tBid基因的表达及其对骨肉瘤SOSP-9607细胞的促凋亡作用

目的：观察tBid基因在骨肉瘤细胞中的表达及其对转染的SOSP-9607细胞的凋亡作用。方法：采用脂质体转染的方法,将tBid基因转染骨肉瘤细胞,间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达和细胞形态学变化,进一步电镜观察其超微结构改变。MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况,通过Annexin V、染色流式细胞仪检测来观察其促凋亡作用。结果：转染SOSP-9607细胞后,间接免疫荧光染色检测tBid的表达,细胞出现凋亡。电镜观察呈现出典型的凋亡特征。MTT实验发现细胞的增殖被明显抑制。Annexin V染色流式细胞仪检测可见明显的凋亡细胞,与对照组细胞（凋亡率为6%）相比,其凋亡率为35.8%。结论：tBid基因可以在转染的SOSP-9607细胞中表达,并可抑制转染细胞的生长,诱导细胞发生凋亡。     

胎肝AFT024细胞对脐血CD34+细胞体外扩增及多药耐药基因转染的影响

目的:探讨Her2靶向重组的caspase-6融合蛋白对骨肉瘤SOSP-9607细胞的促凋亡作用。方法:将抗Her2单链抗体基因e23sFv与绿脓杆菌外毒素PE的转膜结构域基因(PEⅡ)和活性caspase-6基因连接,构建成Immunocasp-6(e23sFv-PEⅡ-casp-6)基因,将其克隆入真核表达载体pCMV中,转染SOSP-9607细胞,间接免疫荧光法检测目的基因表达和细胞形态学变化,通过AnnexinV染色、流式细胞术、MTT法检测来观察其促肿瘤细胞凋亡的作用。结果:转染SOSP-9607细胞后,间接免疫荧光染色检测出caspase-6的表达,SOSP-9607细胞出现明显的核浓缩、碎裂;电镜观察到细胞质浓缩,胞内空泡,核染色质浓集等典型的凋亡特征;MTT法检测发现细胞的增殖明显被抑制;AnnexinV染色流式细胞术检测可见明显的凋亡细胞,凋亡率为31.4%,较对照组细胞(凋亡率为6.0%)有非常显著的增加(P<0.01)。结论:重组Immunocasp-6基因可以在转染的SOSP-9607细胞中表达,并诱导细胞发生凋亡。     

重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用

目的：构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,并探讨其对骨肉瘤E10细胞的促调亡作用。方法：通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪（FCM）检测E10细胞膜表面HER2的表达。将抗HER2单链抗体基因e23sFv与铜绿假单胞菌外毒素PE的转膜结构域基因（PEⅡ）和tBid基因连接,构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,将其克隆入真核表达载体pCMV中构建重组pCMV-ScFv/tBid载体,转染骨肉瘤E10细胞。间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化,Annexin V染色流式细胞术及TUNEL法检测E10细胞的凋亡情况。结果：流式细胞仪检测到E10细胞膜表面有HER2的表达。成功构建重组融合蛋白基因质粒pCMV-ScFv/tBid。重组质粒转染E10细胞后,间接免疫荧光双标记染色检测到E10细胞中tBid的过表达;细胞色素C在细胞质中出现;细胞出现明显的固缩、核浓缩等形态特征。Annexin V染色后流式细胞仪检测可见实验组细胞凋亡率较对照组明显升高（16.1% vs 4.5%）;TUNEL染色显示,E10细胞出现典型的凋亡特征。结论：重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid可以在转染的骨肉瘤E10细胞中表达,并诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。     

重组抗HER2融合蛋白基因ScFv／tBid对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用

目的构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv／tBid，并探讨其对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用。方法通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪（FCM）检测E10细胞膜表面HER2的表达。将抗HER2单链抗体基因e23sFv与铜绿假单胞菌外毒素PE的转膜结构域基因（PEⅡ）和tBid基因连接，构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv／tBid，将其克隆入真核表达载体pCMV中构建重组pCMV-ScFv／tBid载体，转染骨肉瘤E10细胞。间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化，AnnexinV染色流式细胞术及TUNEL法检测E10细胞的凋亡情况。结果流式细胞仪检测到E10细胞膜表面有HER2的表达。成功构建重组融合蛋白基因质粒pCMV-ScFv／tBid。重组质粒转染E10细胞后，间接免疫荧光双标记染色检测到E10细胞中tBid的过表达；细胞色素C在细胞质中出现；细胞出现明显的固缩、核浓缩等形态特征。AnnexinV染色后流式细胞仪检测可见实验组细胞凋亡率较对照组明显升高（16．1％VS4．5％）；TUNEL染色显示，E10细胞出现典型的凋亡特征。结论重组抗HER2融合蛋白基因ScFv／tBid可以在转染的骨肉瘤E10细胞中表达，并诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。     

人存活素特异性siRNA促进SOSP-9607细胞凋亡的实验研究

目的:构建人存活素(survivin)基因的siRNA真核表达载体,探讨其对骨肉瘤细胞SOSP-9607凋亡的影响.方法:利用pSilencer 3.0-H1 neo,构建人存活素特异性的RNA干涉载体,转染SOSP-9607细胞,G418筛选稳定转染的细胞系.westem blot检测survlvin蛋白水平变化.透射电镜等形态学观察、Annexin V法、Hoechst染色检测细胞凋亡.结果:成功构建了人存活素基因siRNA真核表达载体PS.获得了稳定转染的细胞系.与正常SOSP-9607细胞、阴性对照细胞相比,SOSP-9607/PS生长曲线十分平缓,存在显著差异(P＜0.01).western blot显示SOSP-9607/PS细胞中蛋白表达减少.SOSP-9607/PS凋亡率增加(P＜0.01).结论:特异性siRNA能够明显抑制survivin基因在SOSP-9607细胞中的表达并明显促进细胞凋亡,这为进一步研究survivin在SOSP-9607细胞中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.     

EPHA2-siRNA质粒对骨肉瘤细胞生物学行为的影响

目的探讨骨肉瘤细胞中EPHA2基因表达对细胞增殖、凋亡以及仿血管发生的影响。方法应用pSiliencer质粒构建靶向EPHA2的siRNA质粒;脂质体转染siRNA质粒人骨肉瘤细胞,Western blot在蛋白水平检测转染前后细胞基因表达情况;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞仪结合Annexin V-FITC和PI染色以及HE染色观察转染前后骨肉瘤细胞增殖、凋亡及仿血管发生情况。结果成功构建了针对EPHA2的siRNA表达质粒;将质粒转染入骨肉瘤后,EPHA2基因在蛋白表达水平下调;骨肉瘤细胞增殖能力下降,并发生了早期凋亡,骨肉瘤细胞的仿血管发生受到抑制。结论EPHA2参与了骨肉瘤细胞增殖、早期凋亡和仿血管发生;利用RNA干扰技术靶向EPHA2基因治疗可能为骨肉瘤治疗提供新方法。     

热休克蛋白90阻止剂增强热诱导骨肉瘤细胞杀伤的研究

目的：探讨热休克蛋白90（heat shock protain 90,HSP90）分子伴侣复合物阻止剂17-丙烯胺基-17去甲氧基格尔德霉素（17-allylamide-17-demethoxgeldanamycin,17-AAG）,对热诱导的骨肉瘤SOSP-9607细胞杀伤作用的影响。方法：采用干细胞集落形成实验、流式细胞术（flow cytometry,FCM）和吖啶橙荧光染色等方法观察比较单纯热疗组与热疗联合17-AAG治疗组对骨肉瘤SOSP-9607细胞活力、凋亡率及形态学影响。结果：干细胞集落形成实验显示,热疗联合17-AAG治疗组较单独热疗对骨肉瘤SOSP-9607细胞的杀伤效应明显增强,P=0．036;Annexin V—FITC染色流式细胞术结果显示,热疗联合17-AAG治疗组所致凋亡率（52．2％）大于单纯热疗组（17．5％）;用吖啶橙荧光染色法观察到热疗联合17-AAG治疗组明显见骨肉瘤SOSP-9607细胞固缩着色不均而且较深,细胞核浓缩、裂解等凋亡特征。结论：HSP90分子伴侣复合物阻止剂17-AAG能增强热诱导的骨肉瘤SOSP-9607细胞的杀伤作用。     

促凋亡基因PDCD5在骨肉瘤U2-OS细胞表达及对其促凋亡作用的研究

目的:观察外源性PDCD5基因对骨肉瘤细胞系U2-OS的促凋亡作用。方法:扩增重组质粒PCI-neo-PDCD5,采用脂质体转染的方法,将PDCD5基因转染骨肉瘤细胞U2-OS,RT-PCR检测转染后表达情况;撤除血清培养16h后,四甲基偶氮唑盐MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况;An-nexinV-染色流式细胞仪检测细胞凋亡;蛋白质印迹法分析凋亡通路。结果:转染骨肉瘤细胞U2-OS后,RT-PCR检测到PDCD5的表达,MTT实验发现撤除血清后转染重组质粒组细胞的增殖被明显抑制。于转染空载体和对照组细胞相比,存活细胞明显减少,P<0.001。AnnexinV染色,流式细胞仪检测可见明显的凋亡细胞,与转染空质粒组(凋亡率为1.47%)相比,其凋亡率为10.28%。经PDCD5处理的细胞中,Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9的表达与对照组比较,差异均有统计学意义。结论:PDCD5基因可以在转染的骨肉瘤细胞系U2-OS细胞中表达,并在撤出血清因素的诱导作用下可显著抑制转染细胞的生长,并通过线粒体激活途径发挥促凋亡作用并诱导细胞发生凋亡。     

caspase-6基因诱导成骨肉瘤细胞凋亡

目的：探讨caspase6对成骨肉瘤细胞株的凋亡诱导作用。方法：应用RTPCR方法检测成骨肉瘤细胞株SOSP9607中caspase6基因的表达水平。以腺病毒adv5作载体，构建含caspase6基因的转基因载体，用脂质体包裹法转染SOSP9607细胞株， 用RTPCR方法检测转染后SOSP9607细胞中caspase6基因的表达。用MTT法检测转染caspase6对SOSP9607细胞株生长的影响。结果：成骨肉瘤细胞株SOSP9607中未检出caspase6表达。RTPCR法证实转染caspase6后SOSP9607中caspase6表达显著增强，MTT检测显示对SOSP9607细胞的生长有抑制作用，形态学观察及DNA电泳证实转染后的细胞株存在细胞凋亡特征。结论：caspase6对成骨肉瘤细胞的生长有抑制作用，并可诱导成骨肉瘤细胞凋亡。     

Survivin反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞凋亡的影响

目的:采用survivin反义寡核苷酸(ASODN)封闭骨肉瘤细胞survivin的作用,观察其对骨肉瘤细胞系MG63增殖和凋亡的影响。方法:以脂质体为载体,介导survivin反义寡核苷酸转染人骨肉瘤细胞系MG63,用MTT法测定细胞增殖;流式细胞仪检测转染survivin反义寡核苷酸后细胞凋亡率;Westernblot及半定量RTPCR检测转染survivin反义寡核苷酸后的骨肉瘤细胞survivin蛋白及mRNA表达。结果:脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染骨肉瘤细胞系MG63后,细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡率明显增加,骨肉瘤细胞survivin蛋白及mRNA表达均明显降低。结论:脂质体介导转染survivin反义寡核苷酸可以抑制细胞增殖,有效降低细胞内survivin基因的表达,促进细胞凋亡。     

FBW7通过Notch信号通路影响骨肉瘤SOSP-9607细胞迁移与侵袭

目的:观察FBW7在骨肉瘤细胞SOSP-9607中的表达,探讨FBW7对骨肉瘤细胞迁移与侵袭的作用以及与Notch信号通路的关系。方法:培养人骨肉瘤SOSP-9607细胞,用慢病毒介导的siRNA转染SOSP-9607细胞,并分为sh-FBW7组（下调FBW7）、up-FBW7组（上调FBW7）和空白对照组。利用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印记法（Western blot）验证分析骨肉瘤细胞系SOSP-9607和正常成骨细胞系hFOB中FBW7 mRNA表达和蛋白表达水平。Transwell实验验证FBW7对骨肉瘤细胞迁移与侵袭作用的影响。 Western blot验证FBW7与Notch信号通路的关系。结果:qRT-PCR和Western blot检测结果显示:骨肉瘤细胞系SOSP-9607中FBW7 mRNA表达和蛋白表达明显低于正常成骨细胞系hFOB（P＜0.05）。Transwell结果显示:sh-FBW7组的迁移与侵袭细胞数明显高于空白对照组（P＜0.05）;up-FBW7组的迁移与侵袭细胞数明显低于空白对照组（P＜0.05）。上调骨肉瘤细胞中的FBW7可以抑制Notch1及其靶基因Hes1的表达;下调骨肉瘤细胞中的FBW7可以增加Notch1及其靶基因Hes1的表达。结论:FBW7在骨肉瘤SOSP-9607细胞中低表达,FBW7通过Notch信号通路影响骨肉瘤SOSP-9607细胞迁移与侵袭。     

siRNA干扰FoxM1基因表达对人骨肉瘤MG63细胞增殖与凋亡影响研究

目的通过抑制骨肉瘤细胞株MG63中FoxM1基因表达,观察对骨肉瘤细胞系增殖与凋亡的影响。方法采用蛋白质印迹法检测不同人骨肉瘤细胞株MG63和SOSP-9607中FoxM1基因的表达。将骨肉瘤细胞株MG63分为实验组、阴性对照组和空白对照组,实验组转染FoxM1特异性siRNA（FoxM1-siRNA）,阴性对照组转染阴性对照siRNA,空白对照组不做处理。实时-聚合酶链反应（Real-time PCR）和蛋白质印迹法检测转染前后FoxM1基因在mRNA及蛋白表达水平的变化;四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖率,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果人骨肉瘤细胞株MG63和SOSP-9607中存在FoxM1基因的表达。实验组MG63细胞转染siRNA后,FoxM1的mRNA表达为0.39±0.09,低于阴性对照组的0.91±0.07,t=7.92,P〈0.001;也低于空白对照组的0.96±0.08,t=8.68,P〈0.001。实验组FoxM1蛋白表达为0.31±0.06,显著低于阴性对照组的0.81±0.10,t=7.20,P〈0.001;也低于空白对照组的0.89±0.09,t=8.35,P〈0.001。实验组MG63细胞增殖率为0.36±0.03,显著低于阴性对照组的0.61±0.02,t=12.86,P〈0.001;也低于空白对照组的0.65±0.02,t=14.92,P〈0.001。实验组MG63细胞凋亡率为（13.69±1.15）%,显著高于阴性对照组的（2.38±0.90）%,t=14.16,P〈0.001;也高于空白对照组的（2.87±0.86）%,t=13.54,P〈0.001。结论人骨肉瘤细胞株中存在FoxM1蛋白的表达;特异性siRNA可下调骨肉瘤细胞株MG63中FoxM1基因的表达,对细胞的增殖具有负性调控作用,并能诱导细胞凋亡。     

BLCAP基因cDNA的克隆及siRNA表达载体的构建

目的：克隆BLCAP基因cDNA并构建和鉴定针对于BLCAP基因的siRNA真核表达载体.方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得BLCAP基因.将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定.将合成的siRNA核酸片段退火形成双链后连接到经BamHI和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1真核表达载体,命名为pSilencer4.1-B1以及pSilencer4.1-B2,并进行酶切及测序鉴定.脂质体法转染SOSP-9607细胞系,G418筛选以及RT-PCR验证构建的真核表达载体对目的基因的干涉情况.结果：经酶切及测序鉴定,所获得的目的片段序列BLCAP基因完全相符.重组质粒中含有与理论值相符的插入片段,其测序结果与设计序列一致.经脂质体法转染后pSilencer4.1-B2可明显抑制SOAP-9607细胞的BLCAP表达.结论：成功克隆了BLCAP基因并cDNA构建和验证了其siRNA真核表达载体.     

microRNA-192 抑制物对骨肉瘤细胞系SOSP_9607增殖和凋亡的影响*

目的：探讨miR-192 抑制物对于骨肉瘤细胞系SOSP_ 9607细胞增殖和凋亡的影响。方法：四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定细胞增殖抑制率,流式细胞仪测定细胞凋亡和周期。将SOSP_ 9607细胞分为对照组和实验组,对照组分为阴性对照和正常细胞对照组。实验组采用miR-192 抑制物（hsa-miR-192 inhibitors ）抑制SOSP_ 9607细胞内miR-192 的活性。结果：与对照组相比,实验组显著抑制SOSP_ 9607细胞的增殖,有明显的剂量依赖性（P<0.01）。 随着浓度从50nmol/L 逐渐增加至200nmol/L ,抑制率逐渐增高（P<0.01）。 与对照组相比,实验组细胞周期G0/G1 细胞比例显著增加,G2/M期细胞比例显著减少,S 期细胞比例显著减少（P<0.01）。 实验组凋亡率（13.6 ± 2.1）% 与阴性对照组凋亡率（7.1 ± 0.5）% 相比明显增高（P<0.01）。 结论：miR-192 抑制物通过抑制SOSP_ 9607细胞中miR-192 的活性对SOSP_ 9607细胞的增殖和凋亡发挥重要作用,可能成为骨肉瘤生物治疗的新靶点。     

人miR-34a真核表达载体的构建及其表达

目的:构建人miR-34a的真核表达载体,并使其在骨肉瘤SOSP-9607细胞中表达.方法:从人骨肉瘤SOSP-9607细胞基因组DNA中用PCR法扩增出miR-34a的前体序列,并引入酶切位点和保护碱基,双酶切后定向插入真核表达载体pcD-NA3.1(+)中,构建miR-34a真核表达载体pcD-NA-miR34a,然后进行菌落PCR、酶切和测序鉴定.同时用构建好的载体pcDNA-miR34a转染骨肉瘤细胞SOSP-9607细胞,筛选miR-34a稳定表达细胞系,用Northern blot及real time RT-RCR法鉴定pcD-NA-miR34a可于真核细胞中过表达miR-34a的生物学特性.结果:成功构建了人miR-34a真核表达载体pcDNA-miR34a.pcDNA-miR34a可于骨肉瘤SOSp-9607细胞中上调miR-34a的表达,获得了miR-34a高表达骨肉瘤细胞系.结论:miR-34a的真核表达载体可在骨肉瘤细胞SOSP-9607细胞中有效表达,为进一步研究miR-34a在骨肉瘤中的功能及基因调控机制奠定了实验基础.     

成骨肉瘤细胞SOSP-9607中miRNA的克隆与验证

背景与目的:microRNA(miRNA)是一类非编码蛋白,并参与转录后调节的单链小分子RNA(约20～25个碱基),对基因表达具有重要调控作用,与肿瘤的发生存在着密切的关系.本研究拟克隆成骨肉瘤细胞系SOSP-9607中miRNA,并对部分功能性基因进行验证.方法:以SOSP-9607细胞作为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200 nt),多聚腺苷酸化和5'连接子连接后,通过RT-PCR进行反转录和扩增,克隆到pCR 4-TOPO载体上得到大约109 bp DNA片段,测序后经过生物信息学分析确定miRNA的表达情况.根据当前miRNA的研究现状,在克隆到的miRNA中选取部分功能性miRNA和新发现miRNA,合成相应探针后与从SOSP-9607细胞、HeLa细胞和成骨肉瘤组织中分离出的小片段RNA进行Northern印迹验证.结果:克隆测序后得到182个克隆体,经生物信息学分析发现有47个miRNA(25种),其中含有23种已知的miRNA和2种Nature杂志上预测的miRNA(miR-165和miR-166).选取的三条实体瘤相关的miRNA(miR-21、miR-20a、miR-17-5p)以及两条预测的miRNA进行Northern印迹验证,miR-21、miR-20a、miR-17-5p在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中均表达,预测的miR-165和miR-166在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中亦均表达,但miR-166在HeLa细胞中没有表达.结论:克隆了SOSP-9607细胞中的miRNA,并验证了部分功能性miRNA的表达,提示miRNA与肿瘤发生可能有密切的关系.     

肿瘤相关中性粒细胞促进人骨肉瘤细胞SOSP-9607迁移及其作用机制

目的:研究肿瘤相关中性粒细胞对人骨肉瘤细胞迁移能力的影响及可能的机制。方法:HE和免疫组化染色检测骨肉瘤临床标本中中性粒细胞浸润程度;中性粒细胞与人骨肉瘤细胞系SOSP-9607共培养,xCELLigence RTCA DP多功能实时无标记细胞分析仪监测不同比例中性粒细胞对SOSP-9607细胞迁移能力的影响;细胞因子芯片检测中性粒细胞与人骨肉瘤细胞系SOSP-9607共培养后细胞因子变化情况。结果:在临床转移骨肉瘤标本中HE和免疫组化染色均显示肿瘤组织内存在中性粒细胞的浸润;xCELLigence RTCA DP多功能实时无标记细胞分析仪监测显示,骨肉瘤细胞SOSP-9607和人外周血中性粒细胞共培养后细胞迁移能力明显增强于对照组;细胞因子芯片检测发现IL-6、IL-1β、Angiogenin、IGFBP-1等多个细胞因子明显增高。结论:人骨肉瘤细胞SOSP-9607和肿瘤相关中性粒细胞共培养,中性粒细胞能够促进SOSP-9607细胞的迁移,而这种促进作用很可能是通过IL-6、IL-1β、Angiogenin、IGFBP-1等多种细胞因子实现的。