O157：H7（浙江株）的细胞毒性作用及其意义探讨

目的：用Vero,HeLa,CHO及KMB17细胞测定EHECO157：H7首例浙江株97－1－68菌株的细胞毒性，轴时与其他菌株作比较。方法：采用微量组织培养板的单层细胞培养测定菌体超声裂解液及细菌培养上清液的细胞毒性作用效价。结果：97－1－68菌株对全部4株细胞均无细胞毒性作用，而阳性对照株对Vero,HeLa细胞具有较强的细胞毒性作用。结论：在EHEC O157：H7感染中可能存在流行株和非流行株的“两类菌株”。     

O157:H7(浙江株)的细胞毒性作用及其意义探讨

目的用Vero、HeLa、CHO及KMB17细胞测定EHECO157H7首例浙江株97-1-68菌株的细胞毒性,同时与其他菌株作比较.方法采用微量组织培养板的单层细胞培养测定菌体超声裂解液及细菌培养上清液的细胞毒性作用效价.结果97-1-68菌株对全部4株细胞均无细胞毒性作用,而阳性对照株对Vero、HeLa细胞具有较强的细胞毒性作用.结论在EHECO157H7感染中可能存在流行株和非流行株的“两类菌株”.     

O_(157)∶H_7(浙江株)的细胞毒性作用及其意义探讨

目的　用Vero、HeLa、CHO及KMB17细胞测定EHECO157∶H7首例浙江株 97- 1- 6 8菌株的细胞毒性 ,同时与其他菌株作比较。方法　采用微量组织培养板的单层细胞培养测定菌体超声裂解液及细菌培养上清液的细胞毒性作用效价。结果　 97- 1- 6 8菌株对全部 4株细胞均无细胞毒性作用 ,而阳性对照株对Vero、HeLa细胞具有较强的细胞毒性作用。结论　在EHECO157∶H7感染中可能存在流行株和非流行株的“两类菌株”     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 StxⅡ基因表达

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157∶H7StxⅡ基因表达,并评价其对细菌生长的影响及细胞毒性。方法针对EHEC O157∶H7StxⅡ基因设计引物,构建CRISPR/Cas9表达质粒pdCas9-StxⅡ并转化EHEC O157∶H7感受态细胞,采用RT-PCR及胶体金法检测StxⅡ基因表达情况,绘制菌株生长曲线,将菌株培养上清液接种Vero细胞观察细胞病变情况。结果测序分析显示pdCas9-StxⅡ表达质粒被成功构建;转化EHEC O157∶H7(00G097)感受态细胞后,StxⅡ基因mRNA、蛋白表达均受抑制,EHEC O157∶H7生长曲线未受影响(P值均0.05)。pdCas9-StxⅡ-00G097菌株培养上清液对细胞的毒性效应(CPE为30%)显著低于对照菌株00G097和pdCas9-00G097(CPE均80%)。结论成功构建的pdCas9-StxⅡ表达质粒能特异抑制EHEC O157∶H7StxⅡ基因表达、降低细胞毒性,为进一步研究志贺毒素StxⅡ在EHEC O157∶H7致病机理和基因工程减毒活菌苗奠定了基础。     

湖北省首次分离出肠出血性大肠埃希菌O157：H7

目的：为了解肠出血性大肠埃希菌O157:H7（EHEC O157:H7）在我省的动物宿主种类和菌型特征，制定相应流行病防治对策。方法：采用传统方法，在6～10月份肠道传染病高发季节，对武汉市3大养殖场、屠宰场的肉猪、奶牛及武汉7大城区的农贸商场的水产品进行调查采样，共采集811份样品，进行EHEC O157:H7检测。结果：341份猪粪样品中检出1株EHEC O157:H7，阳性率为0.29%；255份奶牛粪便样品中检出7株EHEC O157:H7，阳性率为2.75%；其他类标本中未检出。分离的这8株阳性菌株与传统的EHEC O157:H7存在许多不同之处，他们均发酵山梨醇，大部分菌株不分解棉子糖，也存在不分解卫茅醇的菌株，而β-葡萄糖醛酸酶试验为阳性，在致病因子上，检测现有的几种毒力基因均为阴性。结论：在我省首次检出8株EHEC O157:H7，说明其普遍存在于动物体内，对环境、食品构成较大威胁。     

湖北省首次分离出肠出血性大肠埃希菌O157∶H7

目的为了解肠出血性大肠埃希菌O157∶H7(EHEC O157∶H7)在我省的动物宿主种类和菌型特征,制定相应流行病防治对策.方法采用传统方法,在6～10月份肠道传染病高发季节,对武汉市3大养殖场、屠宰场的肉猪、奶牛及武汉7大城区的农贸商场的水产品进行调查采样,共采集811份样品,进行EHEC O157∶H7检测.结果341份猪粪样品中检出1株EHEC O157∶H7,阳性率为0.29%;255份奶牛粪便样品中检出7株EHEC O157∶H7,阳性率为2.75%;其他类标本中未检出.分离的这8株阳性菌株与传统的EHEC O157∶H7存在许多不同之处,它们均发酵山梨醇,大部分菌株不分解棉子糖,也存在不分解卫茅醇的菌株,而β-葡萄糖醛酸酶试验均为阳性.在致病因子上,检测现有的几种毒力基因均为阴性.结论在我省首次检出8株EHEC O157∶H7,说明其普遍存在于动物体内,对环境、食品构成较大威胁.     

大肠埃希菌O157∶H7携带stx2::IS1203v基因研究

目的了解中国部分地区大肠埃希菌O157：H7菌株携带志贺毒素基因变异状况。方法采用聚合酶链反应扩增志贺毒素基因，使用核苷酸序列测定判断是否存在志贺毒素的新变种，用HeLa细胞毒性实验研究其细胞毒性的变化。结果1992—2002年中国部分地区分离到的289株产志贺毒素的大肠埃希菌O157：H7中有3株菌携带的志贺毒素2（stx2）基因有1．3kb的插入序列（IS）插入，且这段IS和IS1203变种（IS1203 variant，IS1203v）有100％的核苷酸序列同源性。IS1203v插入到3株大肠埃希菌O157：H7 stx2基因的位置及开放性读码框（ORF）方向有所不同。除此之外，3株菌原有的stx2基因序列完全一致且为Stx2原型毒素。和Stx2原型毒素相比，这3株携带stx2：：IS1203v基因的菌株对HeLa细胞的毒性明显降低。结论分离到IS1203v插入stx2基因的大肠埃希菌O157：H7菌株；IS1203v的插入可导致对HeLa细胞的细胞毒性降低。     

12株疑似O157:H7大肠菌PCR鉴定研究

目的:对12株疑似O157:H7大肠菌采用PCR法进行鉴定。方法:利用单一PCR和多重聚合酶链反应(mPCR)检测不同来源菌株志贺样毒素(stx1和stx2)、溶血素(hly)、粘附抹平因子(eaeA)、β-葡糖醛酸糖苷酶(u idA)、O157抗原编码(rfbE)、H7鞭毛抗原编码(fliC)基因。结果:4株大肠菌rfbE和fliC基因检测为阳性,确认为EHEC O157:H7,其中1株菌株扩增出全部毒力基因,另3株菌株扩增出除stx1外其它全部毒力基因;2株大肠菌rfbE基因检测阳性,确认为O157:H7-大肠菌;其它均为非O157:H7其它大肠菌。结论:PCR技术的应用能对可疑O157:H7大肠菌进行有效鉴定与分析,应成为今后病原学鉴定的主要技术手段。     

浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7的分子生物学特性研究

目的:了解自浙江省杭州市腹泻婴儿中分离的1株大肠埃希菌O157:H7(HZ1-11株)的分子生物学特性.方法:应用ATB1525细菌半动化生化鉴定系统鉴定菌种.应用O157特异性抗血清玻片凝集试验、H7特异性抗血清试管凝集试验、以及PCR检测O抗原特异性rfbE基因和H7特异性fliC基因,进行菌株血清型的鉴定.应用多重Real-timePCR和常规PCR检测stx1、stx2、hly和eae毒力基因.对菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型,并与国内代表菌株进行比较.ATB1525药敏检测仪和纸片法检测菌株的抗药性.结果:细菌生化鉴定为大肠埃希菌,山梨醇阴性.血清型为O157:H7.毒力基因stx2、hly和eae均阳性,stx1阴性.PFGE谱带同江苏分离O157:H7菌株几乎完全相同,带型的相似度为97%.结论:该菌株为浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)O157:H7,与国内近年在江苏等地流行的STECO157:H7菌株密切相关.STEC O157:H7已开始对浙江地区的人民健康构成了威胁.     

肠出血性大肠杆菌O157:H7分子生物学检测

本文对肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的分子生物学检测方法(DNA探针聚合酶链反应),以及O157:H7的流行菌株分析的研究进展作了综述。     

大肠杆菌O157:H7的分离筛选与实验诊断

O157:H7菌株是新近认识的肠出血性大肠杆菌(EHEC)的主要菌株.自1982年首次在美国发现以来,全球许多国家相继发生该菌感染及暴发流行,成为新的凶险传染病之一.国内自1987年首次分离到O157:H7以来,许多地方已发现该菌株.     

PCR方法检测EHEC O157∶ H7的rfbO157、fliCH7、hlyA、eaeA、stx2及其变种基因

目的:应用当前国际上常用的rfbO157、fliCH7、hlyA、eaeA、stx2及其变种5对引物,对45株疑似肠出血性大肠埃希菌O157∶ H7(EHEC O157∶ H7)检测鉴定,全面了解此类菌的致病力情况.方法:分纯并富集被鉴定菌株,首先以单克隆诊断血清学凝集,阳性者再经 100℃水煮制成粗模板,应用PCR检测各菌株是否具有rfbO157、fliCH7、hlyA、eaeA及stx2及其变种5种基因,扩增结果经EB染色后在凝胶成像仪下观察特异性条带并拍照.结果:45株被检测菌经PCR扩增检测,5种基因全部阳性的有10株,4种基因出现阳性的只有1株,3种基因阳性的有6株,2种基因阳性的有17株,1种基因阳性的有10株,1株菌的5种基因检测均为阴性.45株菌中rfbO157阳性的有44株,fliCH7基因阳性的菌株有30株,hlyA阳性的菌株只有10株,eaeA阳性基因的菌株有21株,stx2及其变种阳性的也只有11株.结论:这次45株菌中有5株具有全部的5种基因,44株为EHEC O157,其中30株为EHEC O157∶ H7,这次选择的5种基因不仅能给被检测菌株定性,而且能较全面地反应其毒力强度,适合于有条件的基层实验室开展.     

肠出血性大肠杆菌的研究简况

1982年,美国西北部爆发了一次出血性结肠炎(HC),当时曾注意到是一种新的肠道致病菌所致,随后证实致病菌是O 157:H7血清型的大肠杆菌。HC的临床表现有别于频泻不止的典型的痢疾杆菌性痢疾。在低热甚至不发热的HC病人,其粪便中可不出现白细胞。美国疾病控制中心(CDC)复习了自1973年以来搜集到的3000多株大肠杆菌的报道,只见1株O 157:H7。这显然是1株新的致病菌。肠出血性大肠杆菌(EHEC)中有90％以上是O 157:H7血清型。 EHEC能产生大量的Vero毒素,已知这种毒素能作用于非洲绿猴的肾细胞。Vero毒素有2个抗原型,即VT1和VT2。就生物学、物理学和抗原特性而言,VT1十分类似于志贺氏痢疾杆菌中的志贺氏毒素。Vero毒素均为蛋白亚单位毒素,其产物是相关的噬菌体。每一种Vero毒素均具有A和B亚单位。 Vero毒素与溶血性尿毒综合征(HUS)     

中国部分地区大肠埃希菌O157的分子分型及变异研究

目的了解出血性大肠埃希菌（EHEC）O157的分子流行特征和遗传变异关系并完善EHECO157：H7感染性腹泻监测制度。方法采用聚合酶链反应分析毒力基因的分布情况；用脉冲场凝胶电泳技术对1988-2005年部分地区分离到的249株EHECO157：H7（其中产志贺毒素的245株，不产志贺毒素的4株）和51株O157非H7进行分子流行病学分析。结果stx2基因在我国的EHECO157：H7菌株中有着很高的分布率，部分菌株携带stx2基因变种。300株O157共分为161种带型，其中51株O157非H7菌株共有42种带型，4株O157：H7非产毒株分别为4种带型，245株EHECO157：H7共有115种带型。结论EHECO157间的基因变异较大；产stx2原毒素的菌株和5衄2毒素发生变异的菌株带型相差较大。部分菌株之间存在着一定的交叉，说明虽然这两大类菌株有其特有的流行克隆系，但是它们的克隆系之间亲缘关系较近。     

肠出血性大肠杆菌O157：H7分子生物学检测

本文对肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7分子生物学检测方法（DNA探针、聚合酶链反应），以及O157：H7的流行菌株分析的研究进展作了综述。     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7疫苗的研究进展

O157:H7是肠出血性大肠埃希菌(EHEC)最常见的血清型.目前国内外尚无EHEC O157:H7疫苗问世,因此疫苗研究对防治EHEC O157:H7有着重大意义.外膜蛋白A(OmpA)作为抗EHEC O157:H7基础疫苗为疫苗研究提供了新的思路,此文对EHEC O157:H7疫苗研究的有关进展作了综述.     

交叉引物等温扩增技术在肠出血性大肠杆菌O157:H7快速检测中的应用

目的建立一种快速、敏感、特异的肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的交叉引物等温扩增(Cross Priming Amplification,CPA)检测方法。方法根据EHEC O157:H7 stx1基因特征性保守序列(Gen Bank83460),设计交叉引物、剥离引物和检测探针,建立了EHEC O157:H7的CPA检测技术。用该方法检测19株细菌常见的食源性细菌,以验证其特异性;并用菌液浓度梯度稀释的方法对该方法的检测灵敏度进行评价。并通过60份食品模拟样品验证其在实际应用中的可性行,该检测结果与经典的细菌分离培养鉴定方法及常用的荧光定量PCR法进行比较。结果在检测的19株细菌中,只有EHEC O157:H7菌株的检测结果为阳性。其它菌株检测结果均为阴性,证明其特异性良好;通过浓度梯度稀释证明该方法检测的灵敏度可达l02cfu/m L;与分离培养鉴定法及荧光定量PCR法比较,其检测的灵敏度均为96.77%和96.67%、特异度分别为93.10%和90%、准确性分别为95%和93.33%。结论用于EHEC O157:H7的CPA检测体系具有简便、快速、灵敏、特异的优点,可用于进出境口岸现场及食品EHEC O157:H7的快速检测。     

12株疑似O157：H7大肠菌PER鉴定研究

目的：对12株疑似O157：H7大肠菌采用PCR法进行鉴定。方法：利用单一PCR和多重聚合酶链反应（mPCR）检测不同来源菌株志贺样毒素（stx1和stx2）、溶血素（hly）、粘附抹平因子（eaeA）、β-葡糖醛酸糖苷酶（uidA）、O157抗原编码（血E）、H7鞭毛抗原编码（niC）基因。结果：4株大肠菌rfbE和fliC基因检测为阳性，确认为EHEC O157：H7，其中1株菌株扩增出全部毒力基因，另3株菌株扩增出除stx1外其它全部毒力基因；2株大肠菌rfbE基因检测阳性，确认为O157：H7-大肠菌；其它均为非O157：H7其它大肠菌。结论：PCR技术的应用能对可疑O157：117大肠菌进行有效鉴定与分析，应成为今后病原学鉴定的主要技术手段。     

醋酸对冻鸡分割品中EHEC O157:H7耐酸性影响的研究

目的 探讨醋酸对冻鸡分割品中EHEC O157:H7耐酸性的影响. 方法通过用2%醋酸对EHEC O157:H7污染的冻鸡进行喷洒、浸泡一定时间,然后在4℃和-25℃贮藏.研究EHEC O157:H7在喷洒和浸泡后的冻鸡分割品中对酸的耐受时间,抵抗酸性较强的EHEC O157:H7随着时间变化,观察其受酸影响的程度. 结果在处理受EHECO157:H7污染的冻鸡分割品时,增加2%醋酸的量和处理时间,并且及时将样品保存在-25℃,完全可以降低EHEC O157:H7对冻鸡分割品的污染程度. 结论在合理使用各种消毒措施的同时,采取这个对食品感宫和人体健康无害的方法,来预防和控制EHEC O157:H7对食品和环境的污染,是切实可行的.     

河南省新发传染病EHEC O157:H7监测研究

[目的]了解河南省肠出血性大肠杆菌(EHEC)感染性腹泻的发病情况、宿主带菌状况、食品污染程度及志贺毒素(stx)基因型,为制订有效的防治对策提供依据。[方法]采集河南省监测点腹泻病人、家畜、家禽粪便,水和肉食品等标本分离EHEC菌株,应用分子生物学技术检测分析菌株rfbO157、rfbO111、hlyA、eaeA、stx2和stx1等毒力基因和突变基因。[结果](1)从腹泻病人、家畜、家禽、食品、水、蜣螂和苍蝇中均分离出EHEC菌株共275株,总分离率7.88%;其中O157︰H7菌株为232株(84.36%),携带stx2基因EHECO157︰H7菌株88株(37.93%);非O157︰H7菌株43株(15.64%)。(2)宿主动物中羊带菌率最高(6.96%),是河南省EHEC最主要宿主动物;多重PCR检测出8种不同毒力基因组合型,主要为rfbO157 、hlyA 、eaeA 、stx2 组合。stx2变种毒素GK探针检测出3种毒素变种杂交带型,其中stx2原毒素 stx2vha型占7.4%,stx2vha型的占72.2%,未知新杂交带型占20.4%。(3)EHECO157︰H7菌株可分为9个PFGE型,自羊、牛、鸡和蜣螂和腹泻病患者中分离的携带stx2vha菌株同属一个PFGE型。(4)144株不携带志贺毒素的O157菌株中发现O157︰H38、O157︰H42和O157︰Hund(未确定型)新菌株。[结论]河南省家禽、家畜中普遍携带EHECO157︰H7大肠杆菌,羊是最主要的宿主动物;EHECO157︰H7为我省优势菌型,其毒素基因型为stx2-eaeA-hlyA并以stx2vha亚型为主。EHEC在外环境中污染严重并可在人与人、动物与人之间传播,家畜、家禽携带stx2 EHECO157︰H7率的高低与EHEC人群感染发病呈相关关系。