牛裂体吸虫线粒体DNA序列和基因排序分析

目的为探讨牛裂体吸虫(Schistosoma bovis)在裂体属内的系统发生位置,测定牛裂体吸虫线粒体基因部分序列,并分析该编码区域的基因序列和基因排序。方法以GNT-K法抽提牛裂体吸虫成虫基因组DNA,用兼并和特异引物扩增目的基因。扩增产物经纯化后克隆于pGEM1T质粒载体,并转化大肠埃希菌。抽提和纯化阳性质粒DNA,并测序。以纯化后的阳性质粒DNA为模板,根据已获得的序列设计内部特异引物,采用引物步移法获得全长目的片段。在GenBank中查找曼氏血吸虫等相关血吸虫线粒体基因序列,作基因排序及比较分析后,以邻接法绘制系统发生树。结果测定了牛裂体吸虫线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基Ⅳ～Ⅰ基因序列(nicotinamide adeninedinucleotide dehydrogenase subunit4-1gene,nad4-nad1),其长度为2214bp。分析该编码区基因排序为nad4-trnQ(Gln)-trnK(Lys)-nad3-trnD(Asp)-nad1。牛裂体吸虫在该区域的线粒体基因排序与非洲支系血吸虫相似,与亚洲支系血吸虫有很大的不同;根据牛裂体吸虫与其他8种吸虫部分nad4,nad3,部分nad1和部分nad4+nad3+nad1基因序列比对结果,分别构建系统发生树。结果表明,牛裂体吸虫与埃及血吸虫位于同一簇,归属于非洲血吸虫支系,这与由基因排序推测的牛裂体吸虫的系统发生位置结果相一致。结论牛裂体吸虫属于非洲支系而非亚洲支系血吸虫。     

基于核糖体基因分析的中华血吸虫分子种系发生研究

目的　测定中华血吸虫细胞核核糖体基因 r DNA- ITS2和 L SU序列 ,并根据这些序列 ,构建基因树 ,探讨中华血吸虫在裂体属内的系统发生位置。　方法　以 GNT- K法抽提基因组 DNA后 ,用特异引物 ,PCR扩增目的基因。扩增后的 PCR产物经纯化后克隆于载体质粒 p T- adv中再次扩增后 ,提取并纯化质粒 DNA,并以此作模板 ,使用通用测序引物 M13 (F/ R)于 L icor测序仪上进行测序。检索 Gen Bank,查找曼氏血吸虫相关血吸虫两基因序列 ,将有关血吸虫同一基因排序、比较分析后 ,以毛毕吸虫和杜氏小裂体吸虫作为外群 ,使用 PHYL IP和 MEGA以邻接法和最大简约法绘制系统发生树。　结果　克隆并测定了中华血吸虫的 r DNA - ITS2和 L SU ,毛毕吸虫的r DNA- ITS2序列 ,以及根据这些序列构建系统发生树。　结论　中华血吸虫 ITS2和 L SU基因的系统发生树结果一致 ,均提示中华血吸虫归属于亚洲血吸虫种群 ,且中华血吸虫可能是该种群血吸虫类群中较古老的虫种     

安徽省不同地区日本血吸虫群体线粒体基因遗传变异研究

目的 探讨安徽省不同地区日本血吸虫种群的遗传进化关系。 方法 分别从安徽省山丘型流行区(池州市石台县)和湖沼型流行区(安庆市大观区、铜陵市枞阳县)采集钉螺,逸出尾蚴后感染小鼠,每只小鼠感染(50±3)条尾蚴。 35 d 后解剖小鼠,门静脉灌注法收集成虫,提取成虫 DNA,PCR 扩增、克隆和测序成虫的线粒体 NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)脱氢酶 1(ND1)和细胞色素 C 氧化酶亚基Ⅰ( COⅠ)基因,利用生物信息学软件 Dnasp6. 0 和 Mega X 分析所得序列基本特征并构建系统进化树作遗传进化分析。 结果 安徽省三个地区日本血吸虫样本的 ND1 基因序列存在 15 个变异位点,COⅠ序列存在 74 个变异位点;ND1 基因和 COⅠ基因的核苷酸多样性(Pi)分别为 0. 004 7、0. 017 3,样本间 COⅠ基因序列差异高于 ND1 基因;来自湖沼型流行区的样本 ND1 基因和 COⅠ 基因的变异位点数、核苷酸多样性(Pi)均高于来自山丘型流行区样本。 来自山丘型流行区的样本在 ND1 系统进化树中与来自湖沼型流行区的样本聚集在一起,而在 COⅠ基因系统进化树中单独成簇。 结论 来自湖沼型流行区的日本血吸虫样本群体的基因多样性高于来自山丘型流行区的样本。 安徽省三个地区日本血吸虫群体的 COⅠ基因存在遗传分化,而 ND1 基因尚未产生较明显的遗传分化。     

中国日本血吸虫地域株基因差异的研究

目的　研究中国日本血吸虫各地域株基因差异。　方法　收集湖南、安徽、湖北、四川及江苏 5省的阳性钉螺 ,将逸出的日本血吸虫尾蚴感染昆明小鼠 ,42d后 ,用灌注法获取成虫 ,用PCR扩增成虫线粒体NADH (还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 )脱氢酶 1(ND1)和细胞色素C氧化酶 1(CO1)基因片段 ,克隆于质粒载体后测序并用MEGA软件分析。　结果　各地域株日本血吸虫成虫的ND1和CO1基因长度分别为 476bp和 10 33bp ,ND1和CO1基因序列分别存在 2个单倍体 (Ⅰ型 ,Ⅱ型 ) ,其差异分别为 4.0 %和 3.4%。从分子发生树看 ,各地域株日本血吸虫ND1和CO1基因分别存在 2个不同基因型。在ND1基因中呈现Ⅰ型的 ,CO1基因中也为Ⅰ型 ,反之 ,均为Ⅱ型。　结论　研究区域湖南、安徽、湖北、四川及江苏 5省的日本血吸虫株ND1和CO1基因存在 2个不同基因型。     

多房棘球蚴线粒体NADH脱氢酶1基因分析及PCR检测方法

目的 扩增多房棘球蚴线粒体NADH脱氢酶亚基1(NADH dehydrogenase subunit1,ND1)基因全序列,测序并进行同源性比较.建立检测多房棘球蚴感染的PCR方法,应用于人和动物感染多房棘球蚴的快速检测和鉴定.方法 根据多房棘球绦虫线粒体DNA全序列,设计引物扩增ND1基因并进行测序,获得多房棘球蚴ND1基因全序列.对该序列与其它常见棘球绦虫的ND1基因序列进行同源性分析.结果 多房棘球蚴线粒体ND1基因序列与国外报告的多房棘球绦虫的同源性达到98.8％,与细粒棘球绦虫的同源性为86.2％,与少节棘球绦虫的同源性为84.6％,与伏氏棘球绦虫的同源性为87.0％.结论 多房棘球蚴线粒体ND1基因与其他棘球绦虫相应基因存在显著差异.PCR方法可以用于多房棘球蚴感染的快速检测和鉴定.     

编码日本血吸虫线粒体大亚基核糖体基因的亚克隆、测序及同源性分析

目的筛选日本血吸虫成虫 cDNA 文库,得到基因克隆并测序。方法体外将以阳性克隆为模板的 PCR 产物和 pGEM-T 载体连接,转染大肠杆菌 XL1-blue,经抗生素及生色底物 X-gal 初筛,再用限制性内切酶酶切法进一步鉴定为重组质粒后,DNA 自动测序仪测序。序列送blast 基因服务站进行同源性分析。结果构建三个含日本血吸虫 cDNA 基因片段的重组子,其中一个阳性克隆序列为编码日本血吸虫线粒体大亚基核糖体的基因序列。结论获得编码日本血吸虫线粒体大亚基核糖基因片段,为分析其作为候选重组疫苗分子的潜能打下基础。     

PCR-SSCP研究中国日本血吸虫线粒体DNA的遗传变异

目的 研究中国日本血吸虫线粒体DNA的遗传变异。方法 试剂盒抽提我国11个地域株日本血吸虫基因组总DNA,以特异性引物对其线粒体NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)脱氢酶1(ND1)和细胞色素C氧化酶1(CO1)片段进行PCR扩增,PCR产物纯化后作SSCP分析。结果 SSCP结果共出现15种条带类型,其中NDl片段中出现7种条带类型,分别是湖北省5地2种;中国台湾、湖南、安徽与江西各为1种;四川、云南同为1种。CO1片段中出现8种条带类型,其中湖北境内5个地域株中有2种;中国台湾株、湖南、安徽与江西各为1种,四川、云南株各为1种。结论 我国各地域株日本血吸虫存在不同程度的遗传变异。     

血吸虫硫氧还蛋白免疫原性研究Ⅰ日本血吸虫硫氧还蛋白DNA疫苗的构建和鉴定

目的构建日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白(Trx)DNA疫苗(pcDNA3-SjcTrx),并进行分子生物学鉴定。方法根据日本血吸虫菲律宾株Trx基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入EcoRI酶切位点和终止密码子TCA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株Trx(SjcTrx)编码基因。经双酶切并纯化的PCR产物与经双酶切纯化的pcDNA3质粒DNA片段用T4DNA连接酶连接,克隆入真核表达载体pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3-SjcTrx,并经限制性内切酶双酶切、琼脂糖凝胶电泳、PCR检测和核苷酸序列测定进行鉴定。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334bp,构建的pcDNA3-SjcTrx重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段,根据核苷酸序列测定结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。结论日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗构建成功,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。     

中国不同种拟钉螺CO1基因序列差异分析及其系统学初探

目的研究中国拟钉螺线粒体CO1基因的差异并初步探讨其系统发生。方法收集4省7地拟钉螺标本,抽提基因组DNA,PCR扩增线粒体CO1基因,扩增产物纯化后进行序列测定,所测序列用Kimura双参数法计算遗传距离,NJ和UPGMA法构建系统进化树。结果PCR扩增得到大小约700bp的片段。遗传距离显示:台湾邱氏拟钉螺与湖北钉螺滇川亚种亲缘关系最近距离为0.124,而与其余6种拟钉螺遗传距离较远,遂将其分为两组。6种拟钉螺组内距离为0.127,两组间距离为0.179。两种方法构建进化树拓扑结构基本一致。台湾邱氏拟钉螺与湖北钉螺滇川亚种聚为一支,其余6种拟钉螺位于另一支。结论台湾邱氏拟钉螺应归入湖北钉螺,钉螺与拟钉螺属单源进化。中国不同种拟钉螺CO1基因存在差异。     

日本血吸虫磷酸甘油酸激酶基因T/A克隆及序列分析

目的获取日本血吸虫磷酸甘油酸激酶(SjPGK)编码基因片段,分析其核苷酸序列,为日本血吸虫病疫苗研制提供候选抗原分子。方法根据曼氏血吸虫磷酸甘油酸激酶(SmPGK)cDNA序列设计1对引物,采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法,从日本血吸虫成虫总RNA中扩增SjPGK基因片段。利用T/A克隆法,将其克隆入pMD18T载体,经双酶切分析和PCR鉴定,将阳性克隆进行脱氧核糖核酸序列测定;运用Blast程序,将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果RTPCR特异性扩增出1条长约830bp大小的条带;经酶切和PCR鉴定表明所构建的质粒pMD18TSjPGK中含有所扩增的基因序列;脱氧核糖核酸序列测定和分析,SjPGK基因片段长为830bp,与SmPGK的核苷酸同源性为85%,分值为672;氨基酸同源性为94%,分值为473。结论成功克隆SjPGK编码基因片段,为进一步实验提供了条件。     

三地钉螺线粒体DNA两个分子的遗传变异研究

目的 分析广西、云南、湖南三地钉螺线粒体DNA细胞色素C氧化酶Ⅰ(CO1)基因和细胞色素氧化酶b(Cytb)基因的遗传变异。 方法 收集广西靖西、云南洱源和湖南岳阳三地钉螺，提取其基因组DNA，PCR法扩增线粒体CO1和Cytb基因并测序。用Clustal W(1.82)软件对所测基因序列排序，用MEGA(3.1)计算其碱基组成、转换及颠换；用Kimura双参数法计算遗传距离，用非加权组平均法(UPGMA)和最大简约法(MP)构建系统发生树。 结果 PCR扩增获得CO1和Cytb基因大小分别约为700及600 bp(含两侧引物)。三地钉螺CO1基因中共检测到106个多态性位点，约占核苷酸总数的15.9%，Cytb基因中多态性位点为165个，约占核苷酸总数的28.5%。广西靖西与湖南岳阳、广西靖西与云南洱源的钉螺CO1基因和Cytb基因的遗传距离分别为0.051、0.158和0.031、0.405。根据CO1和Cytb的基因序列，用上述两种方法构建的系统发生树结果均一致。广西靖西与湖南岳阳的钉螺同属一个支系，云南洱源钉螺单独形成另一支系。 结论 广西、湖南和云南的钉螺CO1和Cytb基因总体上具有相对丰富的多态性。     

云南省血吸虫病流行区一种拟钉螺及其寄生吸虫尾蚴的分子鉴定

目的对云南省血吸虫病流行区的一种拟钉螺及其寄生吸虫进行分子生物学鉴定,了解其种属分类地位。方法采集云南省祥云县拟钉螺和钉螺,压碎镜检采集螺软体腹足部组织,并观察其体内尾拗寄生情况。采用逸拗法采集拟钉螺寄生的不同形态尾拗,螺体组织和尾拗样本分别提取基因组DNA,采用PCR法扩增螺体内16S核糖体RNA(16S rRNA)、细胞色素c氧化酶I(COI)、28S核糖体DNA(28S rDNA)基因及其体内寄生吸虫尾拗的NADH脱氢酶亚基1(ND1)、28S rfNA基因,对扩增产物进行测序,并通过序列比对及系统进化分析鉴定样本螺和寄生吸虫种属。结果共检测拟钉螺样本382只,发现无叉形、双叉形、燕子形等3种形态吸虫尾拗,阳性率分别为20.94%(80/382)、3.40%(13/382)、7.07%(27/382)。基于16S rRNA、COI、28S rDNA基因的分子进化分析显示,该拟钉螺与滇池德拉维螺(Delavaya dianchiensis)同源性较高、聚在同一个分支。基于ND1、28S rDNA4基因的序列分析显示,无叉形尾拗吸虫属侧殖吸虫科,燕子形尾拗吸虫属孔肠科,双叉形尾拗吸虫可能为不同于中华血吸虫(Schistosoma sinensium)和勾形卵血吸虫(Schistosoma ovuncatum)的另一种血吸虫。结论初步了解了云南省血吸虫病流行区拟钉螺及其寄生吸虫种属分类,但更明确的分类关系和危害性等尚有待深入研究。     

斯氏并殖吸虫线粒体Cytb基因的扩增、测序以及遗传进化分析

目的扩增出斯氏并殖吸虫线粒体Cytb（cytochromeB）基因片段并测序,分析该基因对吸虫遗传分类的意义。方法提取斯氏并殖吸虫成虫基因组DNA,PCR扩增线粒体Cytb基因,克隆质粒并测序。在NCBI的GeneBank中作相似性和同源性检索,用DNAsis等软件分析这些吸虫的线粒体Cytb基因,采用最大简约法（MP）和邻位相连法（NJ）构建系统进化树,用MEGA4软件对遗传距离进行计算分析。结果获得542bp的斯氏并殖吸虫线粒体cytb基因片段,通过在Gene—Bank数据库中Blast发现,斯氏并殖吸虫的Cytb序列与日本血吸虫（中国流行区虫种）、异盘并殖吸虫、哈氏并殖吸虫以及巨睾吸虫等7种吸虫有相似性,斯氏并殖吸虫与日本血吸虫的遗传距离最近。结论线粒体国tb基因可作为吸虫遗传进化分类的依据之一,也是斯氏并殖吸虫与血吸虫等易出现较高的交叉反应率的原因之一。     

日本血吸虫线粒体DNA两个分子的遗传变异

目的　从线粒体DNA的2个分子,探讨我国日本血吸虫的遗传变异。　方法　试剂盒抽提基因组总DNA后,以特异性引物对线粒体还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶1(ND1)和细胞色素c氧化酶I(COI)进行PCR扩增,将PCR产物分别测序,并以生物信息学方法加以比较,构建系统进化树。　结果　序列系统进化树显示日本血吸虫中国大陆株与中国台湾株之间差异较大,在树状图中可归为2类;中国大陆山区型地域株,即云南洱源和四川天全在树状图中归为1类;中国大陆湖沼洲滩型地域株,即湖南岳阳、江西新建和安徽贵池3个地域株在树状图中处于并列位置;湖北省境内不同地域株在树状图中归为1类。　结论　我国各地日本血吸虫存在不同程度的遗传变异,各地域株间亲缘关系密切,存在共同的起源     

不同地域株湖北钉螺CO1基因的差异研究

目的　研究中国大陆及台湾地区不同地域株湖北钉螺CO1基因的差异,为湖北钉螺种下分类提供依据。方法　收集13个地域株的湖北钉螺,高盐法抽提细胞内全部DNA ,PCR法扩增线粒体CO1基因,纯化并测序。将测序结果输入MEGA2程序,Kimura双参数法计算遗传距离,并分别用UPGMA法和最小进化法构建系统发生树。结果PCR扩增获得CO1基因大小约70 0bp(含两侧引物)。遗传距离显示:13个地域株明显被分为两组,其中四川株和云南株为一组,组内遗传距离为0 .0 35 ,其余为另一组,组内平均遗传距离为0 .0 14。而两组间的遗传距离为0 .12 9。两种方法构建的进化树拓扑结构基本一致。进化树分两大支,四川株和云南株位于一支,其它地域株位于另一支。结论13个自然隔离株湖北钉螺CO1基因总体差异不大,显示为一个种,其中四川、云南株与其它地域株差异显著,支持以往滇川亚种的结论,长江中下游各地域株CO1基因非常相近,支持指名(或湖北)亚种的分类方法。福建株、台湾株的分类地位有待进一步探讨。光壳和肋壳钉螺CO1基因无差异。     

贵州省安顺地区蛇源裂头蚴分离株的分子鉴定及种系发育关系分析

目的 对贵州省安顺地区蛇源裂头蚴分离株进行分子鉴定及种系发育关系的分析。方法 采集贵州安顺地区4种常见野生蛇(王锦蛇、乌梢蛇、黑眉锦蛇、灰鼠蛇)来源的裂头蚴,分别提取各裂头蚴基因组DNA,PCR扩增ITS1和cox1基因,所得PCR扩增产物经纯化并T-A克隆后测序。运用ClustalX1.81生物分析软件,将所得序列与GenBank所录迭宫属绦虫和其它属绦虫基因序列进行多重序列比对分析,并应用软件MEGA 6.0构建系统发育树(邻位连接法)。结果 成功扩增出8株裂头蚴的ITS1和cox1基因序列,ITS1大小为822~863 bp,cox1大小为404~415 bp,与预期的基因片段大小一致。基于ITS1和cox1基因序列构建的种系发育树与所有的猬迭宫绦虫均构成同一亚群,总分支的自展值高于50%,二者在不同的分离株之间呈现基因多态性。对8株裂头蚴ITS1和cox1序列的同源性进行比较,ITS1的同源性为70.27%~82.84%,而cox1的同源性为95.63%~99.50%,显示cox1的同源性高于ITS1。已向GenBank提交ITS1和cox1新序列各一条,登录号分别为KF990161和KJ418421。结论 贵州安顺地区不同蛇源裂头蚴分离株之间存在基因多态性。从总分支的自展值来看,cox1比ITS1更适合用于种内遗传多态性研究,ITS1适合做定种的分子标记。