细胞内氯通道4基因siRNA表达载体的构建及其沉默效应

目的构建针对细胞内氯通道4（CLICA）的短链干涉RNA（siRNA）及其表达载体,转染细胞后观察其对CLIC4基因的干涉作用。方法设计CLICA靶向的发夹状siRNA,据此设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接到pSilencer3．1-H1载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体转染法转染大鼠神经胶质瘤细胞C6,通过RT-PCR检测CLICA基因表达水平的变化。结果酶切鉴定与DNA测序分析证明CLICA基因的siRNA载体构建正确,RT-PCR结果表明CLICA基因的表达水平明显降低。结论成功地构建了针对CLICA基因的siRNA载体,转染细胞后可显著抑制CLICA基因表达。     

pcDNA3.1-flag-pygo2真核表达载体的构建及在C6细胞中的表达

目的构建pcDNA3．1-flag-pygo2真核表达载体并在C6细胞中进行表达。方法从小鼠脑胶质细胞中提取总RNA，RT-PCR法反转录合成CDNA，设计引物，调取目的片段，与pcDNA3．1-flag载体连接后转化大肠杆菌DH5α，LB平板筛选菌落，提取质粒。重组质粒pcDNA3．1-flag-pygo2经过酶切鉴定及测序后，阳离子脂质体法转染C6细胞并经免疫细胞化学染色及蛋白印迹检测重组体的表达。结果重构质粒pcDNA3．1-flag-pygo2经限制性核酸内切酶EcoRⅠ，HindⅢ酶切分析及测序检查，表明真核表达载体构建正确；瞬时转染C6细胞后，免疫细胞荧光染色及蛋白印迹检测表明转染细胞能够表达外源Pygo2基因。结论成功构建了pcDNA3．1-flag-pygo2真核表达载体并能够在真核细胞中进行表达，这为今后研究pygo2基因在胶质瘤中的作用机制奠定了基础。     

大鼠miR-1慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定大鼠miR-1慢病毒过表达系统。方法采用EcoRⅠ酶双酶切将目的基因从合成载体上酶切后连接入EcoRⅠ线性化慢病毒载体,连接产物转化后进行阳性克隆鉴定。成功构建的miR-1重组质粒与慢病毒辅助包装质粒及Lipofectamine 2000共转染293T细胞,产生慢病毒浓缩液并标定病毒滴度。重组慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,观察转染效率及miR-1表达水平。结果测序结果显示目的基因与Genebank序列完全一致;孔稀释法检测病毒滴度为3×108 TU/μL;以感染复数（MOI）50感染大鼠MSCs,感染效率达90%以上,聚合酶链反应显示miR-1高水平表达。结论成功构建大鼠miR-1慢病毒表达载体并可高效转染大鼠MSCs,为进一步研究miR-1基因的相关功能提供了合适的载体。     

靶向survivin的siRNA表达载体的构建及生物活性鉴定

目的 构建靶向survivin的siRNA表达载体。方法 设计合成靶向Survivin的siRNA相应DNA模板单链,将其克隆入空质粒pRNAT-U6．1／Neo,模板链两端分别设计两个不同的酶切位点,退火形成siRNA载体插入片段。用限制性酶切将空载体线性化,T4DNA连接酶将siRNA片段插入空载体中,对该重组表达载体进行鉴定,获得RNA干扰质粒载体pRNAT-U6．1／Neo-sur-vivin。脂质体法将pRNAT-U6．1／Neo-survivin导入膀胱癌T24细胞株,实时定量PCR法检测对T24细胞survivin基因表达的抑制情况。结果 PCR、酶切鉴定、DNA测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变。重组载体能干扰T24细胞survivin基因的表达,并具有新霉素抗性。能够用G-418筛选稳定转化的细胞株。结论 成功构建了靶向survivin基因表达的RNA干扰质粒载体pR-NAT-U6．1／Neo-survivin。并转染膀胱癌细胞株,为进一步运用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。     

人乳头瘤病毒18型E6蛋白真核表达载体的构建及其在子宫颈癌细胞株Hela细胞中的表达

目的构建并鉴定p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6真核表达载体,并转染Hela细胞后,检测其在Hela细胞中的表达。方法用RT-PCR法从Hela细胞中扩增出带HindⅢ、SalⅠ酶切位点的HPV18E6基因片段,将HPV18E6基因片段连接到pMD-18T载体上,通过限制性内切酶HindⅢ、SalⅠ酶切,T4连接酶连接到含有上述酶切位点的p3×flag-myc-CMV-24真核表达载体上,通过脂质体将p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6转染入Hela细胞48h后,Western-blot检测HPV18E6及3×flag表达情况。结果p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6真核表达载体构建成功,构建的真核表达载体可以被限制性内切酶HindⅢ、SalⅠ切开,电泳可显示相应条带,经测序其序列与设计的一致,转染到Hela细胞48h后经Western-blot检测可见HPV18E6的高表达及flag的表达。结论p3×flag-myc-CMV-24HPV18E6真核表达载体的成功构建为进一步研究HPV18E6的致癌机制奠定了基础。     

ASPP1对胃癌细胞SGC-7901增殖抑制

目的本研究扩增及鉴定包含人类ASPP1基因转录本蛋白编码区的cDNA片段,将此片段克隆入真核表达载体,转染胃癌细胞,观察其对胃癌细胞增殖力的影响。方法从胎盘组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增ASPP1基因全长编码序列CDS(full-length coding sequence),目的片段回收纯化后用限制性内切酶XbaⅠ,EcoR I酶切的方法鉴定目的片段正确与否并检测其纯度、浓度;并转染胃癌SGC-7901细胞,观察ASPP1蛋白的表达及用MTT法进行细胞增殖力检测。结果该扩增片段经限制性核酸内切酶切图谱分析,与预期结果吻合,p53表达增加,转染的胃癌SGC-7901细胞出现增殖受抑。结论人类ASPP1基因对胃癌细胞增殖有抑制作用,从而为临床上胃癌的基因治疗提供了新思路。     

表达E2F1小干扰RNA的逆转录病毒载体的构建

目的:建立一个表达E2F1小干扰RNA的靶向抑制E2F1表达的重组逆转录病毒载体.方法:通过重组DNA技术,将设计好的两条互补寡核苷酸片段退火后与载体连接,利用载体上的BglⅡ和 EcoRⅠ位点进行双酶切初步鉴定,重组载体应产生332bp和6182bp两个片段,选择酶切正确的重组载体进行测序,保证siRNA的方向和序列正确.结果:表达siRNA的重组逆转录病毒载体构建成功.结论:重组逆转录病毒载体的成功构建为下一步基因治疗的研究奠定了基础.     

hVPS4A 基因克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆人细胞空泡蛋白分选因子4A（human vacuolar protein sorting 4A,hVPS4A）基因,构建其真核表达质粒。方法以 Huh7细胞 cDNA 为模板,设计引物扩增全长 hVPS4A 基因,再将目的基因插入到真核载体 pRK5中。重组质粒经PCR、酶切和 DNA 测序确认。结果从 Huh7细胞 cDNA 中扩增得到约1350 bp 大小的目的片段,经回收、纯化、酶切后与载体pRK5连接,转化 DH5α大肠杆菌。选择 PCR 鉴定阳性的重组质粒,经 EcoRⅠ单酶切可见约一条5900 bp 片段;经 EcoRⅠ和HindⅢ双酶切可得到4600 bp 和1350 bp 两个片段,分别与载体 pRK5和目的片段 hVPS4A 预期大小一致;DNA 测序结果显示插入片段与 hVPS4A 参考序列一致。结论成功构建了含 hVPS4A 基因的真核表达载体,为进一步研究 hVPS4A 的生物学功能提供了条件。     

Stathmin特异性siRNA表达质粒抑制stathmin的表达

目的:构建微管解聚蛋白stathmin基因的特异性siRNA质粒表达载体,以便研究stathmin在鼻咽癌中的生物学作用。方法:合成stathmin特异性DNA片段,退火形成的双链DNA片段克隆于质粒表达载体pGenesil-1.3;载体经扩增后,进行酶切和测序鉴定;采用QIAGEN公司脂质体(effectenetransfectionreagent)将鉴定后的重组质粒转入鼻咽癌CNE2细胞;RT-PCR与Westernblot检测stathmin基因表达。结果:酶切和测序分析表明,插入siRNA质粒表达载体中的DNA片段,其碱基序列和插入方向正确。表达分析证实特异性siRNA质粒表达载体能有效抑制鼻咽癌CNE2细胞中stathmin的表达。结论:构建的siRNA质粒表达载体对stathmin的表达有很好的抑制作用。     

小鼠Atrogin-1基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的：构建小鼠Atrogin-1基因真核表达载体,研究其功能,并探讨其在癌性恶液质骨骼肌萎缩中的作用机制。方法：提取小鼠C2C12细胞RNA,反转成cDNA,PCR合成含有酶切位点的Atrogin-1 cDNA全长,酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,经鉴定及测序证实cDNA片段大小和序列正确,然后用其转染293T细胞,Western blot法检测Atrogin-1蛋白的表达。结果：pcDNA3.1-Atrogin-1含大小、序列正确的Atrogin-1cDNA片段,转染pcDNA3.1-Atrogin-1的293T细胞裂解液中能检测到Atrogin-1蛋白高表达。结论：成功构建了Atrogin-1基因真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,并在真核细胞中表达了目的蛋白,其是研究癌性恶液质的重要工具。     

靶向转化生长因子β1的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建靶向转化生长因子β1（TGFβ1）小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体.[方法]设计二个siRNA作用靶点,体外合成的相应双链DNA被插入pSilencer-2.1质粒中,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序.采用脂质体转入HSC-T6细胞中,利用RT-PCR法和western-blot分别检测TGFβ1 mRNA和蛋白的表达.[结果]靶向TGFβ1 的siRNA-a和siRNA-b二个表达质粒是成功构建; 与无关对照组相比,siRNA-b组对TGFβ1mRNA和蛋白表达均明显下调（ P 〈0.01）,siRNA-a组无明显下调（ P 〉0.05）.[结论]成功构建了靶向TGFβ1 基因的siRNA表达质粒,为进一步研究其阻断肝纤维化打下基础.     

抑制骨髓基质干细胞雌激素受体β基因表达的有效序列

背景:雌激素受体β是否参与介导骨髓间充质干细胞的增殖与分化需进一步实验论证。目的:以RNAi技术寻找和验证对大鼠骨髓基质干细胞雌激素受体β基因表达抑制的有效序列。方法:根据GeneBank数据库提供的SD大鼠雌激素受体β基因核苷酸序列,选择设计能转录小发卡结构RNA(Small hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列。再在两条互补碱基序列的5’端分别加上BamHⅠ(GATCC)和HindⅢ(AGCTT)酶的酶切位点,最后形成两条互补的克隆入pSilencer3.1-H1载体的发夹状siRNA模板序列,进行重组载体的碱基序列测定。结果与结论:重组质粒碱基序列鉴定后,证实真核表达载构建正确。雌激素受体β特异性siRNA真核表达载体构建成功。     

SARS病毒S蛋白编码基因表达载体的构建及在Vero细胞中的表达

目的构建含SARS病毒S蛋白编码基因片段的表达载体,并将其置于Vero细胞中表达。方法设计1对PCR引物,在其下游引入Flag序列,通过PCR方法从质粒pGEX-6P-1-SARS-S中扩增出S蛋白编码基因,PCR产物经酶切后,插入表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-SARS-S。重组质粒经酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析后转染Vero细胞,用抗Flag单克隆抗体通过Western blot检测S蛋白片段在Vero细胞中的表达。结果酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析示重组质粒构建完全正确;Western blot证实重组S蛋白片段能够在Vero细胞表达。结论融合Flag序列的SARS病毒S蛋白片段在Vero细胞中获得了正确表达。     

靶向wnt-1基因的RNA干涉质粒构建及抑制U251细胞增殖的实验研究

目的构建靶向wnt-1基因的RNA干涉表达载体,转染人胶质瘤细胞U251中,研究该质粒的抑瘤效果。方法根据siRNA设计原则,通过软件设计,选取含有21个核苷酸(21nt)靶序列,形成siRNA的DNA模板并克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中,获得靶向抑制wnt-1基因表达的siRNA表达载体,并经酶切测序鉴定。用该干涉质粒转染U251细胞,通过逆转录PCR、Western blotting方法检测wnt-1基因mRNA和蛋白表达水平,用MTT法、流式细胞术初步评价对U251细胞的增生、细胞周期影响。结果成功构建针对靶向wnt-1基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-wnt-1 RNA干涉质粒,可显著抑制U251细胞wnt-1基因的mRNA和蛋白表达。MTT法分析转染细胞增生明显抑制,流式细胞仪分析细胞周期证实转染后比空白对照组受到阻滞。结论靶向wnt-1基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-wnt-1 RNA干涉质粒构建成功,并可特异性的沉默wnt-1基因蛋白表达,使细胞增长减慢,细胞周期阻滞,本实验通过wnt-1的RNA干涉,为由wnt-1介导的wnt信号通路在胶质瘤发病机制中的抑瘤作用提供了依据,并为进一步该基因的基因治疗临床实验提供了可靠基础。     

小鼠SRY同源盒基因SOX1的克隆及其真核表达载体pEGFP-C3-SOX1的构建

目的:克隆小鼠SRY同源盒基因SOX1的全长cDNA,构建其携带增强型荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-C3-SOX1,为进一步研究SOX1在间充质干细胞神经分化中的作用奠定基础。方法:采用RT-PCR方法从小鼠早期胚胎中扩增带有EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点的SOX1 cDNA片断,与pGEM-T载体连接后转化感受态细菌JM109,然后通过蓝白筛选、酶切技术筛选、鉴定出阳性菌落并进行DNA测序。用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切获得目的片断,再与EcoRⅠ和HindⅢ双酶切过的pEGFP-C3质粒相连接,重组子转化JM109感受态大肠杆菌,酶切方法鉴定阳性菌落。结果:多酶切及DNA测序结果表明提取及纯化的pEGFP-C3-SOX1质粒含有SOX1 cDNA碱基片段,方向及大小正确。结论:从小鼠胚胎中可成功克隆SOX1全长cDNA,并构建其真核表达载体pEGFP-C3-SOX1。     

mTOR特异性siRNA重组表达载体的构建及鉴定

目的构建mTORsiRNA重组表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制巨噬细胞mTOR基因的相关研究奠定基础．方法设计具有短发夹结构的DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6／GFP／Neo中构建重组表达载体,转化DH5c~菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定。再转染人巨噬细胞RAW264．7,进行荧光摄像和阳性克隆筛选。Westernblot方法检测巨噬细胞mTOR蛋白表达。结果DNA测序结果及PCR鉴定证实成功构建小鼠mTORsiRNA重组表达载体。Westernblot结果显示转染该重组载体的巨噬细胞mTOR蛋白表达下降约4l％。结论mTOR靶向RNA干扰重组表达载体构建成功,可以进行稳定筛选,该载体对巨噬细胞mTOR蛋白表达有抑制作用。     

Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体构建

目的构建Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体,为体外扩增造血干细胞并保持其干细胞特性提供实验材料基础。方法应用PCR技术从质粒TAT-HA-HOXB4-Full中扩增编码人HOXB4的cDNA,用限制性内切酶EcoRI分别酶切HOXB4基因片段和带有Tet-on开关的可调控慢病毒载体,经T4DNA连接酶连接获得慢病毒载体Teto-Fuw-hHOXB4。对构建的HOXB4慢病毒载体进行酶切片段凝胶电泳及DNA测序分析。结果酶切片段电泳分析和DNA测序分析证明Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体构建成功。结论正确构建了Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体,为后续的体外扩增造血干细胞及相关研究提供材料。