血清中的HBHA特异的ISG型抗体.结果 HBHA刺激后3组产生的lFN-γ中位数分别为49.5 PS/ml、781.9 pg/ml、341.8 pg/ml,潜伏感染者产生的IFN-γ水平远高于健康对照,略高于肺结核患者.三组血清抗HBHA的IgG抗体浓度吸光度(A)的均值分别为0.212±0.066、0.224±0.076和0.285±0.078.肺结核患者的HBHA特异的IgG抗体远高于健康对照及潜伏感染者.结论 HBHA有较好的免疫原性,可以刺激潜伏感染者产生高水平的IFN-γ,HBHA特异的IFN-γ释放反应有利于鉴别潜伏感染者.HBHA的抗体水平在结核病的诊断中有一定的辅助应用价值.     

重组耻垢分枝杆菌制剂预防幽门螺杆菌感染的作用机理的初步探讨

目的探讨重组耻垢分枝杆菌实验制剂（recombinant Mycobacterium smegmatis，rMs）预防幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染的作用机理。方法实验制剂免疫BLAB／c小鼠4周，用Hp攻击后4周，取血清、胃、脾组织，RT-PCR检测小鼠胃黏膜和脾组织的TH1型细胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-12）与TH2型细胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）；用ELISA检测针对唧的特异性血清IgG、IgG1、IgG2a和IgA水平；用免疫组化方法检测胃黏膜固有层IgA表达；用MTT检测脾淋巴细胞增殖。结果免疫后BALB／c小鼠特异性抗体显示rMs制剂诱导Hp特异性血清IgG、IgA水平都升高，以IgG2a占优势。用Hp抗原刺激后各免疫组小鼠脾淋巴细胞均有明显增殖。免疫组化显示各免疫组小鼠胃黏膜固有层IgA阳性标记腺体数明显高于对照组。RT-PCR证实，跏攻击之前，各免疫组胃和脾组织已出现了IFN-γ、IL-12、IL-2表达而无IL-4、IL-6、IL-10表达。PBS对照组和单纯耻垢分枝杆菌（Ms）组胃黏膜和脾组织各细胞因子均无表达；Hp攻击后，PBS和单纯Ms组胃组织出现以TH1细胞IFN-γ为主的增生，IFN-γ水平显著高于rMs组（P〈0．05）；而3个rMs制剂组脾脏则出现以TH2细胞（IL-4）为主的增生，IL-4水平显著高于对照组（P〈0．05）。提示该制剂的作用机制是诱导TH1，TH2平衡型免疫应答。结论成功地建立了BALB／c小鼠的Hp感染模型，对rMs制荆的免疫保护机理研究结果显示，rMs能产生以TH1细胞和TH2细胞协同作用的保护性免疫应答。     

表达绿色荧光蛋白的重组耻垢分枝杆菌的构建

目的 建立可表达绿色荧光蛋白的耻垢分枝杆菌,便于对耻垢分枝杆菌进行直观检测和快速定量.方法 利用PCR技术从真核表达质粒pLVTH扩增获得绿色荧光蛋白的编码基因,克隆入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,建立重组质粒pMVGFP,并经酶切鉴定证实.利用电穿孔技术将pMVGFP转化入耻垢分枝杆菌,利用卡那霉素抗性筛...     

结核分枝杆菌肝素结合血凝素在结核病免疫应答中的研究

Objective To investigate the immune protection of heparin-hinding hemagglutinin ad-hesin(HBHA) and to estimate its potential diagnostic value. Methods Native HBHA were used to stimu-late peripheral blood mononuelear cells (PBMCs) from different infected-cases including PPD negative healthy control, PPD positive latent tuberculosis(LTB) infection, pulmonary tuberculosis, and the IFN-γ/in the supernatant of culture was detected. Meanwhile, HBHA specific IgG antibody in the sera was detected by ELISA. Results The middle level of HBHA specific IFN-γ of the three groups were 49.5 pg/ml, 781.9 pg/ml and 341.8 pg/ml, respectively. IFN-γ of latent tuberculosis group was much higher than that of the control, and slightly higher than that of the patients with pulmonary tuberculosis. And the absorbency of the IgG antibody to HBHA in the three groups was 0.212±0.066, 0.224 ± 0.076 and 0.285±0.078. lgG an-tibody in the patients with pulmonary tuberculosis is higher than that of the healthy, including the control and the latent tuberculosis infection. Conclusion HBHA has good immunogenieity, and it can stimulate the LTB to release high level IFN-γ, suggests that the LTB doesn't develop active tuberculosis may rely on its protection. HBHA specific. IFN-γ release may identify 1,333 from the healthy. Anti-HBHA antibody plays an auxiliary role in the diagnosis of pulmonary tuberculosis.     

GLS和IL-12偶联重组耻垢分枝杆菌免疫效果的观察

目的：研究携带编码人天然颗粒溶素（GLS）和小鼠IL-12基因质粒（pZM03）偶联重组耻垢分枝杆菌（ATCC607）经鼻黏膜免疫小鼠后,小鼠体内的免疫状况.方法：BALB/c小鼠36只,随机分为生理盐水、pZM03、ATCC607、卡介苗（BCG）、重组ATCC607（即携带pZM03的ATCC607）、灭活重组ATCC607组;采用滴鼻法免疫小鼠,BCG组0、14天各1次,其它组0、4、14天各1次,第0天免疫后4周处死小鼠,用ELISA检测血清中IFN-γ、IL-12、IgG2a、lL-4的分泌水平和淋巴细胞PPD诱导的IFN-γ分泌水平以及肺泡灌洗液特异性SIgA的水平,用MTS法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况.结果：重组ATCC607血清中IFN-γ、IL-12水平与BCG组无明显差异但明显高于其他组（P＜0.05）,IgG2a水平重组ATCC607组高于BCG组和其他组（P＜0.05）,各组间IL-4水平差异无统计学意义.重组ATCC607、BCG、灭活重组ATCC607及ATCC607组用PPD均可诱导小鼠脾淋巴细胞增殖,各组间差异无显著意义,但与生理盐水和pZM03组间差异有显著意义（P＜0.05）.重组ATCC607组PPD诱导淋巴细胞IFN-γ明显高于其它组（P＜0.05）,与BCG组比较无显著差异.重组ATCC607等含菌组经鼻黏膜免疫可产生黏膜特异性SIgA.结论：重组ATCC607经鼻黏膜免疫小鼠后,机体特异性免疫特别是细胞免疫和黏膜免疫增强,为重组ATCC607治疗结核病的研究奠定了基础.     

重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病免疫治疗效果的评价

目的 评估携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染的治疗效果,及其与临床抗痨药物疗效的比较.方法 结核分枝杆菌H37Rv感染Balb/c小鼠4周后分别用生理盐水、GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌(重组M.S)、INH PZA和重组M.S INH PZA治疗,于第1次治疗后3个月,处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和INF-α的分泌水平、血清IL-12和IFN-γ分泌水平、肺泡灌洗液SIgA的水平和肺、脾组织中GLS表达,同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况.结果 重组M.s、INH PZA和重组M.s INH PZA治疗组肺、脾组织荷菌量(log CFU/g)比生理盐水组显著降低.重组M.s组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于其它组.重组M.s组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于其它组.各组产生黏膜特异性SIgA明显高于未经感染组.用免疫组化检测到小鼠肺及脾组织中GKS的表达.生理盐水组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛,正常肺泡结构被破坏;其余组肺组织病变轻且局限.结论 重组M.s对小鼠结核病有一定免疫治疗作用,通过增强宿主Th1型免疫应答和GLS的抗菌活性有关;重组M.S对临床常用的抗结核药有协同作用,为结核病的综合治疗打下实验基础.     

表达绿色荧光蛋白的重组耻垢分枝杆菌感染THP-1巨噬细胞模型的建立

目的 建立表达绿色荧光蛋白(GFP)的耻垢分枝杆菌感染THP-1巨噬细胞模型,对耻垢分枝杆菌进行快速定位和直观检测,为探究结核发病机制以及研制新型结核疫苗提供一种示踪工具。方法 以pEGFP-N1质粒为模板采用PCR扩增出增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列,获得EGFP的编码基因,将扩增产物克隆到载体pALACE上,建立重组质粒pALACE-EGFP。利用电穿孔技术将pALACE-EGFP转化到耻垢分枝杆菌中,通过潮霉素抗性筛选重组耻垢分枝杆菌克隆,扩大培养后涂片观察,并进行荧光显微镜镜检。再用重组耻垢分枝杆菌感染THP-1巨噬细胞,观察是否有GFP表达。结果 正确构建重组质粒pALACE-EGFP;荧光显微镜下观察重组耻垢分枝杆菌,证实EGFP在重组耻垢分枝杆菌中表达,并且THP-1巨噬细胞被感染后发出绿色荧光。结论 表达EGFP蛋白的重组耻垢分枝杆菌的成功建立,为结核分枝杆菌的感染和致病机制研究奠定基础。     

重组耻垢分枝杆菌Ag85B-ESAT6-rMs对小鼠巨噬细胞功能的影响

目的:探讨重组耻垢分枝杆菌Ag85B-ESAT6-rMs对小鼠巨噬细胞功能的影响。方法:将耻垢分枝杆菌(Ms)与重组耻垢分枝杆菌Ag85B-ESAT6-rMs分别感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,通过抗酸染色和细胞内细菌菌落形成单位计数评价Ms和Ag85B-ESAT6-rMs被巨噬细胞吞噬和消化能力;采用流式细胞术检测巨噬细胞凋亡情况;分别采用实时定量PCR技术和ELISA检测细胞因子TNF-α的表达和分泌水平。结果:小鼠巨噬细胞实验证实,Ag85B-ESAT6-rMs比Ms具有更强的感染和促进巨噬细胞的吞噬能力,Ag85B-ESAT6-rMs可增加巨噬细胞表达和分泌TNF-α的水平,并促进受感染巨噬细胞的凋亡。结论:Ag85B-ESAT6-rMs可以促进巨噬细胞的吞噬消化功能,将有助于增强巨噬细胞对Ms抗原的递呈和机体抗Ms感染的特异性免疫。     

结核分枝杆菌EIS基因抑制人肺腺癌A549细胞自噬

 目的 构建结核分枝杆菌EIS基因表达质粒,探讨其对人肺腺癌A549细胞自噬的影响。方法 采用PCR技术扩增EIS基因片段并插入空载质粒pcDNA3.1-3flag中,双酶切、测序鉴定克隆质粒的正确性;将重组质粒与对照空载质粒分别与自噬体荧光表达质粒GFP-LC3共转染细胞并以自噬诱导剂雷帕霉素处理,荧光显微镜下观察自噬荧光并计数,Western blot检测EIS蛋白及自噬蛋白LC3II/I的表达水平。结果 成功构建EIS基因重组表达质粒PcDNA3.1-EIS-3flag,该质粒共转染细胞组自噬荧光小点较对照组明显减少（P<0.05）,重组质粒表达42ku看到蛋白并可抑制自噬蛋白表达水平。结论 结核分枝杆菌EIS基因可抑制A549细胞自噬的形成,其抑制作用与结核分枝杆菌持留性相关。     

巨噬细胞的自噬及其在抗结核分枝杆菌感染中的作用

白噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的自降解途径,可通过降解长寿蛋白和受损细胞器维持细胞内的平衡。近年来的研究发现,巨噬细胞的自噬还是固有免疫和适应性免疫的重要组成部分,可参与胞内感染病原体的清除。目前已发现有多种途径参与自噬的诱导和调节。在感染的巨噬细胞内,诱导自噬的发生能促进吞噬体和溶酶体的融合,抑制胞内结核分枝杆菌（Mtb）的存活。但同时Mtb也可通过某些机制抑制巨噬细胞自噬的发生以逃避巨噬细胞的杀伤,进而长期持留于巨噬细胞内。深入了解巨噬细胞自噬与胞内Mtb相互作用的机制,有助于人类更好的预防和控制结核病。     

GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌的构建及其在小鼠体内的表达

目的 构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌,并经鼻黏膜免疫观察其在小鼠体内的表达.方法 将人GLS和小鼠IL-12基因及分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到穿梭质粒pZM03,以pZM03电转化耻垢分枝杆菌,再将该重组耻垢分枝杆菌滴鼻免疫Balb/c小鼠3次,第1次免疫后4周,处死小鼠,用免疫组化检测肺、脾组织中GLS表达,用ELISA检测血清IL-12和肺泡灌洗液特异性SIgA的水平.结果 得到可表达GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌;在Balb/c小鼠肺、脾组织中均检测到重组耻垢分枝杆菌的分布,以及GLS的表达,并有血清IL-12水平升高和黏膜特异性SIgA的产生.结论 成功构建GLS和IL-12修饰的重组耻垢分枝杆菌,该重组菌经鼻黏膜免疫小鼠后,可引起呼吸道黏膜特异性抗菌免疫,以及GLS和IL-12的体内表达,为新型疫苗的研究奠定了基础.     

巨噬细胞的自噬及其在抗结核分枝杆菌感染中的作用

自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的自降解途径,可通过降解长寿蛋白和受损细胞器维持细胞内的平衡.近年来的研究发现,巨噬细胞的自噬还是固有免疫和适应性免疫的重要组成部分,可参与胞内感染病原体的清除.目前已发现有多种途径参与自噬的诱导和调节.在感染的巨噬细胞内,诱导自噬的发生能促进吞噬体和溶酶体的融合,抑制胞内结核分枝杆菌(Mtb)的存活.但同时Mtb也可通过某些机制抑制巨噬细胞自噬的发生以逃避巨噬细胞的杀伤,进而长期持留于巨噬细胞内.深入了解巨噬细胞自噬与胞内Mtb相互作用的机制,有助于人类更好的预防和控制结核病.     

耻垢分枝杆菌glmU基因克隆、表达及多克隆抗体的制备

目的:制备抗耻垢分枝杆菌(Smeg)GlmU的多克隆抗体,并对其特异性进行鉴定.方法:用PCR技术扩增SmegglmU,构建可在大肠杆菌中表达的重组质粒pET29b-SmegglmU,用IPTG诱导表达,经Ni-NTA-Agarose柱层析纯化后,以其为免疫原制备抗Smeg GlmU的多克隆抗体,并以间接ELISA方法测定抗体效价,以Western blot方法鉴定抗体的特异性.结果:在大肠杆菌中得到了可溶性表达的Smeg GlmU;以其免疫小鼠获得抗血清,Western blot鉴定显示获得了能特异性地作用于耻垢分枝杆菌GlmU的多克隆抗体,ELISA测定表明其效价高于1:6 400.结论:获得了能特异性地作用于耻垢分枝杆菌GlmU的高效价多克隆抗体,为应用反义RNA技术研究glmU基因的功能奠定了基础.     

抑制自噬增强MCF-7乳腺癌细胞对依托泊苷的敏感性

目的探讨自噬抑制剂(Baf)在乳腺癌MCF-7细胞对依托泊苷(VP-16)的药物敏感性的影响。方法实验分为对照组(NC)、Baf组、VP-16和VP-16+Baf组。用MTT法检测细胞生存活力、GFP-LC3质粒转染后荧光显微镜检测绿色荧光的分布、Western blot检测蛋白表达和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 15μmol/L的VP-16使细胞活力降低,而在收集细胞前12 h时加入10 nmol/L的Baf进一步降低了细胞活力(P0.01);VP-16明显增加MCF-7细胞的LC3Ⅱ的表达和GFP-LC3绿色荧光斑点的聚集,而减少了P62的蛋白表达;与VP-16组比较,VP-16+Baf组细胞P62的蛋白表达增多,凋亡蛋白cleaved-PARP的表达和细胞凋亡比例也明显增多(P0.01)。结论 VP-16抑制乳腺癌细胞增殖的过程中诱导了保护性自噬,抑制自噬促进了凋亡性死亡,可以增加癌细胞对VP-16的敏感性。     

通过抑制自噬作用增强声动力学疗法诱导的肿瘤细胞凋亡研究

探讨声动力疗法诱导S180细胞凋亡过程中自噬现象的发生及其在细胞凋亡中的作用。用频率为1.1 MHz、功率为3 W/cm²的超声,结合1 μg/mL原卟啉Ⅸ作用于S180细胞,MTT检测细胞存活率;DAPI染色检测凋亡细胞核形态变化;Rhodamine 123 染色检测线粒体膜电位;Western blotting检测自噬标记分子LC3由Ⅰ型向Ⅱ型的转化;吖啶橙（AO）活细胞染色观察自噬小体。声动力处理后,S180细胞明显受损,MTT显示存活率为59.3%并且出现了典型的凋亡形态学特征,线粒体膜电位下降至MFI=971.28,LC3-II表达明显升高;利用自噬和凋亡的抑制剂实验结果提示自噬体的形成（1 h）早于细胞凋亡的发生 (8 h),自噬抑制剂3-MA和Ba A1增强了SDT对线粒体膜电位的破坏,DAPI染色进一步证实了自噬抑制剂有利于促进SDT诱导的S180细胞凋亡。提示自噬参与了SDT诱导的S180细胞死亡,自噬特异性药物抑制剂增强了SDT诱导的细胞凋亡。     

自噬在结核分枝杆菌感染中的作用及相关基因的表达

目的:探讨自噬在结核分枝杆菌(MTB)感染中的作用及相关基因的表达.方法:透射电镜观察在雷帕霉素诱导下自噬体的形成,通过克隆形成单位(CFU)检测自噬形成后对胞内感染的MTB H37Rv菌株的清除作用,以实时定量PCR方法检测自噬相关基因atg5、atS7、atg8、atg12 mRNA表达水平.结果:在宙帕霉素诱导下,RAW264.7细胞可形成自噬体,自噬体产牛后对胞内感染的H37Rv菌株具有一定的清除作用.在MTB感染过程中参与自噬形成的atg5、atg8、atg12 mRNA表达量上调,而atg7表达量无变化.结论:自噬参与抗MTB免疫应答过程,而ats5、atg8、atg12是MTB感染形成自噬体的重要调控分子.     

二甲基亚砜通过激活caspase-3以及抑制PARP-1引起A549细胞凋亡

目的 检测肺上皮癌细胞（A549）细胞经二甲基亚砜（DMSO）诱导发生凋亡后聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶（PARP-1）的活性是否受到抑制。方法 通过MTT法检测caspase-3的活性升高以及TUNEL等方法验证二甲基亚砜可引起A549细胞凋亡后,采用western blotting 验证PARP-1是否被切割成俩个片段。结果 DMSO可诱导A549细胞发生凋亡,凋亡过程中caspase-3的活性上调,其下游底物PARP-1大量被切割成小片段。结论 DMSO诱导的A549细胞凋亡受到caspase-3-PARP-1信号分子的调节。     

抑制c-FLIP_L表达增强rhTRAIL蛋白杀伤肺癌A549细胞的研究

目的:探讨抑制c-FLIPL表达增强rhTRAIL蛋白杀伤肺癌A549细胞株的可行性。方法:构建c-FLIPL序列特异性siRNAs表达载体并转染A549细胞抑制c-FLIPL基因表达,化学抑制剂他莫昔芬抑制c-FLIPL蛋白表达。RT-PCR和Western blot法检测c-FLIPL的mRNA和蛋白表达的变化。Western blot法检测caspase-8的活化情况。流式细胞仪检测A549细胞凋亡率,MTT法检测联合应用RNAi+rhTRAIL和他莫昔芬+rhTRAIL对A549细胞的杀伤活性。结果:特异性siRNA片段能显著降低A549细胞中c-FLIPL的mRNA水平和蛋白水平。他莫昔芬可以显著抑制c-FLIPL蛋白的表达。两者均可以实现caspase-8的活化,并促进rhTRAIL对A549细胞诱导凋亡作用,凋亡率从2.52%提高到64.5%和59.2%(P<0.05),他莫昔芬和siRNA均可显著促进rhTRAIL蛋白对A549细胞的增殖抑制作用,抑制率分别提高到73.2%和69.5%(P<0.05)。结论:靶向抑制FLIP蛋白表达能增加A549细胞对rhTRAIL诱导细胞凋亡的敏感性,有利于促进rhTRAIL蛋白在治疗NSCLC方面的研究应用。