兔血管平滑肌细胞体外培养及生长特性研究

目的体外分离培养兔血管平滑肌细胞（VSMC）并观察其生长特征。方法采用酶消化结合贴壁法原代培养兔胸主动脉来源的VSMC并传代,倒置显微镜观察和免疫荧光染色法鉴定培养细胞;锥蓝法、绘制生长曲线、MTT法和划痕法分别测定VSMC传代细胞的成活率及其生长、增殖和迁移能力。结果原代培养5d后,VSMC从组织块边缘长出,传代细胞呈典型＂峰-谷＂状生长,胞质内α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色阳性;细胞成活率为96%;生长曲线近似＂S＂形;细胞生长第3～5d内光密度值变化较明显;无血清培养的VSMC在24h内划痕宽度变化最显著。结论体外培养的兔动脉平滑肌细胞为收缩表型且活性高,生长3～5d细胞增殖活力较强,无血清培养的细胞在24h内迁移能力最强,为心血管疾病研究提供了良好的实验材料。     

水蛭素对体外培养的兔血管内皮细胞及平滑肌细胞生长的影响

目的探讨水蛭素对体外培养的兔血管内皮细胞及平滑肌细胞生长的影响及剂量依赖关系。方法用体外培养兔血管内皮细胞及平滑肌细胞第3~5代,加入96孔细胞培养板,同时加入不同浓度的水蛭素0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25 mg/L,每6孔为一个浓度组,1640培养液为空白对照组,共7组,培养48 h后用噻唑蓝比色试验(MTT法)测定各孔贴壁细胞的吸光值(OD)。结果与空白对照组相比,低、中、高浓度水蛭素作用于体外培养的兔血管内皮细胞后,细胞形态无明显改变,贴壁良好,生长无明显抑制作用(P>0.05);而水蛭素作用于兔血管平滑肌细胞后,与空白对照组相比,低浓度水蛭素对平滑肌细胞形态无明显改变,中、高浓度水蛭素作用于平滑肌细胞后,细胞密度有所减小、排列松散,OD值下降,呈现抑制平滑肌细胞的生长(P<0.05)。结论不同浓度水蛭素对体外培养兔血管内皮细胞生长无显著抑制作用;低浓度水蛭素对体外培养兔血管平滑肌细胞生长无明显抑制作用,中、高浓度水蛭素可抑制兔血管平滑肌细胞的生长。     

兔血管平滑肌细胞三维培养模型的建立

目的 观察兔血管平滑肌细胞（VSMCs)在三维培养系统中的生物学特性,方法 在兔主动脉中膜来源的VSMCs单层培养系统的基础上,将VSMCs培养在胶原凝胶中,形成VSMCs三维培养系统,并对细胞的形态结构,生长增殖及其影响因素进行研究。结果（1）三维培养VSMCs在凝胶形成后3－4h,形成多个细胞突起,呈星状,后继续伸展,呈梭 ,纺锤形,（2）张力条件下,三维培养VSMCs可呈一定的方向性排列。（3）三维培养VSMCs与经典的单层培养相比,细胞活力无统计学差异,但细胞增殖受到一定程度的抑制。结论 运用VSMCs三维培养系统不仅可以观察和研究细胞的形态结构,生长增殖等方面,还可研究在力条件下的撑特征,对组织工程化血的研究将产生积极的影响。     

改良大鼠血管平滑肌细胞的原代培养

目的探讨提高大鼠血管平滑肌细胞原代培养效率的方法。方法采取组织块贴壁法进行原代培养,高糖DMEM培养基中加入血小板源性生长因子-B(platelet-derived growth factor-b,PDGF-B),用细胞形态学及免疫组织化学法对血管平滑肌细胞鉴定。结果原代培养,4～6天可见细胞长出,2周可以传代;传代培养,1周可以传代1次。镜下可见细胞以梭形为主,呈"峰-谷"状生长,免疫组化染色可见细胞浆内有大量染成棕黄色的肌丝。结论在采用组织块贴壁法进行培养时,加入PDGF-B培养,可获得纯度高、活性好的血管平滑肌细胞,并缩短了培养周期。     

大鼠血管平滑肌细胞的培养与鉴定

目的:改进大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的培养方法。方法:采用机械刮除、差异贴壁等手段进行组织贴块法原代培养,胰蛋白酶消化传代,并应用相差显微镜和即用型SABC免疫组化染色试剂盒对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果:镜下培养细胞呈典型的"谷-峰状"生长,免疫组化染色显示胞浆内-αactin阳性表达,锥虫蓝染色检测细胞传代成活率95%。结论:本法可获纯度高、结构和功能良好的VSMCs。     

大鼠血管平滑肌细胞分离培养的探讨

目的：培养大鼠血管平滑肌细胞。方法：手术显微镜下分离主动脉和肺动脉，再用翻转干涸法进行操作。结果：显微镜下分离组织，岢基本除净动脉纤维脂肪层和外膜，再用刀片轻刮内膜，可保证所贴组织块为地动脉中膜。传至第三代时，用台盼蓝检查细胞传代成活率９５％，光镜、电镜和免疫组化鉴定培养细胞，培养细胞纯度９６％。结论：贴块片简便易行、经济、又可以防止膜损伤，可为血管病理变化研究提供适宜的细胞。     

糖尿病大鼠血管平滑肌细胞体外培养方法的探讨

目的:对糖尿病大鼠血管平滑肌细胞体外培养方法进行探讨,建立糖尿病大鼠血管平滑肌细胞模型,为糖尿病慢性血管并发症研究奠定基础。方法:建立糖尿病大鼠模型,用组织贴壁法体外培养胸主动脉血管平滑肌细胞。结果:糖尿病大鼠造模成功。用贴壁法培养糖尿病大鼠血管平滑肌细胞,3d后相差显微镜下可见细胞游出,培养7～10d左右细胞重叠生长达多层,高低起伏呈“峰—谷”状。平滑肌细胞actin免疫组织化学染色鉴定为平滑肌细胞。结论:糖尿病大鼠血管平滑肌细胞增殖速度快,培养条件要求严格,在形态学上与正常大鼠平滑肌细胞相同。     

培养状态下兔骨髓基质细胞生长特性

目的：观察兔骨髓基质细胞（ＭＳＣ）的体外生长特性，为用于骨／软骨组织工程的功能细胞提供实验基础。方法：于胫骨近端提取骨髓，分离ＭＳＣ，原代培养，形成ＣＦＵ－Ｆ，以１×１０＾４个细胞／ｃｍ＾２传代培养５代，绘制细胞生长曲线，计算倍增时间，测定分裂指数和贴壁率。结果：第１￣５代转代细胞生长曲线基本相同，第３代细胞倍增时间为２４ｈ，分裂指数最高达１９％，１２ｈ内９５％细胞贴壁。结论：在本实验培养条件下，     

组织块法培养兔主动脉平滑肌细胞

目的探讨培养兔主动脉平滑肌细胞的方法，为心血管疾病的病因机制研究提供有用的体外模型。方法采用组织块贴壁、反转干涸方法培养兔主动脉平滑肌细胞并传代。倒置显微镜下进行形态学观察及免疫细胞化学鉴定。结果成功培养兔血管平滑肌细胞并传代。倒置显微镜下细胞呈典型的“峰-谷”状。免疫细胞化学染色呈棕黄色，均呈阳性表达，胞浆内可见纵行排列肌丝。结论利用组织块贴壁、反转干涸方法成功进行兔主动脉平滑肌细胞原代培养，具有简便易行、培养周期短、纯度高等优点，是心血管疾病良好的体外研究模型。     

免膀胱平滑肌细胞的分离培养与鉴定

目的 建立分离、培养高纯度兔膀胱平滑肌细胞的方法,并进行细胞学鉴定与分析。方法 正常成年新西兰白兔共6只,运用显微手术器械在肉眼下仔细剔除膀胱黏膜层及浆膜层后,完整分离膀胱平滑肌层。然后以酶分离法获取兔膀胱平滑肌细胞,体外原代和传代培养分离细胞。在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况,同时进行细胞爬片H-E染色和透射电镜等形态学观察分析,并应用免疫荧光染色平滑肌特有的α-肌动蛋白进行细胞学鉴定分析。最后根据细胞计数绘制细胞生长曲线和增殖曲线。结果 24 h可见膀胱平滑肌细胞贴壁生长,7 d可进行传代,传至第10代时细胞仍迅速生长,倒置显微镜下观察细胞相互交叉、重叠生长形成多层,高低起伏呈“谷和峰”样结构,至第12代时,细胞开始变形,至第15代时细胞已失去平滑肌细胞的典型形态特点,细胞生长杂乱且不规则,至第20代时细胞已死亡。以第4代细胞进行形态学细胞爬片H-E染色和透射电镜观察分析,以及平滑肌特有的α-肌动蛋白免疫荧光染色分析均证实,该分离培养的细胞为膀胱平滑肌细胞,且纯度高达100%。结论 酶分离法在短时间内成功培养大量高纯度的膀胱平滑肌细胞,为深入研究膀胱平滑肌细胞的病理生理及分子生物学奠定了基础。     

人脐动脉平滑肌细胞体外培养

目的建立人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养方法。方法运用植块贴壁法进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外原代和传代培养。倒置相差显微镜和免疫荧光染色方法对培养细胞进行鉴定。结果原代和传代培养的细胞生长良好,光镜下细胞呈长梭形"峰-谷"样生长,具有典型的平滑肌细胞特征。经传代培养至第5代,细胞生长特性未见异常改变;经考马斯亮兰R250及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光染色检测,证实为平滑肌细胞。结论植块贴壁法可成功进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养,传代后细胞生物学特征稳定,为慢性肾病并发心血管疾病的机制研究奠定了实验基础。     

人脐动脉平滑肌细胞培养方法的探讨

目的研究人脐动脉血管平滑肌细胞的培养方法.方法运用贴块法进行人脐动脉血管平滑肌细胞的培养,并用倒置显微镜进行形态学观察和用免疫组化对培养细胞进行鉴定.结果运用贴块法成功培养了人脐动脉血管平滑肌细胞,培养的细胞呈典型"峰谷"样生长,免疫组化S-P法检测α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(α-SMActin)表达,确认为人血管平滑肌细胞.经传代培养至3～5代,细胞生长特性未见异常改变.结论贴块法培养的人脐动脉血管平滑肌细胞生长稳定性好,且培养与纯化能同步进行.     

小鼠主动脉血管平滑肌细胞分离培养及鉴定

目的建立体外分离培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的技术方法并观察其生长特征。方法比较组织贴块法及酶联合消化法原代分离小鼠主动脉来源的VSMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;苏木精-伊红(HE)染色观察细胞形态及免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法、3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法分别测定主动脉VSMC传代细胞的成活率、生长、增殖特征;观察不同血清含量对主动脉VSMC生长的影响。结果组织贴块法培养的细胞6 d后,细胞从组织块边缘长出,14 d后生长迅速可传代;酶联合消化法分离培养的细胞3 d后,细胞呈梭形生长,7～8 d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察可见呈典型"峰-谷"状生长;2种方法获得的细胞行免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率均为96%;细胞生长曲线近似"S"形,MTT法显示细胞生长第3～5天光密度值变化较明显;用含体积分数20%血清的杜尔伯科改良伊格尔培养基高糖培养液培养的细胞出现明显对数期。结论本研究建立了高效分离和培养主动脉VSMC的2种方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型。     

血管平滑肌细胞的培养及鉴定

目的探讨以简便、高效的方法获取血管平滑肌细胞,为相关研究提供实验材料.方法采用改良组织贴块法进行原代培养,胰酶消化传代,综合运用自然纯化、机械刮除、差异贴壁法进行细胞纯化,并应用相差显微镜和SP试剂盒对细胞进行形态学和免疫组化鉴定.结果90%的组织块接种存活,5代的平滑肌细胞纯度达98%以上.镜下培养细胞呈典型的"谷峰状"生长,免疫组化染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达.结论本法简便、可靠,短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞.     

晚期糖化终产物对离体血管平滑肌细胞的影响

探讨晚期糖化终产物对离体新生牛胸主动脉血管平滑肌细胞的影响及机制。方法：观察ＶＳＭＣ受ＡＧＥｓ刺激后其生长,超微结构和血小板源生长因子－Ａ（ＰＤＧＦ－Ａ）的变化以及维生素Ｅ对上述变化的影响。结果：ＡＧＥｓ促进ＶＳＭＣ生长,细胞内ＡＧＥｓ和ＰＤＧＦ－Ａ的免疫反应呈阳性,线粒体和粗面内质网增多。     

主动脉平滑肌细胞的三维培养研究

目的研究主动脉平滑肌细胞(aortic smooth muscle cell,ASMC)在三维培养中是否仍能产生弹性蛋白。方法取一周龄SD大鼠胸主动脉,经原代、传代培养后,和胶原、血清及培养液混合形成ASMC胶原凝胶,进行三维培养;培养2周后用Comori醛复红弹性纤维染色和弹性蛋白免疫组织化学染色,检测细胞胶原凝胶中所产生的弹性纤维,并进行电镜观察。结果传代细胞经α肌动蛋白免疫组织化学染色鉴定,98％以上为ASMC。培养2周的ASMC胶原凝胶切片用二种染色方法均可显示有弹性纤维存在,电镜观察细胞超微结构呈典型的合成表型。结论 ASM在三难培养中能够产生弹性蛋白,并形成弹性纤维。     

Differences in the primary culture, purification and biological characteristics between endothelial cells and smooth muscle cells from rat aorta

Objective: To investigate the differences of primary culture, purification and biological characteristics between endothelial cells and smooth muscle cells from rat aorta. Methods: Endothelial cells were obtained using the vascular ring adherence, collagenase digestion method and an improved vascular ring adherence method, while smooth muscle cells were separated from tissue sections of rat aorta. Clones of endothelial cells were selected by limiting dilution assay. Both cell types were identified using specific cell immunofluorescent markers,and phase contrast microscopy was used to observe the morphological disparity between endothelial cells and smooth muscle cells at the single cell and colony level. Cell proliferation was determined by the cell counting kit-8. Differences between endothelial cells and smooth muscle cells were evaluated in trypsin digestion 6me, attachment time and recovery after cryopreservation. Results: Endothelial cells were obtained by all three methods. The improved vascular ring method provided the most reproducible results. Cells were in good condition, and of high purity. Smooth muscle cells were cultured successfully by the tissue fragment culture method. Clonal expansion of singleendothelial cells was attained. The two cell types expressed their respective specific markers, and the rate of proliferation of smooth muscle cells exceeded that of endothelial cells. Endothelial cells were more sensitive to trypsin digestion than smooth muscle cells. In addition, they had a shorter adherence time and better recovery following cryopreservation than smooth muscle cells. Conclusion: The improved vascular ring method was optimal for yielding endothelial cells. Limiting dilution is a novel and valid method for purifying primary endothelial cells from rat aorta. Primary rat endothelial cell and vascular smooth muscle cell cultures exhibited different morphological characteristics, proliferation rate, adherence time, susceptibility to trypsin digestion and recovery after cryopreservation. Our research can be a good foundation for further application in the regeneration of blood vessel.