PXJ-41/M2-1转染人肺腺癌PAa细胞及其稳定表达

目的探讨外源性呼吸道合胞病毒(RSV)M2—1基因在人肺腺癌贴PAa细胞中获得稳定表达的可行性。方法将携有RSVM2—1基因的真核表达载体PxJ41／M2—1，在脂质体介导下，导入人肺腺癌PAa细胞株。通过以18筛选获得阳性克隆，并继续培养，用RT—PCR及免疫组织化学方法检测M2—1在人肺腺癌PAa细胞内的稳定表达情况。结果经RT—PCR方法扩增到M2—1620bP特异性条带。免疫组织化学证实，转染PxJ41／M2—1后的PAa细胞内有M2—1蛋白的表达。     

β-arrestin2基因转染对人肺腺癌细胞 A549的增殖影响

目的：观察外源性β-arrestin2基因对人肺腺癌细胞A549增殖的影响。方法利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA3 c．1-β-arrestin2质粒和空载体pcDNA3．1质粒分别导入A549细胞,经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆,RT-PCR和Western blotting检测β-arrestin2基因表达的影响。采用MTT（四甲基偶氮唑盐）法分析转染细胞的增殖情况。结果经脂质体转染和筛选,建立了稳定表达β-arrestin2基因的A549细胞系。与未转染组和转染空白载体组比较,转染β-arrestin2基因的细胞生长速度明显减慢（ P ＜0．05）。结论β-arrestin2基因可能通过抑制P65活性而抑制人肺腺癌细胞A549的生长。     

hFcεRIα/RBL-2H3细胞株的构建与评价

目的构建稳定表达人FcεRIα(h FcεRIα)亚基的RBL-2H3细胞株。方法利用RT-PCR技术克隆h FcεRIα基因,构建真核表达载体p CI-neo-h FcεRIα。脂质体介导法转染RBL-2H3细胞,G418筛选获得稳定转染细胞株。利用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法鉴定转染结果。结果通过对脂质体介导转染体系进行优化,转染效率可高达75.38%。经Western blot、免疫荧光及RT-PCR鉴定,h FcεRIα基因在RBL-2H3细胞内成功表达。结论成功构建h FcεRIα/RBL-2H3细胞模型,为深入研究Ig E与FcεRI作用机制及相关药物开发提供了实验基础。     

BMP2、VEGF165双基因共表达质粒在小鼠骨髓基质干细胞的表达

目的观察转染BMP2和VEGF165双基因共表达质粒在小鼠骨髓基质干细胞的表达情况。方法脂质体介导下将双基因真核表达质粒pIRES-BMP2-VEGF165导入小鼠骨髓基质干细胞,用RT-PCR和免疫组织化学方法观察BMP2和VEGF165双基因在小鼠骨髓基质干细胞内的表达。结果转染BMP2、VEGF165的小鼠骨髓基质干细胞有明显的BMP2和VEGF165 mRNA及其蛋白表达。结论转染BMP2和VEGF165双基因的小鼠骨,髓基质干细胞能同时表达以上两种基因。     

肺癌相关基因LSCC-3真核表达载体的构建及其表达

目的构建含有肺癌相关基因LSCC-3全长ORF片段的真核表达载体,并验证其在细胞内的表达。方法PCR方法获取LSCC-3基因全长ORF片段,构建含有上述片段的真核表达载体（含3’端绿色荧光蛋白尾）并验证、纯化;将该真核表达载体转染人肺腺癌PAa细胞系,在倒置荧光显微镜下对LSCC-3基因的表达进行观察和验证。结果成功将LSCC-3基因全长ORF片段装入真核表达载体pLPS-3’EGFP（pLPS-LSCC-3-3’EGFP）并转染人肺腺癌PAa细胞系,在倒置荧光显微镜下观察到了核外细胞浆内LSCC-3基因蛋白表达产物的存在。结论成功构建了LSCC-3真核表达载体pLPS-LSCC-3-3’EGFP,该载体可在肺癌细胞胞浆内顺利表达。     

腺病毒介导的FasL基因诱导肺癌细胞凋亡

目的研究外源性FasL基因对人肺癌细胞凋亡的影响以及FasL基因治疗肺癌的可能性.方法构建腺病毒载体介导FasL基因转移到低水平表达FasL的人肺腺癌细胞系A549,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞术(FCM)检测FasL基因的表达,并观察A549肺癌细胞凋亡和生长,对肿瘤生长模型的治疗效果进行分析.结果外源性FasL基因在A549肺癌细胞获得高水平的表达,FasL能显著抑制A549的生长和集落形成,流式细胞仪检测显示细胞G1期阻滞并发生了凋亡.瘤内注射Ad-FasL对裸鼠体内移植瘤有较强的抑瘤作用.结论FasL基因参与了肺癌细胞凋亡的诱导,能抑制肺腺癌细胞的生长,因此该基因在肿瘤的基因治疗上有广泛的应用前景.     

稳定表达RASSF1A基因肝癌细胞株的建立

目的建立稳定表达RASSF1A基因的肝癌细胞株。方法真核表达载体pcDNA3.1(+)RASSF1A经阳离子脂质体介导转染肝癌细胞株QGY-7703和Hep3B,通过G418筛选阳性细胞克隆,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot鉴定目的基因的表达。结果 (1)QGY-7703,Hep3B细胞株的G418最佳筛选浓度分别为800 μg／ml和400 μg／ml;(2)QGY-7703和Hep3B细胞株各获得2个稳定表达RASSF1A基因的细胞克隆。结论成功建立了稳定表达RASSF1A基因的肝癌细胞株。     

人降钙素基因在大鼠成肌细胞中的表达与鉴定

目的 建立稳定表达人降钙素(hCT)基因的细胞株(L6),观察人降钙素基因在大鼠成肌细胞中的表达和分泌情况.方法 采用自行构建的5端融合小鼠抗体轻链基因Igκ的信号肽序列的人降钙素基因分泌性真核表达载体pcDNA3.0-Igκ-hCT,采用脂质体介导方法将人降钙素基因导入大鼠成肌细胞;对照组用pcDNA3.0空质粒转染.经G418筛选后,采用RT-PCR法和免疫细胞化学法检测人降钙素基因在大鼠成肌细胞中的表达,并用放免法检测细胞培养上清液降钙素的分泌.结果 RT-PCR法和免疫细胞化学法均能检测到人降钙素基因在大鼠成肌细胞中的表达;并在连续传代的细胞培养上清液中检测到每106个细胞24 h培养液中降钙素分泌量的平均值42.22 ng.结论 成功转染人降钙素基因真核表达载体pcDNA3.0-Igκ-hCT于大鼠成肌细胞中;该载体可在细胞中持续稳定表达,建立了稳定的人降钙素基因表达系统.     

抗VEGFR-2 scFv-Fc融合抗体的构建及其在CHO细胞中的稳定表达

目前报道的靶向VEGF/VEGFR基因工程抗体多为不含Fc片段的Fabs、cFv等小分子抗体,该文旨在CHO-k细胞中表达抗VEGFR-2 scFv-Fc融合抗体。将抗VEGFR-2 scFv(AK404)基因与含有人IgG1恒定区的真核表达载体pcDNA3.1-Fc连接,重组质粒测序后经脂质体介导转染CHO-k细胞,G418加压筛选获取稳定表达细胞株。RT-PCR、western blot检测目的基因的转录、表达。测序结果表明重组质粒构建成功,RT-PCR及western blot显示目的基因成功整合到宿主基因组并表达。最终获得可稳定表达抗VEGFR-2 scFv-Fc融合抗体的重组CHO-k细胞株,为融合抗体的大量制备和活性研究打下基础。     

稳定表达RASSFIA基因肝癌细胞株的建立

目的建立稳定表达RASSF1A基因的肝癌细胞株。方法真核表达载体pcDNA3．1( )RASSF1A经阳离子脂质体介导转染肝癌细胞株QGY-7703和Hep3B，通过G418筛选阳性细胞克隆，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot鉴定目的基因的表达。结果(1)QGY-7703，Hep3B细胞株的G418最佳筛选浓度分别为800ug／ml和400ug／ml；(2)QGY-7703和Hep3B细胞株各获得2个稳定表达RASSF1A基因的细胞克隆。结论成功建立了稳定表达RASSF1A基因的肝癌细胞株。