通过引物设计和提高退火温度提高实时定量PCR检测microRNA的特异性

目的：了解因某些microRNA (miRNA) 家族成员序列相似,以及同一种成熟miRNA的长度不均一对PCR定量检测结果的影响,寻找区分相似miRNA成员和准确定量的方法和条件。方法: 采用RNA加尾和引物延伸实时定量RT-PCR法,设计不同位置错配的引物,以克隆到质粒中的全长成熟miRNA为模板,比较在不同退火温度下各种错配引物与完全匹配引物在扩增miRNA上的效率差异,并根据由此得出的经验设计let-7家族成员引物,以克隆的成熟miRNA为模板,检测其在不同退火温度下区分相似家族成员的能力。此外,设计了10组3′末端碱基位置不同的特异引物,比较了它们在检测小鼠大脑miRNA表达水平上的差异。结果：提高退火温度12 ℃~14 ℃将最大限度增加特异性而不降低敏感性,将引物的3′ 末端置于差异碱基或其附近可以有效区分相似miRNA序列,将引物3′ 末端置于miRNA第18~20个碱基,可避免漏检较短的成熟miRNA,使定量更真实准确。结论：精心设计引物并提高退火温度可提高实时定量PCR检测microRNA的特异性和准确性。     

实时定量PCR阵列检测小鼠大脑组织microRNA表达谱

目的：分析小鼠大脑组织microRNA(miRNA)表达谱,为研究特定miRNA及其靶基因、中枢神经系统miRNA相关的调节网络,以及miRNA在中枢神经系统疾病中的作用提供参考。方法：采用RNA加尾和引物延伸序列RT-PCR法,将精心设计的特异引物按Tm值排成阵列,用梯度实时PCR仪在不同的退火温度扩增每一个miRNA,并计算出每种miRNA相对于内参的表达量。结果：共检测了285个miRNA,阳性者260个,它们丰度不同,频数分布图大致呈正态。大部分miRNA的表达水平与已发表的芯片结果一致,而阳性率高于芯片结果。源自同一miRNA前体的2个成熟miRNA表达量,有些相差无几,有些则相差甚多。同簇相邻miRNA的丰度有些相近,有些则差异明显,提示miRNA转录后的归宿决定其丰度。结论：采用实时定量PCR阵列法,分析了小鼠大脑组织的miRNA表达谱,特别是获得了一些低丰度miRNA在小鼠大脑中表达的数据,这将有助于对这些低丰度miRNA的功能研究。     

荧光定量RT-PCR在轮状病毒检测中的应用

目的:建立轮状病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,用于检测临床腹泻样本。方法:使用Taqman探针技术,建立轮状病毒VP6特异的荧光定量RT-PCR体系。与WHO推荐的轮状病毒检测方法ELISA平行检测,对该体系的检测范围、灵敏度、特异性等参数进行评价。并将该体系用于临床腹泻样本。结果:该荧光定量RT-PCR体系具有高度灵敏度和特异性,线性范围宽,最低可检出1TCID50/ml。对113份临床腹泻样本的平行检测结果显示,该荧光定量RT-PCR体系与ELISA的检出率差异无统计学意义(χ2=0.41,P>0.5),可同样用于临床样本检测。结论:成功建立了轮状病毒荧光定量RT-PCR体系,该体系灵敏、特异、重复性好,可用于临床检测。     

实时定量RT-PCR检测博尔纳病病毒方法的建立

目的 建立检测博尔纳病病毒(BDV)RNA的实时定量RT-PCR(real-time RT-PCR)方法.方法 设计BDV-p40基因特异性引物和探针,优化反应条件;并以已知的BDV-p40基因扩增产物的克隆为标准品,建立标准曲线;然后对已知BDV RNA进行实时定量RT-PCR的特异性和敏感性检测.结果 建立了特异检测BDV RNA的实时定量RT-PCR技术,并且可以检测到感染细胞中1个拷贝以上BDV RNA.结论 本技术可以直接用于BDV感染的检测和定量分析.     

膀胱尿路上皮癌差异表达微小RNA的筛选、验证及意义

目的 分析膀胱尿路上皮癌中差异表达的微小RNA(miRNA),为进一步研究相关miRNA的功能及致癌机制提供平台.方法 收集2008年9月至2009年9月南京军区南京总医院泌尿外科手术获得标本,5份正常膀胱黏膜上皮组织和30例膀胱尿路上皮癌患者膀胱组织(其中浸润癌18例、非浸润癌12例;Ⅰ级10例、Ⅱ级10例、Ⅲ级10例),miRNA芯片分析筛选出差异表达miRNA.重新收集正常膀胱黏膜上皮组织(n=10)和膀胱尿路上皮癌标本(n=50);选4型膀胱尿路上皮癌细胞株,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)验证miRNA基因芯片结果.结果 Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ级、浸润性、非浸润性膀胱尿路上皮癌分别与正常膀胱黏膜上皮比较所得的6组差异表达基因中,has-miR-29b-1*均上调,has-miR-300、has-miR-923均下调.浸润性与非浸润性膀胱尿路上皮癌相比有7个差异表达基因,上调6个,下调1个.RT-PCR验证结果 与基因芯片结果 一致;4型膀胱癌细胞株中,T24细胞株RT-PCR验证结果 与基因芯片结果 完全一致.结论 膀胱尿路上皮癌与正常膀胱黏膜上皮组织比较存在差异表达的miRNA,其可能与膀胱尿路上皮癌的发生、浸润、进展密切相关;膀胱尿路上皮癌T24细胞株与膀胱尿路上皮癌有一致的miRNA差异表达.     

实时荧光RT-PCR对SARS患者血清中病毒含量的定量检测

目的:阐述SARS患者病程与血清中SARS病毒含量间的关系.方法:采用高灵敏度荧光实时定量RT-PCR方法,对156份SARS患者进行检测,同时,以9.4×109copies/L(Robert Koch Institute)灭活的SARS冠状病毒为定量标准品,病毒样颗粒为阳性对照,分析SARS-CoV阳性血清样本中的病毒含量.结果:检测试剂的灵敏度达1×105copise/L,与相关病原体没有交叉.81份血清样本中病毒含量分布在1×105～1×107copies/L之间,患者血清样本中病毒含量较低,经统计学分析,病毒含量与病程长短无明显数量关系.结论:SARS患者血清中病毒含量低,与病程没有明显的相关性.     

风疹病毒RNA Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法及参考标准的建立

目的建立风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,制备风疹病毒RT-PCR扩增子作为该方法的参考标准品。方法设计引物与探针,优化PCR条件,建立风疹病毒RNA实时荧光定量RT-PCR方法,并制备风疹病毒RT-PCR扩增子作为该方法的参考标准品。结果制备的风疹病毒特异性扩增子参考标准品为503 bp的片断,原液浓度为2.75×109copies/μl,纯度为92%;采用该特异性扩增子参考标准品建立的标准曲线相关系数r为-0.9993（r2=0.9986）,P〈0.001。结论本研究建立的风疹病毒特异性扩增子参考标准品稳定性好,纯度高;特异性扩增子参考标准品浓度的对数值与Ct值之间具有良好的线性关系,证实了本研究建立的风疹病毒RNATaqMan实时荧光定量RT-PCR方法定量的准确性。因而,建立的风疹病毒RNA实时荧光定量RT-PCR方法简便快捷、定量准确,可用于临床标本中风疹病毒RNA的定量检测。     

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的比较

目的：比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。方法采用实时荧光定量RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法,同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。结果细胞培养病毒分离的阳性数为26份,实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份,χ2=8.1, P<0.005。结论通过该实验,验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感,适用于实验室快速诊断。     

实时荧光定量RT-PCR与ELISA检测孕妇血清风疹病毒的比较分析

目的应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术定量检测孕妇血清标本中风疹病毒RNA,并与ELISA法比较其敏感度与特异度,为孕妇早期风疹病毒检测提供迅速准确的方法。方法收集126例已确诊风疹病毒阳性孕妇血清标本与107例女性健康查体者血清标本,同时进行实时荧光定量RT-PCR核酸检测与风疹病毒ELISA法IgM抗体检测,比较两种方法的敏感度与特异度。结果以细胞培养法为金标准,实时荧光定量RT-PCR法敏感度为92.9%,特异度为98.1%。ELISA IgM抗体法的敏感度和特异度分别为97.6%,86.9%。两种方法的敏感度无显著性差异（p〉0.05）,实时荧光定量RT-PCR法的特异度明显高于ELISA IgM抗体法（p〈0.01）。结论实时荧光定量RT-PCR简便快捷、敏感性高、特异性高、定量准确,在临床风疹病毒基因检测中具有很大的应用潜力。     

实时荧光定量RT-PCR分析直肠癌PPARδ的表达及意义

目的 分析人直肠癌组织过氧化物酶体增殖物活化受体δ基因(PPARδ)的表达变化及其与直肠癌临床病理特征的关系.方法 选取手术切除的直肠癌标本86例,以癌旁正常粘膜为对照,采用实时荧光定量RT-PCR对PPARδ mRNA作定量分析.结果 48例(55.8%)直肠癌组织PPARδ表达上调,其中39例(81.3%)上调1.5～5.0倍, 5例(10.4%)上调10～20倍, 4例(8.3%)大于20倍, 与对照组相比,两组间差异无统计学意义(P=0.083).PPARδ的表达与直肠癌分化程度、病理类型及Dukes分期无相关性(P＞0.05).结论 直肠癌组织中PPARδ基因的表达无显著上调,并且与直肠癌分化程度、病理类型及Dukes分期无关.     

MicroRNAs在唐氏综合征模型小鼠海马中的异常表达

目的：寻找唐氏综合征模型鼠Ts65Dn和对照二倍体组小鼠海马组织中差异表达的microRNAs。方法：从小鼠的海马组织中提取小分子RNA,采用RNA加尾和引物延伸RT- PCR法检测microRNAs。通过geNorm软件和Normfinder软件分析选择最佳的内参照基因,将每种microRNAs按其引物Tm值排成阵列,用梯度实时PCR仪在不同的退火温度扩增,并计算每种相对于microRNAs内参照基因的表达量。结果： geNorm和Normfinder两种方法均选定miR-27a为最稳定的内参照基因,共检测了52种microRNAs,其中miR-33 和miR-19a在Ts65Dn小鼠海马组织中表达显著下调,miR-130在Ts65Dn小鼠海马组织中表达显著上调,小鼠16号染色体三体区段包含的miR-802在Ts65Dn小鼠和对照二倍体小鼠海马组织中表达量均低,差异没有统计学意义。结论：MicroRNAs在Ts65Dn小鼠海马组织中的异常表达可能与唐氏综合征脑发育不良有关。     

巢式RT-PCR技术检测肺癌76例微量癌细胞转移分析

目的 :建立检测肺癌患者外周血及淋巴结微转移癌细胞的敏感的分子检测方法 ,并探讨其临床应用的意义。方法 :采用巢式逆转录聚合酶链反应 ( RT- PCR)技术特异引物扩增 CK19- m RNA,以检测肺癌患者外周血及淋巴结中 CK19- m RNA的表达情况。分析CK19- m RNA扩增结果与患者临床指标的关系。结果 :76例肺癌患者外周血标本中 39例CK19- m RNA阳性 ,阳性率为 5 1 .3% ,2 7例肺良性病变中仅 1例阳性 ,阳性率为 3.7% ,1 5例健康对照者均为阴性。全部患者 1 5 7枚淋巴结中 CK19- m RNA检测出阳性率为 38.9%( 61 / 1 5 7) ,常规病理方法检出阳性率为 1 4.6% ( 2 3/ 1 5 7) ,两种方法比较 ,有显著性差异 ( P<0 .0 5 ) ,且 HE染色阴性的 1 34枚淋巴结中 ,经 RT- PCR法证实存在癌转移的阳性率为 2 8.3% ( 38/ 1 34) ,两组比较有显著性差异 ( P<0 .0 5 )。结论 :巢式 RT- PCR是一种特异性和敏感性均较高的癌细胞微量转移检测方法 ;可能有助于肺癌细胞微转移的早期诊断。     

兔出血症病毒RT-PCR方法的研究

目的建立检测兔出血症病毒的RT-PCR方法。方法自感染RHDV致死的兔肝脏组织中提纯病毒，提取病毒总RNA，以RT-PCR方法扩增出368bp的基因片段。将RT-PCR产物克隆到T载体中，并对重组质粒测序。结果PCR产物的测序结果与文献报道的序列一致，敏感性试验结果表明，可检测到10^-7病毒滴度。结论建立的检测RHDVRT-PCR方法具有很高的特异性和敏感性。     

聚合酶链反应阵列同时定量检测37种白血病融合基因

目的建立一种同时定量检测多种白血病染色体易位形成的融合基因的荧光实时定量聚合酶链反应（real-time PCR）方法,了解阵列式PCR的应用可行性。方法组合使用82条引物,设立66个PCR平行管,同时定量检测37种白血病常见融合基因形成的125种剪切体和4种白血病常见的原癌基因活化。实时定量PCR采用Eva Green荧光染料法,用ABL基因做内参,用比较Ct法进行相对定量。用此方案对31例白血病患者标本进行检测,其中6例慢性粒细胞白血病（CML）患者做治疗前后或治疗过程中不同时间的对比检测,28人次与多重巢式PCR方案的检测结果进行对照。结果我们建立的PCR阵列方案有较大的线性检测范围（10^2～10^8拷贝／μl）,有较高的检测灵敏度（232拷贝／μl）和精确性;在31例患者标本的检测中,共检测到14种融合基因类型和所有4种原癌基因活化;检测到一例同时有5种融合基因阳性和两种原癌基因活化的患者;和多重巢式PCR检测结果的对比显示本方案灵敏度略低于巢式PCR,但差异没有统计学意义（P=0．009）;6例CML患者标本的检测显示治疗后患者标本中BCR／ABL融合基因及WT1和EVI1原癌基因表达量均呈现不同程度的降低,与临床治疗情况符合;基因定量分析的结果表明本方案能够对常见白血病融合基因和癌基因活化情况进行定量分析,在白血病的诊断及疗效监测中有应用价值。结论PCR阵列法同时定量检测多种白血病融合基因适于白血病初诊患者融合基因的筛查及微小残留病（MRD）的检测,对于检测同时有多种融合基因存在的病例及治疗过程中融合基因的变异情况更为有用。     

实时定量逆转录-聚合酶链反应监测慢性粒细胞白血病患者融合基因转录本水平及其变化

目的探讨实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)在监测慢性粒细胞白血病(慢粒)患者微小残留病变、考核疗效以及预测疾病预后方面的应用。方法应用实时定量RT—PCR对11例慢粒患者治疗前后融合基因(BCR—ABL)转录本水平的变化进行监测,对55例不同病期患者之间的转录本水平进行比较。结果对于慢性期患者,造血干细胞移植后其BCR—ABL转录本水平明显下降,甚至检测不到,甲磺酸伊马替尼(格列卫)治疗可获得类似结果,而羟基脲、干扰素α或三尖杉酯碱治疗后,其BCR—ABL转录本水平虽有下降但仍维持在较高水平;患者发生急变时,其BCR—ABL转录本水平升高约10倍;急变期患者的转录本水平明显高于慢性期或加速期患者。结论实时定量RT—PCR方法准确可靠,对于监测慢粒患者的微小残留病变、考核疗效以及预测慢粒急变具有重要的临床应用价值。